一種快速定量檢測igfbp-7和timp-2的免疫熒光試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫熒光試紙條及其制備方法，它包括支撐片以及支撐片上順次搭接粘貼的樣品墊片、檢測膜和吸水墊片，所述樣品墊片和檢測膜之間設(shè)有偶合物墊片，所述檢測膜上設(shè)有檢測線，所述檢測線包被有抗IGFBP-7和/或抗TIMP-2單克隆抗體或多克隆抗體，所述IGFBP-7抗體和/或TIMP-2抗體設(shè)在同一位置或設(shè)在相鄰位置，所述檢測線另一邊設(shè)有控制線，控制線包被有抗鏈霉親和素（SAV）抗體，所述偶合物墊片上涂布有含有不同熒光標記的IGFBP-7抗體和TIMP-2抗體偶合物。該試紙具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準確等優(yōu)點，適于臨床快速診斷。
【專利說明】—種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫熒光試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫熒光試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]急性腎衰竭(AKI)是一個由多種病因引起的臨床綜合征，是因腎循環(huán)衰竭或腎小管的變化而引起的一種突發(fā)性腎功能喪失，因此腎臟無法排除身體的代謝廢物。當腎臟無法行使正常功能時，會導(dǎo)致毒素，廢物和水分在體內(nèi)堆積，而引起急性腎衰竭。
[0003]與急性腎衰竭(AKI)檢測相關(guān)的標志物有許多種，如IQM-UL-FABP都最引人注目的作為AKI診斷生物標志物。研究表明，在AKI中，島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-likegrowth factor-binding protein-7,胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7))和組織金屬蛋白酶抑制劑_2 (tissue inhibitor of metalloproteinases_2,金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2))是細胞周期阻滯是一個關(guān)鍵的機制，可用于檢測AKI。而且IGFBP7和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2) AUC (曲線下面積)分別為0.76和0.79，兩者聯(lián)合胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2) AUC為0.80。而其它標志物AUC ( 0.72。因此兩者聯(lián)合比現(xiàn)有檢測標志物可早12-36小時檢測到AKI。
[0004]免疫突光技術(shù)(FluorescenceImmunoassay technique)是以突光分子作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。生物素一親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin — System，BAS)是一種非常有效的生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素一親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標記物結(jié)合。生物素一親合素與標記試劑高親合力的牢固結(jié)合及多級放大效應(yīng)，使BAS免疫標記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。BAS在實際應(yīng)用中所具有的巨大優(yōu)越性，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。
[0005](I)生物素容易與蛋白質(zhì)和核酸類等生物大分子結(jié)合，形成的生物素衍生物，不僅保持了大分子物質(zhì)的原有生物活性，而且比恬度高，具多價性。因此，BAS具有多級放大作用，使其在應(yīng)用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。
[0006](2)親和素與生物素間的結(jié)合具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性。因此，BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時，并不增加非特異性干擾。而且，BAS結(jié)合特性不會因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應(yīng)用中可最大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。
[0007](3)親和素結(jié)合生物素的親和常數(shù)可為抗原-抗體反應(yīng)的百萬倍，二者結(jié)合形成復(fù)合物的解離常數(shù)很小，呈不可逆反應(yīng)性；而且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結(jié)合。因此，BAS在實際應(yīng)用中，產(chǎn)物的穩(wěn)定性高，提高測定的精確度。(4)生物素和親和素均可制成多種衍生物，不僅可與酶、熒光素和放射性核素等各類標記技術(shù)結(jié)合，用于檢測體液、組織或細胞中的抗原-抗體、激素一受體和核酸系統(tǒng)以及其他多種生物學(xué)反應(yīng)體系，而且也可制成親和介質(zhì)，用于分離提純上述各反應(yīng)體系中的反應(yīng)物。
[0008]目前，IGFBP-7和--ΜΡ-2的方法目前主要是酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)，ELISA技術(shù)存在以下缺點:檢測設(shè)備要求高，成本高；干擾因素較多，重復(fù)性不好；檢測時間長。因此酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測IGFBP-7和TIMP-2不適合臨床快速診斷。如何能夠制作出快速的定量檢測設(shè)備成為需要迫切解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個目的是提供一種快速定量檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)的免疫熒光試紙條，本發(fā)明另一目的時還提供一種快速定量檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)的免疫熒光試紙條的制備方法。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種快速定量檢測IGFBP-7和--ΜΡ-2的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片以及試紙條支撐片上順次搭接粘貼的樣品墊片、檢測膜和吸水墊片，所述樣品墊片和檢測膜之間設(shè)有偶合物墊片，偶合物墊片一端上方設(shè)有第一層玻璃纖維墊片，其一端下方設(shè)有第二層玻璃纖維墊片或者偶合物墊片一端上方僅設(shè)有第一層玻璃纖維墊片或者不設(shè)有任一墊片，所述檢測膜上設(shè)有檢測線，所述檢測線包被有抗胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和/或抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)單克隆抗體或多克隆抗體，所述胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體或金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體設(shè)在同一位置或設(shè)在相鄰位置，所述檢測線另一邊設(shè)有控制線，控制線包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片上涂布有含有不同熒光標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物。
