一種稀土納米材料溶解增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種稀土納米材料標(biāo)記生物分子、其標(biāo)記方法及稀土納米材料溶解增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，采用稀土納米材料作為標(biāo)記物，其性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積大，可修飾性強(qiáng)，成本低廉，且每個(gè)納米晶含有數(shù)千個(gè)鑭系離子，極大地提高了稀土離子的標(biāo)記比率，受外源稀土離子的影響小，且不受抗凝劑的影響，適用性廣；在稀土納米材料作為標(biāo)記物的免疫復(fù)合物形成后，加入增強(qiáng)液，使稀土納米材料溶解成稀土離子，并與增強(qiáng)液中的螯合物形成新的信號(hào)分子，產(chǎn)生分子內(nèi)和分子間能量傳遞，熒光增強(qiáng)近百萬(wàn)倍，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)，極大提高了檢測(cè)靈敏度。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種稀土納米材料溶解增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可用于標(biāo)記生物分子的稀土納米材料、其標(biāo)記方法及其介導(dǎo)的熒光免疫分析方法，具體地說(shuō)，涉及一種可用于標(biāo)記生物分子的稀土納米材料、其標(biāo)記方法及通過(guò)稀土納米材料溶解增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨熒光免疫分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]放射免疫分析法(RIA)這一分析技術(shù)由于存在放射污染、半衰期短、有效期短等缺陷而即將被淘汰。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)的靈敏度及重復(fù)性均不及放射免疫分析法，其酶活性和顯色底物的穩(wěn)定性有待提高。化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)因發(fā)光時(shí)間短而不能重復(fù)檢測(cè)，易受環(huán)境物質(zhì)干擾，且試劑價(jià)格昂貴，無(wú)法廣泛使用。
[0003]相比之下，時(shí)間分辨免疫分析(TRFIA)的靈敏度高，本底低，穩(wěn)定性好，線(xiàn)性范圍寬，是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，近年來(lái)開(kāi)發(fā)出的分析系統(tǒng)如下:
[0004]解離增強(qiáng)鑭系時(shí)間分辨免疫分析法(DELFIA)——應(yīng)用最廣，由示蹤劑、雙功能螯合劑和增強(qiáng)劑組成。熒光增強(qiáng)是其具有極高靈敏度的重要因素之一。鑭系離子通過(guò)與增強(qiáng)液形成微囊，可有效防止水分子淬滅，從而極大增強(qiáng)體系熒光。此外，雙功能螯合劑也是關(guān)鍵因素之一，銪離子作為首選標(biāo)記物與蛋白質(zhì)的標(biāo)記比率在10到20之間。但雙功能螯合物作為標(biāo)記物易受外界物質(zhì)如:外源性稀土離子，以及乙二胺四乙酸、肝素等抗凝劑的干擾，檢測(cè)的標(biāo)本必須為血清，操作要求十分嚴(yán)格，且價(jià)格不菲。
[0005]固相時(shí)間分辨免疫分析(FIAgen)——以雙功能稀土螯合物作為標(biāo)記物進(jìn)行時(shí)間分辨免疫分析。其優(yōu)點(diǎn)是不需要加入增強(qiáng)液就可直接檢測(cè)熒光，但檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)不及DELFIA。
[0006]此外，包覆有稀土螯合物的熒光納米顆粒也被應(yīng)用于時(shí)間分辨免疫分析中，每個(gè)納米顆粒中含有數(shù)千個(gè)稀土螯合物，極大地提高了檢測(cè)靈敏度，但存在稀土螯合物易泄漏、易受光漂白等不穩(wěn)定因素影響。
[0007]應(yīng)該說(shuō)，稀土納米材料具有性質(zhì)穩(wěn)定，比表面積大，可修飾性強(qiáng)，合成成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是目前普遍看好的新一代熒光生物標(biāo)記材料。但稀土納米材料的發(fā)光是通過(guò)稀土離子4f組態(tài)電子間躍遷吸收敏化發(fā)光，摩爾消光系數(shù)小，發(fā)光弱。以稀土納米材料作為標(biāo)記物的直接檢測(cè)，靈敏度較低而限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于時(shí)間分辨熒光免疫分析、高靈敏度的稀土納米材料標(biāo)記生物分子方法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種通過(guò)稀土納米材料溶解增強(qiáng)的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法。
[0010]本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:[0011]一種用于時(shí)間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，所述生物分子包括生物素、親和素、抗體或核酸適配體；所述稀土納米材料含有銪、釤、鋱、鏑中的一種或多種。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)化學(xué)配位法或物理吸附法標(biāo)記所述生物分子。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，所述稀土納米材料選自稀土氟化物、氧化物、氟氧化物、氯氧化物、稀土磷酸鹽、硼酸鹽、硅酸鹽、鑰酸鹽、鎢酸鹽、碳酸鹽納米晶。
