一種茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，以及由此得到的茜草配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明的建立方法包括以下步驟：（1）供試品溶液的制備（2）高效液相色譜分析。本發(fā)明方法所獲得的茜草配方顆粒水溶液高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有色譜峰11個(gè)，其保留時(shí)間分別為6.072min、6.559min、8.087min、9.170min、12.118min、20.988min、29.251min、32.211min、33.189min、38.430min、45.431min。茜草配方顆粒脂溶性成分HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有色譜峰共有9個(gè)，其保留時(shí)間分別為12.156min、12.832min、14.552min、22.615min、23.291min、25.412min、27.356min、34.383min、37.076min。本發(fā)明供試品制作簡(jiǎn)便，色譜條件容易實(shí)現(xiàn)，方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，能有效控制茜草配方顆粒質(zhì)量，為茜草配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。
【專利說(shuō)明】一種茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥配方顆粒指紋圖譜的建立方法，特別是茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的茜草配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，屬于藥物分析【技術(shù)領(lǐng)域】中。

【背景技術(shù)】
[0002]茜草配方顆粒是通過(guò)對(duì)中藥茜草進(jìn)行提取、濃縮、制粒所得。茜草為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖,主產(chǎn)于安徽、江蘇、山東、河南、陜西。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。茜草性味苦寒，歸肝經(jīng)，用于涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)，主治吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛。臨床包括茜草和茜草炭的使用。
[0003]《中國(guó)藥典》2010年版對(duì)茜草的質(zhì)量控制包括原植物品種、藥材性狀、理化鑒別、含量測(cè)定等項(xiàng)目，文獻(xiàn)也對(duì)茜草中化學(xué)成分進(jìn)行闡述，包括茜草素、羥基茜草素等蒽醌及其苷類，大葉茜草素，茜草內(nèi)酯等萘醌及其苷類，環(huán)己肽類，三萜類，多糖等成分，但是對(duì)于茜草配方顆粒這樣有效成分類型多、組分復(fù)雜的中藥制劑，僅測(cè)定某類成分的含量，難以客觀、有效地評(píng)價(jià)或控制藥材的質(zhì)量。
[0004]中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。色譜指紋圖譜技術(shù)作為一種多組分復(fù)雜樣品的有效質(zhì)量控制方法，能夠反映出待測(cè)樣品的整體性、特征性，目前已被廣泛用于中草藥及其各種制劑的質(zhì)量控制。目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，由于高效液相色譜(HPLC)具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，且中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。但目前還未見(jiàn)有利用高效液相色譜(HPLC)方法對(duì)茜草配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行測(cè)試和分析的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的茜草配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，該方法及圖譜可提供一種能有效控制茜草配方顆粒質(zhì)量的方法，為茜草配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟:
(I)供試品溶液的制備:取茜草配方顆粒置于具塞錐形瓶中，加入蒸餾水溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒水溶液；移取茜草配方顆粒水溶液至分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取后，合并乙酸乙酯液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒脂溶性成分溶液；
(2)高效液相色譜分析:將供試品溶液注入高效液相色譜分析儀進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，得到指紋圖譜，色譜分析條件為:色譜柱為綠百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus,4.6mmX250mm,5ym ;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm ;流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脫，流速為
0.9-1.lmL/min ;其中,梯度洗脫具體程序如下:
a、茜草配方顆粒水溶液的梯度洗脫程序?yàn)?
0?20 min:甲醇濃度由5%勻速增加至30%，
20?25 min:甲醇濃度由30%勻速增加至50%，
25?40 min:甲醇濃度由50%勻速增加至70%，
40^60 min:甲醇濃度由70%勻速增加至100%，
60?70 min:甲醇濃度保持在100% ；
b、茜草配方顆粒脂溶性成分溶液的梯度洗脫程序?yàn)?
(TlO min:甲醇濃度由5%勻速增加至50%，
10^60 min:甲醇濃度由50%勻速增加至100%，
60?70 min:甲醇濃度保持在100%。
[0007]本發(fā)明最優(yōu)的技術(shù)方案為采用如下步驟:
(1)供試品溶液的制備:取茜草配方顆粒0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水20mL，溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒水溶液；精密移取茜草配方顆粒水溶液1ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒脂溶性成分溶液；
(2)高效液相色譜分析:將供試品溶液注入高效液相色譜分析儀進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，得到指紋圖譜，色譜分析條件為:色譜柱為綠百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus,4.6mmX250mm,5ym ;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm ;流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脫，流速為lmL/min ;其中，梯度洗脫具體程序如下:
a、茜草配方顆粒水溶液的梯度洗脫程序?yàn)?