[0011]作為本發(fā)明的進一步 改進，所述偶爾物墊片中偶合物的制備包括如下步驟。
[0012](I)Biotin-1GFBP-7 抗體以及 Biotin- --ΜΡ-2 抗體的制備:
(1.1) Biotin-1GFBP-7 抗體的制備:
胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中保證其活化度，然后把溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體加入準備好的活化的生物素(Biotin)溶液中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將溶液超濾離心濃縮，并多次沖洗，形成Biotin-1GFBP-7抗體原液，并計算每個胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體可能結(jié)合的生物素(Biotin)平均個數(shù)；
(1.2) Biotin- TIMP-2 抗體的制備:
金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中保證其活化度，然后把溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體加入準備好的活化的生物素(Biotin)溶液中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將溶液超濾離心濃縮，并多次沖洗，形成Biotin- TIMP-2抗體原液，并計算每個金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體可能結(jié)合的生物素(Biotin)平均個數(shù)。
[0013](2)兩種熒光分子-SAV的制備:
為了同時監(jiān)測兩種抗體，兩種不同波長的熒光分子使用在本申請中。由于制作過程一致，制備方法中只提一種?？规溍褂H和素(SAV)粉末溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的抗鏈霉親和素(SAV)加入熒光分子粉末中反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將溶液超濾離心濃縮，并多次沖洗，形成熒光分子-SAV原液，并計算每個熒光分子可能結(jié)合的抗鏈霉親和素(SAV)的平均個數(shù)。
[0014](3)熒光I標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物以及熒光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物的制備:
以熒光I標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物為例，熒光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物標記過程和熒光I標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物相似。將Biotin-胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白
7(IGFBP-7)抗體原液稀釋，按照計算的比例加入熒光I分子-SAV反應(yīng)，并在合適的條件下停止反應(yīng)，形成熒光I標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物；
本發(fā)明還提供了一種快速定量檢測IGFBP-7和--ΜΡ-2的免疫熒光試紙條的制備方法，包括如下步驟:
步驟一:制備檢測線；檢測膜在免疫熒光試紙條中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處；檢測線是將抗胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜上；檢測線是將抗金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜上，然后將檢測膜充分干燥并烘烤數(shù)日后即得；檢測線7-1和檢測線7-2即可位于同一位置，也可為兩個不同的位置，若為不同位置，則均位于控制線同一側(cè)，即液體首先接觸的位置。
[0015]步驟二:制備控制線；所述控制線是將抗鏈霉親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜上，然后將檢測膜充分干燥并烘烤數(shù)日后即得；
步驟三:制備偶合物墊；所述偶合物墊片的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預(yù)封閉緩沖液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜儀器將熒光I標記的-胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物和熒光2標記的-金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物涂布在偶合物墊片上，充分干燥即得。
[0016]步驟四:制備樣本墊片；所述樣本墊片可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用，將樣本墊片用封閉液浸泡后，充分干燥即得；
步驟五:試紙條的組裝；
在試紙條支撐片由下而上依次粘附檢測膜、吸水墊片偶合物墊片，在偶合物墊片上設(shè)有第一層玻璃纖維墊片、第二層玻璃纖維墊片或者僅設(shè)第一層玻璃纖維墊片或者不設(shè)有任一墊片，最上一層為樣品墊片；
將上述材料組裝后，切成小條，即制的所述定量檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)的免疫熒光試紙條。
[0017]采用如上技術(shù)方案后，其有益效果為:
本發(fā)明所述的快速定量檢測IGFBP-7和--ΜΡ-2的免疫熒光試紙條的工作原理是:采用免疫側(cè)流反應(yīng)原理，通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗時樣本中的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗原首先分別與偶合墊上的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。其后免疫復(fù)合物隨著樣本在硝基纖維素膜上層析流動，當免疫復(fù)合物層析至硝基纖維素膜上的檢測區(qū)(IGFBP-7和--ΜΡ-2檢測線)時，分別與預(yù)先包被在硝基纖維素膜上的抗胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體發(fā)生反應(yīng)從而被固定在硝基纖維素膜的檢測線上。樣本中的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)越多，檢測線上的復(fù)合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢測過程中，未結(jié)合的熒光標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物也會隨樣本在檢測膜上層析，當層析至檢測膜的控制線時，熒光標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)會與預(yù)先包被在檢測膜上的抗SAV抗體發(fā)生反應(yīng)從而被固定在對照區(qū)(控制線)上。樣本中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)濃度分別與檢測線中兩種不同波長的熒光的光密度值成正比關(guān)系。