[0014]優(yōu)選所述稀土納米材料為XYF4納米晶，所述X選自鋰、鈉、鉀等中的一種或多種，所述Y選自銪、釤、鋱、鏑中的一種或多種。
[0015]本發(fā)明還提供如下技術(shù)方案:
[0016]一種用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子的標(biāo)記方法，所述稀土納米材料通過(guò)化學(xué)配位法或物理吸附法標(biāo)記生物分子，所述生物分子包括生物素、親和素、抗體或核酸適配體。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述稀土納米材料含有銪、釤、鋱、鏑中的一種或多種。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，所述稀土納米材料優(yōu)選為XYF4納米晶，所述X選自鋰、鈉、鉀等中的一種或多種，所述Y選自銪、釤、鋱、鏑中的一種或多種。
[0019]本發(fā)明還提供如下技術(shù)方案:
[0020]一種稀土納米材料通過(guò)溶解增強(qiáng)的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于，所述方法采用了上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括:加入上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，形成免疫復(fù)合物后，加入增強(qiáng)液，使稀土納米材料溶解并以稀土離子形式存在，與增強(qiáng)液中的螯合物形成具有強(qiáng)熒光信號(hào)的分子(稀土納米膠束)，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，所述方法的具體步驟如下:
[0023]I)將捕獲抗體或抗原以物理吸附或共價(jià)偶聯(lián)的方式固定在微孔板上；
[0024]2)封閉液封閉；
[0025]3)加入含有待測(cè)抗原或待測(cè)抗體的樣品；
[0026]4)加入上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，形成免疫復(fù)合物；
[0027]5)加入增強(qiáng)液，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)加入待測(cè)抗原時(shí)，所述生物分子選自生物素、親和素、抗體或核酸適配體。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)加入待測(cè)抗體時(shí)，所述生物分子選自生物素、親和素或核酸適配體。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，所述的步驟4)可以是:
[0031]加入上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記抗體，形成免疫復(fù)合物。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，所述的步驟4)還可以分解為以下步驟:
[0033](a)加入生物素標(biāo)記的抗體；
[0034](b)加入上述的用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記親和素，形成免疫復(fù)合物。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，所述的步驟4)還可以分解為以下步驟:
[0036](a’ )加入生物素標(biāo)記的抗體；
[0037](b，)加入親和素；
[0038](c’)加入上述的用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物素，形成免疫復(fù)合物。
[0039]根據(jù)本發(fā)明，所述的稀土納米材料含有銪、釤、鋱、鏑中的一種或多種。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，所述稀土納米材料優(yōu)選為XYF4納米晶，所述X選自鋰、鈉、鉀等中的一種或多種，所述Y選自銪、釤、鋱、鏑四種元素中的一種或多種。
[0041]根據(jù)本發(fā)明，所述的稀土納米材料與生物素、親和素或抗體的標(biāo)記方法為:化學(xué)配位或物理吸附。
[0042]根據(jù)本發(fā)明，所述封閉液為本領(lǐng)域的常規(guī)溶液，可以通過(guò)商購(gòu)或自行合成。所述封閉液可以為牛血清蛋白(BSA)封閉液或乙醇胺封閉液。
[0043]根據(jù)本發(fā)明，所述的增強(qiáng)液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的增強(qiáng)液，但優(yōu)選主要由緩沖液、β - 二酮體，非離子表面活性劑和協(xié)同劑組成。
[0044]根據(jù)本發(fā)明，所述緩沖液選自Triton X-100 ;所述β - 二酮體選自萘甲酸三氟丙酮，所述非離子表面活性劑選自三正辛基氧膦，所述協(xié)同劑選自水。
[0045]根據(jù)本發(fā)明，所述增強(qiáng)液主要由Triton X-100、萘甲酸三氟丙酮、三正辛基氧膦和蒸餾水組成。
[0046]根據(jù)本發(fā)明，其檢測(cè)模式包括夾心法檢測(cè)、直接法檢測(cè)或競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。
[0047]本發(fā)明中，所述NaEuF4納米晶可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，可通過(guò)如下方法制備:
[0048]I)稱(chēng)取Eu(Ac)3，加入到油酸和十八烯的混合溶劑中，在氮?dú)夥罩?60°C攪拌溶解，為A液；
[0049]2)稱(chēng)取NH4F和NaOH，加入甲醇溶解，為B液；
[0050]3) A液降至室溫后，用滴管將B液緩慢滴加入A液中，排凈空氣，在氮?dú)夥罩猩郎刂?0°C，攪拌，除去甲醇；
