針對elisa檢測用特異性抗體對的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一：將待篩選的至少兩個抗體分子分別標(biāo)記為標(biāo)記生物素抗體分子和標(biāo)記顯色化合物抗體分子；步驟二：檢測所述標(biāo)記生物素抗體分子和所述標(biāo)記顯色化合物抗體分子是否成功標(biāo)記；步驟三：分別將選自所述標(biāo)記生物素抗體分子中的單個標(biāo)記生物素抗體分子和選自所述標(biāo)記顯色化合物抗體分子的單個顯色化合物抗體分子兩兩配對成抗體對，針對待測抗原進行ELISA檢測，采集抗體對檢測信號；步驟四：根據(jù)所述抗體對檢測信號強弱對所述待篩選的至少兩個抗體分子對進行篩選。該方法的設(shè)計更加系統(tǒng)、全面和高效，能夠篩選出最佳抗體對，利用篩選所得抗體對建立的針對待測抗原的ELISA檢測方法具有較優(yōu)的靈敏度。
【專利說明】針對ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及生物制品檢測領(lǐng)域，具體是指一種可用于所針對待測抗原的定性及定量分析的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)利用抗原抗體能夠?qū)Ｒ恍越Y(jié)合的性質(zhì)，早期多被用于抗原定位，現(xiàn)在則多用于抗原的微量檢測。目前，基于ELISA技術(shù)的定性或定量檢測方法已經(jīng)十分成熟，并且被廣泛的應(yīng)用于各種病毒、病原菌檢測，細(xì)胞因子檢測以及生物大分子藥物的藥代動力學(xué)、免疫原性及活性檢測研究等。
[0003]酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)的基本原理是:將待測的抗原或抗體包被在孔板上，酶標(biāo)記抗體或抗原與相應(yīng)的包被抗原或抗體結(jié)合，在平板上形成免疫復(fù)合物。結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶可以與相應(yīng)底物發(fā)生顯色反應(yīng)，該顯色反應(yīng)的信號值與包被的待測抗原或抗體的量成一定比例關(guān)系，根據(jù)信號值強弱可以對待測抗原或抗體進行定性或定量分析。用于顯色反應(yīng)的酶標(biāo)記化合物可以是堿性磷酸酶、過氧化物酶，也可以是熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記等。ELISA酶促顯色反應(yīng)同樣能對信號進行放大，實現(xiàn)對待測抗原的微量檢測。
[0004]利用ELISA進行抗原檢測時，雙抗體夾心法是最常用的。其原理是首先包被捕獲抗體，接著加入待測抗原，使其與捕獲抗體形成免疫復(fù)合物，然后加入酶標(biāo)檢測抗體與待測抗原結(jié)合，此時捕獲抗體、檢測抗體與待測抗原形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。最后根據(jù)酶標(biāo)記選擇合適的方式進行顯色反應(yīng)，根據(jù)檢測信號對待測抗原進行定性或定量分析。很顯然，雙抗體夾心ELISA方法的核心是選擇合適的捕獲抗體和檢測抗體組成抗體對。這2個抗體分子除了必須滿足能夠與待測抗原特異性結(jié)合，并具有一定的親和力之外，更重要的還應(yīng)確保2個抗體分子是針對待測抗原不同的表位(抗原決定簇)，比較理想的狀態(tài)是這2個表位之間有一定的空間距離，就能保證2個抗體分子都能最大程度的與抗原分子結(jié)合，使ELISA檢測具有較靈敏的檢測限和較寬的線性范圍。
[0005]關(guān)于ELISA雙抗體夾心法檢測用抗體對的篩選技術(shù)方法的文獻(xiàn)資料并不多見，也沒有比較系統(tǒng)的報道。這部分工作的開展大多還是停留在常規(guī)的“鳥槍法”篩選的階段:比如將待篩選抗體偶聯(lián)標(biāo)記后，兩兩組合并在某固定的待測抗原濃度條件下進行ELISA檢測，考察檢測信號，并直接根據(jù)檢測信號強弱或信噪比對滿足要求的抗體對進行篩選。有時候，這種比較直觀的篩選方法也能夠篩選到一些較優(yōu)的抗體對，然而卻很可能遺失掉最優(yōu)的，因為這種篩選方法并不完備。比較系統(tǒng)和完備的抗體對篩選方法需要考慮的因素其實有很多，拋開抗體對的實際應(yīng)用環(huán)境不說，依賴于信號值強弱的整個篩選過程還需要考慮篩選時ELISA檢測條件、抗體濃度、抗原濃度(待測物)以及抗體偶聯(lián)標(biāo)記效率等。