(Γ20 min:甲醇濃度由5%勻速增加至30%，
20?25 min:甲醇濃度由30%勻速增加至50%，
25?40 min:甲醇濃度由50%勻速增加至70%，
40^60 min:甲醇濃度由70%勻速增加至100%，
60?70 min:甲醇濃度保持在100% ；
b、茜草配方顆粒脂溶性成分溶液的梯度洗脫程序?yàn)?
(TlO min:甲醇濃度由5%勻速增加至50%，
10^60 min:甲醇濃度由50%勻速增加至100%，
60?70 min:甲醇濃度保持在100%。
[0008]采用上述最優(yōu)的技術(shù)方案所得到的茜草配方顆粒水溶液HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有色譜峰11個(gè)，其保留時(shí)間分別為I號(hào)峰6.072 min、2號(hào)峰6.559 min、3號(hào)峰8.087 min,4號(hào)峰 9.170 min,5 號(hào)峰 12.118 min,6 號(hào)峰 20.988 min,7 號(hào)峰 29.251 min,8 號(hào)峰 32.211min、9號(hào)峰33.189 min、10號(hào)峰38.430 min、11號(hào)峰45.431 min ;所得到的菌草配方顆粒月旨溶性成分HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有色譜峰共有9個(gè)，其保留時(shí)間分別為I號(hào)峰12.156min、2號(hào)峰 12.832min、3 號(hào)峰 14.552min、4 號(hào)峰 22.615min、5 號(hào)峰 23.291min、6 號(hào)峰 25.412min、7 號(hào)峰 27.356min、8 號(hào)峰 34.383min、9 號(hào)峰 37.076min。
[0009]本發(fā)明最優(yōu)技術(shù)方案的獲得是通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)得到，說(shuō)明如下。
[0010]本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)材料為由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的茜草配方顆粒；所用儀器包括:高效液相色譜儀:Waters e2695系列(型號(hào):Waters e2695,廠家:美國(guó)Waters公司)，包括PDA 二極管陣列檢測(cè)器(型號(hào):Waters 2998,廠家:美國(guó)Waters公司)和Empower工作站(美國(guó) Waters 公司);色譜柱:綠百草 Ecosil 120-5-C18 AQ Plus 色譜柱(4.6mmX 250mm,5 μ m),天平:千分之一天平(上海恒平JA2003),萬(wàn)分之一天平(Sartorius BS224S),十萬(wàn)分之一天平(Precisa XR205SM DR);超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore (密理博)公司)；本發(fā)明所用試劑與試藥包括:甲醇、乙酸乙酯、磷酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純；HPLC用甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)Merck公司，Darmstadt, Gemany);水為超純水(電阻率18.2mΩ.cm)。
[0011]1、供試品溶液的制備
(I)提取溶劑的選擇
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，茜草的提取溶劑常用甲醇、乙酸乙酯，配方顆粒指紋圖譜的研究常用溶劑為乙醇、甲醇、水。因此分別采用甲醇、乙醇、水作為提取溶劑對(duì)茜草配方顆粒進(jìn)行提取，由于茜草配方顆粒是由茜草水提液濃縮而成，故水溶性強(qiáng)，能完全溶于水，而在甲醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇中不能完全溶解，通過(guò)比較各種溶劑提取物色譜圖，水提取物的主要色譜峰信息較多，因此選用蒸餾水作為溶劑對(duì)茜草配方顆粒進(jìn)行溶解，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，對(duì)其中的脂溶性成分進(jìn)行研究。
[0012]樣品處理:精密稱定茜草配方顆粒粉末各0.5g，分別精密加入20mL溶劑(即水、醇/乙醇、70%甲醇/乙醇、50%甲醇/乙醇)溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。主要成分色譜圖比較結(jié)果見(jiàn)圖1。精密移取溶液10ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒脂溶性成分溶液，色譜圖見(jiàn)圖2。
[0013](2)最終提取方案
取茜草配方顆粒粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水20mL，溶解，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒水溶液；精密移取溶液10ml，移入分液漏斗中，力口乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒脂溶性成分溶液。
[0014]2、色譜分析條件的確定
(I)流動(dòng)相的選擇
茜草配方顆粒所含成分復(fù)雜，且極性范圍跨度比較大，等度洗脫很難分離，故采用梯度洗脫方式。比較甲醇-7jC,乙腈-7jC，乙腈-0.05%磷酸水，乙腈-0.05%磷酸水系統(tǒng)的洗脫效果。
[0015]從實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所優(yōu)化的洗脫程序中選擇分離效果較好的洗脫程序，分別用甲醇-水，乙腈-0.05%磷酸水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸水作為流動(dòng)相，對(duì)同一份樣品進(jìn)行測(cè)定，比較它們的圖譜，結(jié)果采用甲醇-0.05%磷酸水系統(tǒng)所測(cè)定的圖譜基線較平穩(wěn)，主要色譜峰信息較多，因此最終選擇甲醇-0.05%磷酸水作為流動(dòng)相，表I為洗脫程序，圖3為不同流動(dòng)相洗脫比較圖。