[0051]4)升溫至120°C，攪拌反應(yīng)，除去殘留水分；
[0052]5)升溫至300°C，攪拌反應(yīng)；
[0053]6)冷卻至室溫后，加入無(wú)水乙醇，析出納米晶；
[0054]7)任選地，離心，用無(wú)水乙醇洗滌；優(yōu)選地，洗滌三次。
[0055]其他NaYF4納米晶的制備方法可以參考上述方法進(jìn)行。
[0056]根據(jù)本發(fā)明，可以用化學(xué)配位法標(biāo)記所述生物分子，所述化學(xué)配位法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以NaEuF4納米晶化學(xué)配位法標(biāo)記生物素為例，方法如下:
[0057]I)稱(chēng)取油溶性NaEuF4納米晶溶于鹽酸乙醇溶液中，超聲，離心收集納米顆粒，再用無(wú)水乙醇洗滌，除去納米晶表面的油酸，加入去離子水溶解，得水溶性納米晶；
[0058]2)取步驟I)合成的水溶性納米晶，加入生物素和氨水，超聲，用去離子水離心洗滌，最后溶于去離子水中即可。
[0059]根據(jù)本發(fā)明，可以用物理吸附法標(biāo)記所述生物分子，所述物理吸附法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以NaEuF4納米晶物理吸附法標(biāo)記抗體為例，方法如下:
[0060]I)稱(chēng)取油溶性NaEuF4納米晶溶于鹽酸乙醇溶液中，超聲，離心收集納米顆粒，再用無(wú)水乙醇洗滌，除去納米晶表面的油酸，加入去離子水溶解，得水溶性納米晶；
[0061]2)取步驟I)合成的水溶性納米晶，加入抗體，加入磷酸鹽緩沖液，室溫震蕩，離心收集納米顆粒，水洗滌，溶于緩沖液中即可。
[0062]本發(fā)明的有益效果在于:
[0063]I)采用稀土納米材料作為標(biāo)記物標(biāo)記生物分子，由于所述稀土納米材料的性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積大、可修飾性強(qiáng)、成本低廉且每個(gè)納米顆粒含有數(shù)千個(gè)稀土離子，極大提高了稀土離子的標(biāo)記比率，受外源稀土離子的影響小，且不受抗凝劑的影響，適用性更廣。
[0064]2)在含有稀土納米材料標(biāo)記生物分子形成免疫復(fù)合物后，加入增強(qiáng)液，使稀土納米材料溶解成稀土離子，并與增強(qiáng)液中的螯合物形成新的信號(hào)分子，產(chǎn)生分子內(nèi)和分子間能量傳遞，熒光增強(qiáng)近百萬(wàn)倍，極大地提高了檢測(cè)靈敏度，
[0065]具體地，本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度比市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒高900倍。
[0066]3)如圖1的對(duì)比所示，通過(guò)本發(fā)明的方法，由于單個(gè)稀土納米顆粒含有數(shù)千個(gè)稀土離子，極大地提高了稀土離子的標(biāo)記比率，從而顯著增強(qiáng)熒光信號(hào)與檢測(cè)靈敏度。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0067]圖1:(a)傳統(tǒng)的解離增強(qiáng)鑭系時(shí)間分辨免疫分析法(DELFIA)與(b)本發(fā)明稀土納米材料溶解增強(qiáng)熒光免疫分析法生物檢測(cè)(DELBA)原理示意圖。
[0068]其中顯示，采用雙抗夾心法用(a)稀土螯合物或(b)稀土納米材料對(duì)待測(cè)抗原或待測(cè)抗體進(jìn)行標(biāo)記，待形成免疫復(fù)合物后加入增強(qiáng)液，利用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)。
[0069]由圖1可見(jiàn)，單個(gè)稀土納米顆粒含有數(shù)千個(gè)稀土離子，極大地提高了稀土離子的標(biāo)記比率，加入增強(qiáng)液后形成大量強(qiáng)熒光信號(hào)分子，從而顯著增強(qiáng)熒光信號(hào)與檢測(cè)靈敏度。
[0070]圖2 =NaEuF4納米晶透射電鏡圖，儀器型號(hào)為JEM-2010，廠(chǎng)家為JE0L。
[0071]圖3 =NaEuF4納米晶粉末衍射圖，儀器型號(hào)為MiniFlex2，廠(chǎng)家為Rigaku，銅靶輻射波長(zhǎng)為 λ =0.154187nm。
[0072]圖4:本發(fā)明雙抗夾心法檢測(cè)癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0073]圖5:市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0074]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于以下實(shí)施例。根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案所給出的技術(shù)特征和范圍的情況下，對(duì)以上所述實(shí)施例做出許多變化和修改都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0075]實(shí)施例
[0076]實(shí)施例1:
[0077]一種稀土納米材料溶解增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，具體步驟如下:
[0078]1.合成NaEuF4納米晶
[0079]I)稱(chēng)取Immol Eu(Ac)3,加入到6ml油酸和15ml十八烯混合溶劑中,排凈空氣,在氮?dú)夥罩?60°C攪拌30min溶解，為A液；
[0080]2)稱(chēng)取 150mg NH4F+1OOmg NaOH,加入 IOml 甲醇溶解，為 B 液；
[0081]3) A液降至室溫后，用滴管將B液緩慢滴加入A液中，排凈空氣，在氮?dú)夥罩猩郎刂?0°C,攪拌30min,除去甲醇；
[0082]4)升溫至120°C，攪拌反應(yīng)lOmin，除去殘留水分；
