一種紅掌細胞核懸液制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅掌細胞核懸液制備方法。步驟如下：1）取紅掌嫩葉50mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入1ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成：21g/L一水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-40）使用刀片在提取液中切碎紅掌嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得紅掌細胞核懸液。本發(fā)明的有益效果：1）最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；2）提取液成分簡單，只有三種，均為常規(guī)實驗室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；3）步驟簡單，無需離心，節(jié)省了時間提高了效率，可以在短時間內獲得高質量的細胞核懸液用于流式細胞儀檢測。
【專利說明】一種紅掌細胞核懸液制備方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于流式細胞儀分析的紅掌細胞核懸液制備方法。
【背景技術】
[0002]^lMXAnthurium aflt/raea/w?),其花朵獨特,有佛焰花序,色澤鮮艷華麗,色彩豐富，葉形苞片，常見的苞片顏色有紅色、粉紅、白色等，有極大的觀賞價值，是世界著名花卉。普遍認為目前紅掌栽培品種的遺傳背景狹窄，新品種培育也因此受到限制。隨著研究深入，使用流式細胞儀進行花藥培養(yǎng)植株倍性鑒定、基因組大小測定以及細胞周期等應用和基礎研究對拓寬紅掌育種基礎具有重要意義。而其中獲得適用于流式細胞儀分析的紅掌細胞核懸液成為其中關鍵技術。
[0003]紅掌葉片含有較多次生代謝物質，采用已報道的方法難以獲得適用于流式細胞儀分析的紅掌細胞核懸液，或相關方法繁瑣、含有對人體有害的試劑，這些都阻礙了相關研究的進行。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種紅掌細胞核懸液制備方法，該方法高效、快捷、經(jīng)濟。
[0005]本發(fā)明采用的技術方案是:
一種紅掌細胞核懸液制備方法，步驟如下:
1)取紅掌嫩葉50mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成:21g/L —水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-40 ；
2)使用刀片在提取液中切碎紅掌嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得紅掌細胞核懸液。
[0006]在步驟2)所述的紅掌細胞核懸液中加入DNA突光染料碘化丙錠(propidiumiodide，終濃度為50 μ g/ ml)，及Rnase (終濃度為50 μ g/ ml)，染色后的提取液用于流式細胞儀的檢測。
[0007]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在于:
1)最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；
2)提取液成分簡單，只有兩種，均為常規(guī)實驗室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；
3)步驟簡單，無需離心，節(jié)省了時間提高了效率，可以在短時間內獲得細胞核懸液用于流式細胞儀檢測；
4)可獲得較高質量細胞核懸液用于流式細胞儀檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1采用本發(fā)明制備的紅掌細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖；
圖2采用LBOl法制備的紅掌細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖。【具體實施方式】
[0009]下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于此: 實施例1
一、試劑的配置
O細胞核提取液配置:稱取2.1g—水檸檬酸、Ig聚乙烯吡咯烷酮K-40于一干凈的250ml燒杯中，加超純水定容到IOOml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?br> [0010]2)突光染料配置:稱取25mg碘化丙錠、25mg核糖核酸酶于一干凈的250ml燒杯中加超純水定容到50ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?br> [0011]二、紅掌細胞核懸液提取方法
(I)取紅掌嫩葉(約50 mg)，置于塑料培養(yǎng)皿中加入I ml提取液。(2)使用鋒利剃須刀片在提取液中切碎葉片；(3)收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得紅掌細胞核懸液；(4)過濾后的提取液中加入DNA熒光染料碘化丙錠(終濃度為50 μ g/ ml)及Rnase (終濃度為50 yg/ ml)。染色后的提取液上流式細胞儀檢測。
[0012]紅掌細胞核懸液的流式細胞儀檢測
采用Quanta SC流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司),在488 nm激光的激發(fā)下發(fā)出桔紅色熒光，由FL2通道檢測出熒光強度。從隨機軟件CellLab Quanta SC獲取數(shù)據(jù)，并通過ModFit LT軟件顯示直方圖(橫坐標以DNA相對含量反映突光曲線的面積縱坐標為細胞核次數(shù))，結果見圖1。本發(fā)明制備的紅掌細胞核懸液不僅適用Quanta SC流式細胞儀，也適用于FACSCalibur (美國Becton-Dickinson公司)等目前市場是所有具有488nm激光器的流式細胞儀。
[0013]對比例1:采用已報道的 LBOl 法(Dolezel J, Binarova P, Lucretti S.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.BiologiaPlantarum 1989，31: 113 - 120)提取紅掌細胞核懸液經(jīng)流式細胞儀檢測的直方圖，結果見圖2。無明顯熒光峰，碎片較多，無法用于相關研究。
【權利要求】
1.一種紅掌細胞核懸液制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)取紅掌嫩葉50mg，置于培養(yǎng)皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成:21g/L —水檸檬酸，100g/L聚乙烯吡咯烷酮K-40 ； 2)使用刀片在提取液中切碎紅掌嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾，獲得紅掌細胞核懸液。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)所述的紅掌細胞核懸液中加入DNA突光染料碘化丙錠(propidium iodide ,終濃度為50 μ g/ ml),及Rnase (終濃度為50 μ g/ ml),染色后的提取液用于流式細胞儀的檢測。
【文檔編號】G01N1/28GK103940646SQ201410115783
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權日:2014年3月26日
【發(fā)明者】金亮, 田丹青, 李小白, 葛亞英, 劉建新, 沈福泉, 王煒勇 申請人:浙江省農業(yè)科學院花卉研究開發(fā)中心