一種測定蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的方法，屬于分析【技術(shù)領(lǐng)域】。在常規(guī)氨基酸分析中，蛋白質(zhì)或肽分子中的谷氨酰胺被鹽酸水解后轉(zhuǎn)化為谷氨酸，分析結(jié)果中只能顯示谷氨酸的總量，無法顯示蛋白質(zhì)中谷氨酰胺的含量。本方法根據(jù)蛋白質(zhì)或肽分子中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺經(jīng)特殊試劑雙(三氟乙酰氧基)碘苯（BTI）反應(yīng)后不被鹽酸水解的特點(diǎn)，借助BTI試劑保護(hù)、再經(jīng)過酸水解后測定谷氨酸含量，并與未經(jīng)BTI保護(hù)樣品中谷氨酸含量的差異，計(jì)算蛋白質(zhì)或肽分子中結(jié)合態(tài)的谷氨酰胺含量。該方法包括待測樣品制備，BTI保護(hù)處理、酸解、衍生、氨基酸色譜柱分離、對照樣品制備、含量測定。此方法簡單，快速，靈敏度高，能及時地指導(dǎo)蛋白質(zhì)水解工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種測定蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種測定蛋白質(zhì)和其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的方法，屬于分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]谷氨酰胺是蛋白質(zhì)中的重要氨基酸，谷氨酰胺是谷氨酸的酰胺化產(chǎn)物，對生物體尤其是動物體的代謝有重要作用。
[0003]目前蛋白質(zhì)中氨基酸的分析均采用酸水解法，即通過鹽酸將蛋白質(zhì)水解為游離的氨基酸，然后采用色譜技術(shù)(離子交換或反相色譜)分離和測定氨基酸的含量。但酸水解時蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺和天門冬氨酸分別水解為谷氨酸和天門冬氨酸，而這兩種氨基酸也是蛋白質(zhì)中固有的氨基酸，色譜方法測定的谷氨酸實(shí)際上是蛋白質(zhì)中固有谷氨酸和谷氨酰胺酸解轉(zhuǎn)化生成谷氨酸的總和(天門冬氨酸分析結(jié)果也是如此)。因此，在目前的國內(nèi)外文獻(xiàn)中很少報道蛋白質(zhì)中谷氨酰胺和天門冬酰胺的含量。
[0004]上個世紀(jì)九十年代國外報道BTI試劑可以與蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化成L-2, 4- 二氨基丁酸(DABA)，該成分對酸穩(wěn)定，可以抵抗鹽酸的水解，從而使得蛋白質(zhì)中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的測定成為可能。
[0005]但目前文獻(xiàn)中利用BTI試劑保護(hù)法測定蛋白質(zhì)中谷氨酰胺含量的過程是:先利用丙氨酰-谷氨酰胺二肽(Ala-Gln)或甘氨酰-谷氨酰胺二肽(Gly-Gln)作為標(biāo)準(zhǔn)品，它們與BTI試劑反應(yīng)后生成DABA，然后通過氨基酸衍生試劑與DABA反應(yīng)，并用色譜法測定DABA的含量，計(jì)算出Gly-Gln或Gly-Gln 二肽與DABA之間的換算關(guān)系。蛋白質(zhì)樣品也與上述二肽做相同處理，通過測定生成的DABA含量計(jì)算樣品中的谷氨酰胺含量。可以看出，此類方法速度慢，成本高，操作繁瑣，不利于推廣和實(shí)際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有谷氨酰胺含量測定方法速度慢，成本高，操作繁瑣，整個測定過程需要丙氨酰-谷氨酰胺二肽和甘氨酰-谷氨酰胺二肽做標(biāo)準(zhǔn)品的缺點(diǎn)，提供一種簡單，快速，靈敏度高的蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的測定方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(I)樣品的溶解:取蛋白質(zhì)或其水解物溶于蒸餾水中，45°C?55°C水浴中攪拌使之充分溶脹。
[0008](2)樣品的BTI (雙(三氟乙酰氧基)碘苯)保護(hù)處理(TS):取步驟(I)樣品液，加BTI溶液和吡啶溶液，于50°C?55°C水浴保溫。然后，再于60V?80°C水浴或充氮?dú)庹舾伞?br> [0009](3)對照樣品處理(CS):取步驟(I)樣品液，加乙腈溶液和吡啶溶液，于50°C?55°C水浴保溫。然后，再于60°C?80°C水浴或充氮?dú)庹舾伞?br> [0010](4)酸水解:在含有(2)、(3)樣品的消化管中加入酸，封口后完全水解。再定容、過濾。
[0011](5)衍生和上柱分析:取步驟(4)水解液，用氨基酸衍生化試劑衍生和上柱。
[0012](6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理:以樣品質(zhì)量為基數(shù)，通過氨基酸色譜分析并計(jì)算，BTI保護(hù)樣品(TS)和對照樣品(CS)中的谷氨酸百分含量之差即為結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量。
[0013]所述方法中，每1.0?3.0 mL樣品液，加入50 μ moL/mL的吡啶溶液0.1?