[0083]5)升溫至300°C，攪拌反應(yīng)0.5h ；
[0084]6)冷卻至室溫后，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，析出納米晶；
[0085]7)離心，用無(wú)水乙醇洗滌納米晶三次，備用。
[0086]圖2和圖3分別給出了合成的NaEuF4納米晶的透射電鏡圖和粉末衍射圖。
[0087]2.NaEuF4納米晶標(biāo)記生物素或抗體
[0088]A、NaEuF4納米晶化學(xué)配位法標(biāo)記生物素
[0089]I)稱(chēng)取步驟I合成的NaEuF4納米晶20mg溶于15ml,pHl.0的鹽酸乙醇溶液中，超聲30min，離心收集納米顆粒，再用無(wú)水乙醇洗滌三次，除去納米晶表面的油酸，加入2ml去離子水溶解，為10mg/ml水溶性納米晶；
[0090]2)在步驟I)中加入Immol的生物素和2滴氨水，超聲20min，用去離子水離心洗漆三次，最后溶于Iml去離子水中備用。
[0091]B、NaEuF4納米晶物理吸附法標(biāo)記抗體:取步驟A_l)合成的水溶性納米晶Iml,加入IOOug抗體,加入100 μ 1，ρΗ8.0磷酸鹽緩沖液，室溫震蕩lh，離心收集納米顆粒，水洗滌三次，溶于pH8.0的緩沖液中備用。
[0092]3.配制增強(qiáng)液
[0093]稱(chēng)取Ig Triton X-100,26.6mg萘甲酰三氟丙酮，193mg三正辛基氧膦,加入蒸懼水定容至1L，用稀HCl調(diào)節(jié)ρΗ2.0，備用。
[0094]4.NaEuF4納米晶雙抗夾心法檢測(cè)癌胚抗原
[0095]I)包被:用0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液將癌胚抗原的抗體稀釋至10ug/ml，在96孔聚苯乙烯板中，每孔加入ΙΟΟμ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0096]2)封閉:用0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液配制2%的牛血清白蛋白，每孔加入300ul，37°C孵育I小時(shí)，去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0097]3)加樣:用PBS緩沖液配制0.00256-1000ng/ml的癌胚抗原系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為:0ng/ml、0.00256ng/ml、0.064ng/ml、0.0128ng/ml、0.32ng/ml、l.6ng/ml、8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0098]4)加NaEuF4納米晶標(biāo)記的抗體:用PBS緩沖液配制I μ g/ml的NaEuF4納米晶標(biāo)記的抗體，每孔加入100μ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗6次。
[0099]5)加增強(qiáng)液:每孔加入200μ I增強(qiáng)液，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)，具體參數(shù)為:激發(fā)波長(zhǎng)340nm,發(fā)射波長(zhǎng)615nm,延遲時(shí)間250 μ S。
[0100]6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4，在0.00256-8ng/ml范圍內(nèi)，癌胚抗原的濃度與熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性相關(guān)，y=480.87x+425,R=0.9987，以空白平均值加3倍SD計(jì)，最低檢測(cè)限為 0.lpg/mL.[0101]7)樣品的測(cè)定:在步驟3)加入ΙΟΟμ I待測(cè)樣品，其他步驟同上，將待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，求得相應(yīng)的濃度值。
[0102]8)所述的步驟4)還可以這樣實(shí)現(xiàn):
[0103](I)加生物素標(biāo)記的抗體:用PBS緩沖液配制I μ g/ml的生物素標(biāo)記的抗體，每孔加入ΙΟΟμ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次；
[0104](2)加親和素:用PBS緩沖液配制5 μ g/ml的親和素，每孔加入ΙΟΟμ 1，
[0105]37°C孵育0.5小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次；
[0106](3)加NaEuF4納米晶標(biāo)記的生物素:用PBS緩沖液配制10 μ g/ml的NaEuF4納米晶標(biāo)記的生物素，每孔加入100μ 1，37°C孵育0.5小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗6次。
[0107]實(shí)施例2:本發(fā)明與市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒比較
[0108]I)包被:用0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液將癌胚抗原的抗體稀釋至10ug/ml，在96孔聚苯乙烯板中，每孔加入100μ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0109]2)封閉:用0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液配制2%的牛血清白蛋白，每孔加入300ul，37°C孵育I小時(shí)，去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0110]3)加樣:用PBS緩沖液配制0.00256-1000ng/ml的癌胚抗原系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為:0ng/ml、0.00256ng/ml、0.064ng/ml、0.0128ng/ml、0.32ng/ml、l.6ng/ml、8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0111]4)加生物素標(biāo)記的抗體:用PBS緩沖液配制I μ g/ml的生物素標(biāo)記的抗體，每孔加入100μ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0112]5)加親和素:用PBS緩沖液配制5 μ g/ml的親和素，每孔加入100μ 1，37°C孵育
