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      一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法

      文檔序號(hào):6222853閱讀:1115來(lái)源:國(guó)知局
      一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法
      【專利摘要】本發(fā)明涉及一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,包括依次進(jìn)行的如下步驟:步驟1、用自身免疫抗原對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行多次免疫,每次免疫之前,對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行取血測(cè)定OD值,當(dāng)OD值穩(wěn)定后,免疫結(jié)束,進(jìn)行取血,獲得抗血清;步驟2、對(duì)步驟1所得的抗血清進(jìn)行親和純化得到IgG抗體;步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質(zhì)量比為1:1~2偶聯(lián)后,經(jīng)分離純化獲得IgG-IgE連接物濃溶液,將IgG-IgE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5~1μg/ml,即得陽(yáng)性血清。本發(fā)明方法可批量制備各種過(guò)敏原的陽(yáng)性血清,解決了檢測(cè)試劑盒制備過(guò)程中的陽(yáng)性質(zhì)控問(wèn)題,也可以作為校準(zhǔn)品的生產(chǎn)原料,并且本制備方法簡(jiǎn)單易行。
      【專利說(shuō)明】一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于體外診斷【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002]過(guò)敏是一種機(jī)體的變態(tài)反應(yīng),是人對(duì)正常物質(zhì)(過(guò)敏原)的一種不正常的反應(yīng),當(dāng)過(guò)敏原接觸到過(guò)敏體質(zhì)的人群才會(huì)發(fā)生過(guò)敏,過(guò)敏原有花粉、粉塵、異體蛋白、化學(xué)物質(zhì)、紫外線等幾百種。在過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程中,過(guò)敏介質(zhì)起著直接的作用,過(guò)敏原是過(guò)敏病癥發(fā)生的外因,而機(jī)體免疫能力低下,大量自由基對(duì)肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞的氧化破壞是過(guò)敏發(fā)生的內(nèi)因。一般來(lái)講,當(dāng)過(guò)敏原第一次進(jìn)入機(jī)體時(shí),與肥大細(xì)胞或者是嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合,產(chǎn)生白三烯,前列腺素等等的過(guò)敏因子,但并不會(huì)立即產(chǎn)生過(guò)敏,此特性有些將維持2?3天,有的數(shù)月。當(dāng)機(jī)體第二次接受這種過(guò)敏原時(shí),肥大細(xì)胞才會(huì)變形,產(chǎn)生過(guò)敏因子,也就產(chǎn)生了 一系列的過(guò)敏現(xiàn)象。
      [0003]過(guò)敏可以是體液(抗體)或者是細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的。在大多數(shù)情況下,可產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的抗體屬于IgE類,這些個(gè)體可以歸類于患有IgE-介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。然而,并非所有的特異反應(yīng)性個(gè)體都會(huì)發(fā)生與IgE相關(guān)的過(guò)敏反應(yīng);在非-1gE-介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)中,抗體也可以屬于IgG—類,例如:包含右旋糖苷的免疫復(fù)合物導(dǎo)致的過(guò)敏性休克和和現(xiàn)在罕見(jiàn)的血清病,它們以前被歸于三型過(guò)敏反應(yīng)。在患有過(guò)敏性支氣管肺曲霉菌病(ABPA)病人中,IgE和IgG抗體都可以被檢出。接觸性過(guò)敏性皮炎是以淋巴細(xì)胞為介導(dǎo)的過(guò)敏性疾病的代表。IgE檢測(cè)仍是公認(rèn)的過(guò)敏檢測(cè)的主流產(chǎn)品,由于點(diǎn)刺注冊(cè)問(wèn)題和體外檢測(cè)技術(shù)的提高,體外檢測(cè)今后將是過(guò)敏檢測(cè)主流趨勢(shì);但是目前IgE檢測(cè)學(xué)術(shù)進(jìn)展遲緩,基本沒(méi)有新的發(fā)展,因此提高檢測(cè)質(zhì)量和降低檢測(cè)成本是主要開(kāi)發(fā)方向。
      [0004]但是,由于過(guò)敏診斷試劑的發(fā)展緩慢以及前期人們的重視度有限,除了部分過(guò)敏原可以購(gòu)買到商業(yè)血清,大部分過(guò)敏原的陽(yáng)性血清還是很難查詢到的,臨床收集少量可行,大量或者高濃度的血清基本不能收集到。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可批量生產(chǎn)的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法。
      [0006]為解決以上技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
      [0007]一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,包括依次進(jìn)行的如下步驟:
      [0008]步驟1、用自身免疫抗原對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行多次免疫,每次所述免疫之前,對(duì)所述健康動(dòng)物進(jìn)行取血測(cè)定OD值,當(dāng)OD值穩(wěn)定后,免疫結(jié)束,進(jìn)行取血,獲得抗血清;
      [0009]步驟2、對(duì)步驟I所得的抗血清進(jìn)行親和純化得到IgG抗體;
      [0010]步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質(zhì)量比為1:1?2偶聯(lián)后,經(jīng)分離純化獲得IgG-1gE連接物濃溶液,將所述的IgG-1gE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5?