0.5mL, 10 mg/mL 的 BTI 溶液 1.0 ?5.0 mL, 1.0 ?5.0 mL 乙臆溶液。
[0014]酸水解所用的酸優(yōu)選鹽酸、醋酸，其濃度4?8moL/L，每1.0?3.0 mL樣品液，加人 1.0 ?5.0 mL。
[0015]衍生和上柱分析使用的氨基酸衍生化試劑優(yōu)選2.4- 二硝基氟苯(DNFB)、苯異硫氰酸酯(PITC)、鄰苯二甲醛(0PA)、6-氨基喹啉-N-(羥基琥珀酰亞胺基)氨基甲酸酯(AQC)或茚三酮。
[0016]本發(fā)明的測定原理如下:根據(jù)蛋白質(zhì)或肽分子中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺經(jīng)BTI反應(yīng)后不被鹽酸水解的特點(diǎn)，借助BTI試劑保護(hù)、再經(jīng)過酸水解后測定谷氨酸含量，并與未經(jīng)BTI保護(hù)樣品中谷氨酸含量的差異，計(jì)算蛋白質(zhì)或肽分子中結(jié)合態(tài)的谷氨酰胺含量。
[0017]本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)在于:一是僅僅將蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺與BTI試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)化成對酸穩(wěn)定的DABA ； 二是不用價格較貴的Gly-Gln或Gly-Gln 二肽標(biāo)準(zhǔn)品，通過BTI保護(hù)和未保護(hù)蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過鹽酸水解后的谷氨酸測定值之差計(jì)算結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量(谷氨酸和谷氨酰胺的分子量分別為147.13和146.15)，具有快速、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的特點(diǎn)；三是目前氨基酸分析中任何一種衍生化試劑(如DNFB、PITC、OPA、AQC、或茚三酮等)均可使用，不需要考慮該衍生化試劑與DABA的匹配性，因而，其應(yīng)用更靈活和方便。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
[0019]實(shí)施例1
1.材料與試劑
LC600 二元高壓梯度高效液相色譜系統(tǒng) 北京萊伯泰科有限公司 氮吹儀北京帥恩科技有限責(zé)任公司
小麥水解蛋白(谷氨酰胺含量30.0%) 鄭州新威營養(yǎng)技術(shù)有限公司生產(chǎn) 化學(xué)試劑:均為分析純 2試劑的配制:
2.1 50 μ mol/mL吡啶溶液:取0.25 mL吡啶溶于50 mL蒸餾水中。
[0020]2.2 10 mg/mL BTI 溶液:取 0.125 g BTI 溶于 12.5 mL 乙腈中。
[0021]3測定方法
(I)樣品的溶解:取蛋白質(zhì)或其水解物0.50 g溶于100.0 mL蒸餾水中，45°C水浴中攪拌5h使之充分溶脹。
[0022](2)樣品的BTI保護(hù)處理:取1.0 mL步驟(I)樣品液，加L 5 mL BTI溶液和0.1mL吡啶溶液，于50°C水浴保溫8h以上。然后，再于60°C水浴或充氮?dú)庹舾伞?br> [0023](3)對照樣品處理(CS) -M 1.0 mL步驟(I)樣品液，加1.5 mL乙腈溶液和0.15mL吡啶溶液，于50°C水浴保溫8h以上。然后，再于60°C水浴或充氮?dú)庹舾伞?br> [0024](4)酸水解:在含有(2)、(3)樣品的消化管中加入3 mL鹽酸(4 moL/L)，封口后完全水解。再定容到10 mL、過濾。