0.5小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0113]6)加NaEuF4納米晶標(biāo)記的生物素:用PBS緩沖液配制10 μ g/ml的NaEuF4納米晶標(biāo)記的生物素，每孔加入100μ 1，37°C孵育0.5小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗6次。
[0114]7)加增強(qiáng)液:每孔加入200ul增強(qiáng)液，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)，具體參數(shù)為:激發(fā)波長(zhǎng)340nm,發(fā)射波長(zhǎng)615nm,延遲時(shí)間250 μ S。
[0115]8)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4，在0.00256-8ng/ml范圍內(nèi)，癌胚抗原的濃度與熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性相關(guān)，y=480.87x+425, R=0.9987，以空白平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)，最低檢測(cè)限為0.lpg/mL.[0116]9)時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒測(cè)定癌胚抗原:按說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖5，在0.l-800ng/ml范圍內(nèi)，癌胚抗原的濃度與熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性相關(guān)，y=12.732x+223.98,R=0.9989，以空白平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)，最低檢測(cè)限為90pg/ml，本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度比市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒高900倍。
[0117]實(shí)施例3:
[0118]本發(fā)明與市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同標(biāo)本的回收率比較
[0119]I)包被:用0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液將癌胚抗原的抗體稀釋至10ug/ml，在96孔聚苯乙烯板中，每孔加入100μ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0120] 2)封閉:用0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液配制2%的牛血清白蛋白，每孔加入300ul，37°C孵育I小時(shí)，去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0121]3)加樣:用PBS緩沖液配制0.00256-1000ng/ml的癌胚抗原系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為:0ng/ml、0.00256ng/ml、0.064ng/ml、0.0128ng/ml、0.32ng/ml、l.6ng/ml、8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗3次。
[0122]4)加NaEuF4納米晶標(biāo)記的抗體:用PBS緩沖液配制I μ g/ml的生NaEuF4納米晶標(biāo)記的抗體，每孔加入100 μ 1，37°C孵育I小時(shí)，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液洗6次。
[0123]5)加增強(qiáng)液:每孔加入200ul增強(qiáng)液，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)，具體參數(shù)為:激發(fā)波長(zhǎng)340nm,發(fā)射波長(zhǎng)615nm,延遲時(shí)間250 μ S。
[0124]6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):以癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以每一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在0.00256-8ng/ml范圍內(nèi)，癌胚抗原的濃度與熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性相關(guān)，y=480.87x+425, R=0.9987。
[0125]7)本發(fā)明對(duì)血清和血漿基質(zhì)的回收率測(cè)定:將同一份血清和含有EDTA抗凝劑的血漿分別分成兩份，其中一份加入2ng/ml的癌胚抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，在步驟3)加入100 μ I待測(cè)標(biāo)本，其他步驟同上，每個(gè)標(biāo)本分別測(cè)定3次，將待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，求得相應(yīng)的濃度值。