[0016]表I洗脫程序
「而_■■■■■■■("'min)...................................................................................................................1■■■■■0:50.......................................................................................丨丨■■■■■■50:60............................................................................—
f 學(xué).................................................................................................[1.....5-_.................................................................1.......100...........................................................................................................(2)流動(dòng)相梯度
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用了多個(gè)不同的洗脫梯度對(duì)同一份茜草配方顆粒提取樣品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)比較不同洗脫程序所測(cè)定的樣品色譜圖，從中優(yōu)選色譜信息較豐富，主要色譜峰分離度高，基線較平穩(wěn)且分析時(shí)間較為合理的梯度4洗脫程序作為最終的色譜分析條件，表2為梯度I的洗脫程序，表3為梯度2的洗脫程序，表4為梯度3的洗脫程序，表5為梯度4的洗脫程序，圖4為選用的梯度洗脫程序圖譜。
[0017]表2
[麗......(mn)..............................[1-20—|「20:2β..........................................................2^0......丨50:62................................丨.....62^0.................................￠1 (%)I 17—57 57^8 | 68^100 | 100
表3
["1?.......(ToH)................................「0:20............................Γ^30............................[1.....30-60.............................[￠0^70............................[.--—~
審醇(%) If?—10 H 10^45 1 45—52 || 52—咖 | 100 表4.....時(shí)_......("mtn)...................................lfo~2Q.............................][10^30.............................[[......30.............................|......60^75.............................丨[75~S5.........................—
￠1 (%) 15I 5-40 140^45 45—_ | 100
表5
時(shí)函(Μη).....................................『Mfl...............................1 20^25\\4040 60-70 —
ffg (%) If5^30 ||?^50 |[^70 I 70-^100 100
(3)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
通過(guò)對(duì)樣品全波長(zhǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，茜草配方顆粒水溶液主要的成分最大吸收波長(zhǎng)為250nm,脂溶性成分的最大吸收波長(zhǎng)為250nm,所以確定波長(zhǎng)250nm為菌草配方顆粒圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0018](4)不同流速考察
采用上述色譜條件，考察不同流速條件下(0.9 mL/min>l.0 mL/min、l.1 mL/min)同一份樣品的色譜圖，結(jié)果各主要成分的色譜峰分離度和峰面積差異不大，其中流速1.lml/min時(shí)壓力較大，且三個(gè)不同流速以流速1.0 mL/min的圖譜峰形較好，因此選用流速1.0mL/min。圖7、圖8為不同流速色譜圖比較圖。
[0019](5)柱溫的選擇考察不同柱溫(151:、251:、35°0對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果顯示柱溫對(duì)各主要成分的色譜峰分離度、峰面積影響不大，因此柱溫?zé)o需控制。圖9、圖10為不同柱溫比較圖。
[0020](6)不同色譜柱
考察以下不同色譜柱對(duì)色譜峰的影響:①LUBEX 120-5-C18 AQ Plus(4.6 mmX250mm,5 μ m) ;@Phenomenex Kinetex 2.6u XB-C18 100AC4.6 mm X 100mm, 2.6 μ m) ;@LUBEX C18(4.6 mmX 250mm, 5 μ m),結(jié)果顯示柱②(長(zhǎng)度較短)分離度較其他色譜柱差，柱③部分色譜峰有拖尾現(xiàn)象，故選擇柱①，結(jié)果見(jiàn)圖11、圖12。