[0006]抗體濃度需要通過歸一化的方式來消除其對信號值的影響，很顯然在相互作用未達(dá)到飽和的情況下，信號值與所加入的檢測抗體的量(濃度)成正相關(guān)，不能簡單的通過信號值的強弱來對抗體對進行選擇，還應(yīng)該考察檢測用的抗體濃度，選擇在較低作用濃度下就能得到較高信號值的抗體對。[0007]抗原(待測物)濃度在抗體對篩選過程中同樣十分重要，最好選在ELISA檢測線性段中間點的濃度，相對捕獲抗體和檢測抗體的用量均不能飽和，因為抗原(待測物)用量過高或過低會使得ELISA檢測信號值落在曲線的上平臺或下平臺區(qū)域，變化不明顯就難以通過信號值判斷抗體對的優(yōu)劣。
[0008]抗體偶聯(lián)標(biāo)記效率是另一個比較重要的關(guān)鍵因素，因為標(biāo)記效率直接影響信號強弱，即使抗體作用濃度一致，但若標(biāo)記效率相差較大，信號值的差異也會十分明顯。另一方面，標(biāo)記效率不同于抗體濃度，是很難直接表征的，一般只能通過質(zhì)譜的方法來考察每個抗體分子偶聯(lián)多少個顯色基團，事實上即使掌握了標(biāo)記效率的信息，在實際篩選過程中也是難以根據(jù)標(biāo)記效率來調(diào)整檢測抗體及捕獲抗體的用量的，除非進行多次偶聯(lián)進行偶聯(lián)效率的篩選，很顯然這種做法是不太科學(xué)的。那么如何在抗體對的篩選過程中消除偶聯(lián)標(biāo)記效率的影響也是研究人員需要解決的。
[0009]此外，抗體對篩選過程中，理論上抗體對一旦確定，因為所針對的是抗原的不同表位，這對抗體是可以互為捕獲抗體或檢測抗體的，但在檢測信號方面則可能因為上述原因或其他實驗條件而存在不同，這一點同樣需要在篩選過程中弓丨起注意。
[0010]所以，考慮到上述相關(guān)因素，提供一種能夠排除了篩選過程中捕獲/檢測抗體量、標(biāo)記偶聯(lián)效率以及待測抗原用量的干擾，使篩選過程更加全面和系統(tǒng)的ELISA檢測用抗體對的篩選方法是十分必要的，其更有利于生物大分子藥物、病毒、病原菌、細(xì)胞因子等的定性及定量ELISA檢測方法的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是為了克服ELISA雙抗體夾心檢測法檢測用抗體對篩選技術(shù)方面的缺陷和不足，針對受ELISA檢測條件、抗體濃度、抗原濃度(待測物)以及抗體偶聯(lián)標(biāo)記效率的干擾影響較大，容易出現(xiàn)選擇不全面和誤判的問題，提供了一種針對夾心法ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法。
[0012]為了實現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明提供了一種針對ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，其特點是，包括以下步驟:
[0013]步驟一:將待篩選的至少兩個抗體分子分別標(biāo)記生物素和顯色化合物，成為標(biāo)記生物素抗體分子和標(biāo)記顯色化合物抗體分子；
[0014]步驟二:檢測所述標(biāo)記生物素抗體分子和所述標(biāo)記顯色化合物抗體分子是否成功標(biāo)記；
[0015]步驟三:分別將選自所述標(biāo)記生物素抗體分子中的單個標(biāo)記生物素抗體分子和選自所述標(biāo)記顯色化合物抗體分子的單個標(biāo)記顯色化合物抗體分子兩兩配對成抗體對，利用包被親和素的ELISA板，以所述單個標(biāo)記生物素抗體分子作為捕獲抗體，所述單個標(biāo)記顯色化合物抗體分子作為檢測抗體，對待測抗原進行ELISA檢測，采集抗體對檢測信號；