[0018]當反應(yīng)結(jié)束后，利用檢測儀將控制線和檢測線的光密度進行分析，并將所分析得到的結(jié)果進行運算，從而得到相對光密度值(RI)。然后檢測儀根據(jù)已預(yù)先設(shè)置在檢測儀內(nèi)的標準曲線對胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)的濃度進行計算并顯示結(jié)果，以ng/mL為單位表示，其反應(yīng)結(jié)果如下表1所示。
【權(quán)利要求】
1.一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片(4)以及試紙條支撐片(4)上順次搭接粘貼的樣品墊片(I)、檢測膜(2)和吸水墊片(3)，所述樣品墊片(I)和檢測膜(2)之間設(shè)有偶合物墊片(5)，偶合物墊片(5) —端上方設(shè)有第一層玻璃纖維墊片(6-1)，其一端下方設(shè)有第二層玻璃纖維墊片(6-2)或者偶合物墊片(5) —端上方僅設(shè)有第一層玻璃纖維墊片(6-1)或者不設(shè)有任一墊片，其特征在于:所述檢測膜(2)上設(shè)有檢測線(7-1)、(7-2)，所述檢測線(7-1)、(7-2)包被有抗胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP-7)和/或抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)單克隆抗體或多克隆抗體，所述胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和/或金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體設(shè)在同一位置或設(shè)在相鄰位置，所述檢測線(7)另一邊設(shè)有控制線(8)，控制線(8)包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片(5)上涂布有含有不同熒光標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速定量同時檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫熒光試紙條，其特征在于:所述偶爾物墊片(5)中熒光標記的IGFBP-7抗體和TIMP-2抗體偶合物的制備包括如下步驟: (1)Biotin-1GFBP-7 抗體以及 Biotin- --ΜΡ-2 抗體的制備: (1.DBiotin-1GFBP-7 抗體的制備: 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二 甲基亞砜(DMSO)中保證其活化度，然后把溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體加入準備好的活化的生物素(Biotin)溶液中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將溶液超濾離心濃縮，并多次沖洗，形成Biotin-1GFBP-7抗體原液，并計算每個胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體可能結(jié)合的生物素(Biotin)平均個數(shù)； (1.2) Biotin- TIMP-2 抗體的制備: 金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中保證其活化度，然后把溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體加入準備好的活化的生物素(Biotin)溶液中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將溶液超濾離心濃縮，并多次沖洗，形成Biotin- TIMP-2抗體原液，并計算每個金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體可能結(jié)合的生物素(Biotin)平均個數(shù)； (2)兩種熒光分子-SAV的制備: 為了同時監(jiān)測兩種抗體，設(shè)有兩種不同波長的熒光分子，所述制作過程一致，上述制備方法中只提一種； 抗鏈霉親和素(SAV)粉末溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的抗鏈霉親和素(SAV)加入熒光分子粉末中反應(yīng),反應(yīng)完成后,將溶液超濾離心濃縮，并多次沖洗，形成熒光分子-SAV原液，并計算每個熒光分子可能結(jié)合的抗鏈霉親和素(SAV)的平均個數(shù)； (3)熒光I標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP-7)抗體偶合物以及熒光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物的制備:將Biotin-1GFBP-7抗體原液稀釋，按照計算的比例加入熒光I分子-SAV反應(yīng)，并在合適的條件下停止反應(yīng)，形成熒光I標記的胰 島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物； 熒光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物標記過程和熒光I標記的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物過程相同。
3.一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫熒光試紙條的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:步驟一:制備檢測線；檢測膜(2)在免疫熒光試紙條中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處；檢測線(7-1)是將抗胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜(2)上；檢測線(7-2)是將抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜(2)上，然后將檢測膜(2)充分干燥并烘烤數(shù)日后即得；檢測線(7-1)、(7-2)位于同一位置或不同位置，若為不同位置，則檢測線(7-1)、(7-2)均位于控制線(8)同一側(cè)，即液體首先接觸的位置；步驟二:制備控制線；所述控制線(8)是將抗鏈霉親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜(2)上，然后將檢測膜(2)充分干燥并烘烤數(shù)日后即得；步驟三:制備偶合物墊；所述偶合物墊片(5)的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片(5)的玻璃纖維濾膜放入預(yù)封閉緩沖液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜儀器將熒光I標記的-胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物和熒光2標記的-金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物涂布在偶合物墊片(5)上，充分干燥即得；步驟四:制備樣本墊片；所述樣本墊片(I)可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用，將樣本墊片用封閉液浸泡后，充分干燥即得； 步驟五:試紙條的組裝； 在試紙條支撐片(4)由下而上依次粘附檢測膜(2)、吸水墊片(3)和偶合物墊片(5)，在偶合物墊片(5)上設(shè)有第一層玻璃纖維墊片(6-1)、第二層玻璃纖維墊片(6-2)或者僅設(shè)第一層玻璃纖維墊片(6-1)或者不設(shè)有任一墊片,最上一層為樣品墊片(I)； 將上述材料組裝后，切成小條，即制的所述定量檢測IGFBP-7和--ΜΡ-2的免疫熒光試紙條。
【文檔編號】G01N33/533GK103926401SQ201410124710
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】劉紅劍, 威廉姆.努特, 何小紅, 劉麗萍, 張丹 申請人:瑞萊生物科技（江蘇）有限公司