[0025](5)衍生和上柱分析:取10 μ L步驟(4)水解液，用氨基酸衍生化試劑DNFB衍生和上柱。
[0026]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理:
分別以樣品質(zhì)量為基數(shù)，通過氨基酸色譜分析并計(jì)算，經(jīng)BTI保護(hù)樣品(TS)和對照樣品(CS)中的谷氨酸百分含量之差即為結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量。測得其結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量平均值為30.14%。
[0027]5.對照試驗(yàn)
取谷氨酰胺含量為30.0%的小麥水解蛋白粉分別用本專利方法和二肽做標(biāo)準(zhǔn)品的文獻(xiàn)方法進(jìn)行谷氨酰胺含量測定，測定結(jié)果見表1
表1本專利方法和二肽做標(biāo)準(zhǔn)品的文獻(xiàn)方法實(shí)驗(yàn)對照
【權(quán)利要求】
1.一種測定蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的方法，其特征在于:它通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)樣品的溶解:取蛋白質(zhì)或其水解物溶于蒸餾水中，45°c?55°C水浴中攪拌使之充分溶脹； (2)樣品的BTI保護(hù)處理:取步驟(I)樣品液，加雙(三氟乙酰氧基)碘苯BTI溶液和吡啶溶液，于50°C?55°C水浴保溫，然后，再于60V?80°C水浴或充氮?dú)庹舾桑? (3)對照樣品處理:取步驟(I)樣品液，加乙腈溶液和吡啶溶液，于50°C?55°C水浴保溫，然后，再于60°C?80°C水浴或充氮?dú)庹舾桑? (4)酸水解:在含有(2)、(3)樣品的消化管中加入酸，封口后完全水解，再定容、過濾； (5)衍生和上柱分析:取步驟(4)水解液，用氨基酸衍生化試劑衍生和上柱； (6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理:分別以樣品質(zhì)量為基數(shù)，通過氨基酸色譜分析并計(jì)算，BTI保護(hù)樣品和對照樣品中的谷氨酸百分含量之差即為結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的測定方法，其特征在于:每1.0?3.0 mL樣品液,加入50 μ moL/mL的批P定溶液0.1?0.5mL, 10 mg/mL的BTI溶液1.0?5.0 mL, 1.0?5.0 mL乙腈溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的測定方法，其特征在于:酸水解所用的酸優(yōu)選鹽酸或醋酸，其濃度4?8moL/L，每1.0?3.0 mL樣品液，力口人 1.0 ?5.0 mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3其中之一所述的蛋白質(zhì)或其水解物結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的測定方法，其特征在于:衍生和上柱分析使用的氨基酸衍生化試劑優(yōu)選2.4- 二硝基氟苯(DNFB)、苯異硫氰酸酯(PITC)、鄰苯二甲醛(OPA)、6-氨基喹啉-N-(羥基琥珀酰亞胺基)氨基甲酸酯(AQC)或茚三酮。
【文檔編號】G01N30/02GK103869023SQ201410131180
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】王章存, 張子峰, 張新武, 王許東 申請人:鄭州新威營養(yǎng)技術(shù)有限公司