      Iμ g/ml,即得所述的陽(yáng)性血清。[0011]優(yōu)選地,所述的健康動(dòng)物為兔子。
      [0012]優(yōu)選地,步驟I中,每次免疫時(shí)所采用的所述的過(guò)敏原的質(zhì)量為2?60mg。
      [0013]優(yōu)選地,步驟I中,先將所述的過(guò)敏原配置成濃度為4?8mg/ml的過(guò)敏原溶液,按所述的過(guò)敏原溶液與弗氏完全佐劑的體積比為I?1.5:1配置成乳液進(jìn)行首次免疫;按所述的過(guò)敏原溶液與弗式不完全佐劑的體積比為I?1.5:1配置成乳液進(jìn)行后續(xù)免疫。
      [0014]優(yōu)選地,所述的免疫次數(shù)為6?8次,每?jī)纱蚊庖叩拈g隔時(shí)間為12?36天。
      [0015]優(yōu)選地,步驟I中,取血時(shí)采用耳緣靜脈取血。
      [0016]優(yōu)選地,采用蛋白A sepharose CL-4B親和柱進(jìn)行所述的親和純化。
      [0017]優(yōu)選地,步驟3中,所述的IgG抗體和所述的人IgE抗體分別通過(guò)所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯(lián)劑和4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)劑活化后,在2?8°C下進(jìn)行偶聯(lián)。
      [0018]優(yōu)選地,步驟3中,采用Supperdex200凝膠純化柱進(jìn)行所述的分離純化。
      [0019]優(yōu)選地,步驟3中,采用含質(zhì)量比為0.4?6%的牛血清白蛋白、ρΗ7.5?8.5、
      0.09?0.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-1gE連接物濃溶液進(jìn)行所述的稀釋。
      [0020]由于以上技術(shù)方案的實(shí)施,本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
      [0021]本發(fā)明方法可批量制備各種過(guò)敏原的陽(yáng)性血清,解決了檢測(cè)試劑盒制備過(guò)程中的陽(yáng)性質(zhì)控問(wèn)題,也可以作為校準(zhǔn)品的生產(chǎn)原料,并且本制備方法簡(jiǎn)單易行。
      【專利附圖】

      【附圖說(shuō)明】
      [0022]附圖1為經(jīng)蛋白A sepharose CL-4B親和柱純化的兔抗牛肉IgG蛋白條帶?!揪唧w實(shí)施方式】
      [0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明,但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整,未注明的實(shí)施條件為本行業(yè)中的常規(guī)條件。
      [0024]實(shí)施例1
      [0025](一)過(guò)敏原的免疫和兔抗血清效價(jià)測(cè)定
      [0026]材料與儀器
      [0027]1、過(guò)敏原:過(guò)敏原凍干粉,過(guò)敏原為牛肉;
      [0028]2、佐劑:商品化的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑;
      [0029]3、動(dòng)物:選3只(每種過(guò)敏原免疫3只兔子)2月齡、體重1.5?2.0kg的健康新西蘭大白兔;
      [0030]4、二抗:HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG ;
      [0031]5、耗材:三通器、一次性注射器、移液器等。
      [0032]免疫步驟
      [0033]1、免疫過(guò)敏原準(zhǔn)備:用BCA法確定凍干粉溶解后過(guò)敏原的濃度,取4mg過(guò)敏原用PBS稀釋至600ul,用三通器將過(guò)敏原與完全佐劑或不完全佐劑(過(guò)敏原V:佐劑V=6:5)乳化,直至將一滴乳液滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散則過(guò)敏原準(zhǔn)備好。首次免疫用弗氏完全佐劑,后續(xù)免疫均用弗氏不完全佐劑。
      [0034]2、動(dòng)物免疫:將購(gòu)買的3只新西蘭大白兔在動(dòng)物房養(yǎng)殖I周,使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境;將制備好的乳液,用Iml注射器進(jìn)行頸部或背部皮下免疫注射,每只新西蘭大白兔注射3點(diǎn),每點(diǎn)注射300ul ;免疫周期為14天。
      [0035]3、抗血清的制備:每只動(dòng)物免疫前先于一側(cè)耳緣靜脈抽取2mL血(作為空白對(duì)照),之后每次免疫14天后,下次免疫前進(jìn)行耳緣靜脈取血用于抗血清評(píng)價(jià);取血后取下針頭,將注射器中的血緩緩轉(zhuǎn)移至離心管中,于4°C冰箱中過(guò)夜,取上清即為血清,析出淡黃色抗血清;將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中,血凝塊以1500xg離心10min。吸出上清液合并收集到的抗血清管中;抗血清分裝保存于一 70°C。