[0021](7)最優(yōu)色譜條件
色譜柱:綠百草 Ecosil 120_5_C18 AQ Plus 色譜柱(4.6 mmX 250mm, 5 μ m)；
檢測(cè)波長(zhǎng):250nm ；
流動(dòng)相:甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脫；
流速:lmL/min ；
梯度洗脫程序如表6、表7所示:
表6水溶液梯度洗脫程序

【權(quán)利要求】
1.一種茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取茜草配方顆粒置于具塞錐形瓶中，加入蒸餾水溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒水溶液；移取茜草配方顆粒水溶液至分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取后，合并乙酸乙酯液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒脂溶性成分溶液； (2)高效液相色譜分析:將供試品溶液注入高效液相色譜分析儀進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，得到指紋圖譜，色譜分析條件為:色譜柱為綠百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus,4.6.ιΧ250πιπι，5μπι ;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm ;流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脫，流速為0.9-1.lmL/min ;其中,梯度洗脫具體程序如下: a、茜草配方顆粒水溶液的梯度洗脫程序?yàn)? (Γ20 min:甲醇濃度由5%勻速增加至30%， 20?25 min:甲醇濃度由30%勻速增加至50%， 25?40 min:甲醇濃度由50%勻速增加至70%， 40^60 min:甲醇濃度由70%勻速增加至100%， 60?70 min:甲醇濃度保持在100% ； b、茜草配方顆粒脂溶性成分溶液的梯度洗脫程序?yàn)? (TlO min:甲醇濃度由5%勻速增加至50%， 10^60 min:甲醇濃度由50%勻速增加至100%， 60?70 min:甲醇濃度保持在100%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于:采用如下步驟: (1)供試品溶液的制備:取茜草配方顆粒0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水20mL，溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒水溶液；精密移取茜草配方顆粒水溶液1ml，移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得茜草配方顆粒脂溶性成分溶液； (2)高效液相色譜分析:將供試品溶液注入高效液相色譜分析儀進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，得到指紋圖譜，色譜分析條件為:色譜柱為綠百草Ecosil 120-5-C18 AQ Plus,4.6.ιΧ250πιπι，5μπι;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm ;流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水，梯度洗脫，流速為lmL/min ;其中，梯度洗脫具體程序如下: a、茜草配方顆粒水溶液的梯度洗脫程序?yàn)? (Γ20 min:甲醇濃度由5%勻速增加至30%， 20?25 min:甲醇濃度由30%勻速增加至50%， 25?40 min:甲醇濃度由50%勻速增加至70%， 40^60 min:甲醇濃度由70%勻速增加至100%， 60?70 min:甲醇濃度保持在100% ； b、茜草配方顆粒脂溶性成分溶液的梯度洗脫程序?yàn)? (TlO min:甲醇濃度由5%勻速增加至50%， 1(T60 min:甲醇濃度由50%勻速增加至100%， 60?70 min:甲醇濃度保持在100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的茜草配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所得到的茜草配方顆粒水溶液HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有色譜峰11個(gè)，其保留時(shí)間分別為 I 號(hào)峰 6.072 min、2 號(hào)峰 6.559 min、3 號(hào)峰 8.087 min、4 號(hào)峰 9.170 min、5 號(hào)峰 .12.118min、6 號(hào)峰 20.988 min、7 號(hào)峰 29.251 min、8 號(hào)峰 32.211 min、9 號(hào)峰 33.189 min、10 號(hào)峰38.430 min、11號(hào)峰45.431 min ;所得到的茜草配方顆粒脂溶性成分HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有色譜峰共有9個(gè)，其保留時(shí)間分別為I號(hào)峰12.156min、2號(hào)峰12.832min、3號(hào)峰.14.552min、4 號(hào)峰 22.615min、5 號(hào)峰 23.291min、6 號(hào)峰 25.412min、7 號(hào)峰 27.356min、8 號(hào)峰 34.383min、9 號(hào)峰 37.076min。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104133028SQ201410128194
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】潘華峰, 嚴(yán)萍, 嚴(yán)艷, 趙自明 申請(qǐng)人:潘華峰, 廣東一方制藥有限公司