[0126]8)市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)血清和血漿基質(zhì)的回收率測(cè)定:按說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在0.l-800ng/ml范圍內(nèi)，癌胚抗原的濃度與熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性相關(guān)，y=12.732x+223.98，R=0.9989，血清和血漿基質(zhì)的回收率測(cè)定同步驟7)。
[0127]9)結(jié)論:由表1可知,本發(fā)明和市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)血清基質(zhì)的回收率都在95%以上，而對(duì)含EDTA抗凝劑的血漿基質(zhì)，回收率分別為95.2%和85%，說(shuō)明以螯合物標(biāo)記的市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)含EDTA抗凝劑的標(biāo)本存在負(fù)干擾，而本發(fā)明無(wú)干擾，適用性更廣。
[0128]表1本發(fā)明與市售時(shí)間分辨癌胚抗原檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同標(biāo)本回收率的比較
[0129]
【權(quán)利要求】
1.一種用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，所述生物分子包括生物素、親和素、抗體或核酸適配體。 優(yōu)選地，所述稀土納米材料通過(guò)化學(xué)配位法或物理吸附法標(biāo)記所述生物分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，其特征在于，所述稀土納米材料含有銪、釤、鋱、鏑四種元素中的一種或多種；優(yōu)選地，所述稀土納米材料為XYF4納米晶，所述X選自鋰、鈉、鉀等中的一種或多種，所述Y選自銪、釤、鋱、鏑四種元素中的一種或多種。
3.—種權(quán)利要求1或2所述的用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子的標(biāo)記方法，其通過(guò)化學(xué)配位法或物理吸附法用所述稀土納米材料標(biāo)記所述生物分子，所述生物分子包括生物素、親和素、抗體或核酸適配體。
4.一種稀土納米材料溶解增強(qiáng)時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，所述方法中采用權(quán)利要求1或2所述的用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括:加入上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，形成免疫復(fù)合物后，加入增強(qiáng)液，使稀土納米材料溶解成稀土離子，并與增強(qiáng)液中的螯合物形成具有強(qiáng)熒光信號(hào)的分子，采用時(shí)間分辨檢測(cè)突光信號(hào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下: 1)將捕獲抗 體或抗原以物理吸附或共價(jià)偶聯(lián)的方式固定在微孔板上； 2)封閉液封閉； 3)加入含有待測(cè)抗原或待測(cè)抗體的樣品； 4)加入上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物分子，形成免疫復(fù)合物； 5)加入增強(qiáng)液，采用時(shí)間分辨檢測(cè)熒光信號(hào)。 優(yōu)選地，當(dāng)加入待測(cè)抗原時(shí)，所述生物分子選自生物素、親和素、抗體或核酸適配體。 優(yōu)選地，當(dāng)加入待測(cè)抗體時(shí)，所述生物分子選自生物素、親和素或核酸適配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述的步驟4)為: 加入上述用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記抗體，形成免疫復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述的步驟4)還可以分解為以下步驟: (a)加入生物素標(biāo)記的抗體； (b)加入上述的用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記親和素，形成免疫復(fù)合物。 更優(yōu)選地，所述的步驟4)還可以分解為以下步驟: (a’ )加入生物素標(biāo)記的抗體； (b’)加入親和素； (c’)加入上述的用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的稀土納米材料標(biāo)記生物素，形成免疫復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的方法，所述的增強(qiáng)液主要由緩沖液、β-二酮體，非離子表面活性劑和協(xié)同劑組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至9中任一項(xiàng)所述的方法，其檢測(cè)模式包括夾心法檢測(cè)、直接法檢測(cè) 或競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103969432SQ201410118864
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】陳學(xué)元, 周山勇, 鄭偉, 馬恩, 黃明東, 陳卓, 涂大濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所