      [0036]4、抗血清效價(jià)的測(cè)定:采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA),用包被緩沖液將過(guò)敏原稀釋至10ug/ml,除陰性孔外每孔加IOOul即Iug ;陰性對(duì)照I和陰性對(duì)照2各包被Iug羊肉和花生過(guò)敏原,4°C包被過(guò)夜;空白對(duì)照1:免疫過(guò)敏原前取血;空白對(duì)照2: —抗孵育封閉液,其中不含一抗抗體;空白對(duì)照3 =HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育封閉液;其余孔為按1:100、1:200倍比稀釋的抗血清,進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。每次效價(jià)測(cè)定時(shí)平行進(jìn)行上次收集抗血清的效價(jià)測(cè)定,前后兩次免疫后抗血效價(jià)差異不大,則可以終止免疫殺兔取血,如果效價(jià)還有明顯提高則繼續(xù)免疫。
      [0037]以牛肉免疫兔后抗血清評(píng)價(jià)結(jié)果表1:
      [0038]表1
      [0039]
      【權(quán)利要求】
      1.一種過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:包括依次進(jìn)行的如下步驟: 步驟1、用自身免疫抗原對(duì)健康動(dòng)物進(jìn)行多次免疫,每次所述免疫之前,對(duì)所述健康動(dòng)物進(jìn)行取血測(cè)定OD值,當(dāng)OD值穩(wěn)定后,免疫結(jié)束,進(jìn)行取血,獲得抗血清; 步驟2、對(duì)步驟I所得的抗血清進(jìn)行親和純化得到IgG抗體; 步驟3、將步驟2所得的IgG抗體和人IgE抗體按質(zhì)量比為1: f 2偶聯(lián)后,經(jīng)分離純化獲得IgG-1gE連接物濃溶液,將所述的IgG-1gE連接物濃溶液稀釋至濃度為0.5^1 μ g/ml,即得所述的陽(yáng)性血清。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:所述的健康動(dòng)物為兔子。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:步驟I中,每次免疫時(shí)所采用的所述的過(guò)敏原的質(zhì)量為2飛Omg。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:步驟I中,先將所述的過(guò)敏原配置成濃度為r8mg/ml的過(guò)敏原溶液,按所述的過(guò)敏原溶液與弗氏完全佐劑的體積比為廣1.5:1配置成乳液進(jìn)行首次免疫;按所述的過(guò)敏原溶液與弗式不完全佐劑的體積比為廣1.5:1配置成乳液進(jìn)行后續(xù)免疫。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:所述的免疫次數(shù)為6~8次,每?jī)纱蚊庖叩拈g隔時(shí)間為12~36天。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:步驟I中,取血時(shí)采用耳緣靜脈取血。
      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:采用蛋白Asepharose CL-4B親和柱進(jìn)行所述的親和純化。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:步驟3中,所述的IgG抗體和所述的人IgE抗體分別通過(guò)所述的2-亞胺四氫噻吩偶聯(lián)劑和4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)劑活化后,在疒8°C下進(jìn)行偶聯(lián)。
      9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:步驟3中,采用Supperdex200凝膠純化柱進(jìn)行所述的分離純化。
      10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)敏原陽(yáng)性血清的制備方法,其特征在于:步驟3中,采用含質(zhì)量比為0.4~6%的牛血清白蛋白、pH7.5~8.5,0.09、.llmol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將所述的IgG-1gE連接物濃溶液進(jìn)行所述的稀釋。
      【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103926396SQ201410128592
      【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
      【發(fā)明者】孫嬋, 丁俊榮, 宋孟杰, 李永紅, 李慶春, 左云國(guó) 申請(qǐng)人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司
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