[0016]步驟四:根據(jù)同一抗體分子所組成的抗體對的檢測信號不強于該抗體分子與另一抗體分子所組成的抗體對的檢測信號這一原則，根據(jù)所述抗體對檢測信號強弱對所述待篩選的至少兩個抗體分子對進行篩選。
[0017]較佳地,所述ELISA檢測包括固相反應(yīng)或液相反應(yīng)。
[0018]較佳地，所述待篩選的至少兩個抗體分子均為單克隆抗體。[0019]較佳地，所述顯色化合物為酶標(biāo)記物、熒光染料、化學(xué)發(fā)光染料以及放射性標(biāo)記中的一種。
[0020]更佳地，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記物或堿性磷酸酶標(biāo)記物。
[0021]較佳地，其特征在于，所述待測抗原包括生物大分子藥物、病毒、病原菌以及細(xì)胞因子。
[0022]較佳地，其特征在于，所述的采集抗體對檢測信號的步驟之后還包括以下步驟:
[0023]對所述的抗體對檢測信號進行歸一化處理。
[0024]本發(fā)明的有益效果具體在于:能夠排除了篩選過程中捕獲/檢測抗體量、標(biāo)記偶聯(lián)效率以及待測抗原用量的干擾，使篩選過程更加全面和系統(tǒng)?；驹碓谟?理想的抗體對應(yīng)該基于待測抗原的不同表位，并且針對不同抗原表位的抗體對進行ELISA夾心法檢測的信號值應(yīng)該不低于針對同一抗原表位的抗體分子(極端情況是同一個抗體分子)進行組合的ELISA夾心法檢測信號值。因為針對同一表位的抗體對必然存在空間位阻而影響結(jié)合效率。根據(jù)上述原理對ELISA檢測過程中使用的特異性抗體對進行篩選，使其能夠更為適用于定量ELISA檢測。
[0025]本發(fā)明還采取歸一化以及比值的方法來消除捕獲抗體/檢測抗體用量和偶聯(lián)效率對檢測結(jié)果的影響，使得歸一化后的檢測結(jié)果直接反映抗體對與待測抗原的相互作用情況，為抗體對的篩選提供依據(jù)。方法簡便而又高效。
[0026]本發(fā)明抗體對的篩選方法能夠滿足針對某特定待測抗原進行ELISA夾心法檢測時，對特異性抗體對進行篩選。該方法的設(shè)計更加系統(tǒng)、全面和高效，能夠有效的篩選出最佳抗體對，利用篩選所得抗體對所建立的針對待測抗原的ELISA檢測方法具有較優(yōu)的靈敏度及檢測范圍，能夠用于針對不同生物大分子藥物、病毒、病原菌、細(xì)胞因子等的定性和定量分析。
【具體實施方式】
[0027]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例詳細(xì)說明。
[0028]本發(fā)明的實施例的方法的具體步驟如下:
[0029]I通過免疫技術(shù)獲得若干個針對某待測抗原不同表位的抗體分子，將這些待篩選的抗體分子分別標(biāo)記生物素(Biotin)和顯色化合物(HRP)。
[0030]2利用免疫學(xué)方法檢測抗體分子是否成功標(biāo)記，選擇成功標(biāo)記的抗體分子進入后續(xù)篩選。
[0031]3將分別標(biāo)記Biotin和HRP的待篩選抗體分子進行兩兩配對，利用包被親和素的ELISA板，以標(biāo)記生物素的抗體分子為捕獲抗體，標(biāo)記顯色化合物的抗體分子為檢測抗體，對待測抗原進行ELISA檢測，采集檢測信號。在檢測過程中，針對任一對待篩選的抗體分子，ELISA檢測條件保持一致(可在同一塊96孔板上進行操作)，包括親和素包被量、抗原抗體作用環(huán)境、作用時間、顯色時間等，加入的線性范圍內(nèi)的待測抗原用量也保持一致。對檢測信號進行歸一化處理，即將檢測信號除以所用抗體分子對的作用濃度(抗體分子對的作用體積一致)，排除抗體分子對的加入量對檢測信號的影響。
[0032]4根據(jù)同一抗體分子所組成的抗體對的檢測信號不強于該抗體分子與另一抗體分子所組成抗體對的檢測信號的這一原則，利用歸一化處理后的檢測信號，對針對待測抗原的ELISA檢測用特異性抗體對進行篩選。篩選原則是:標(biāo)記Biotin和標(biāo)記HRP的抗體分子A所組成的抗體對經(jīng)歸一化處理后的檢測信號為SA，標(biāo)記Biotin和標(biāo)記HRP的抗體分子B所組成的抗體對經(jīng)歸一化處理后的檢測信號為SB，標(biāo)記Biotin的抗體分子A與標(biāo)記HRP的抗體分子B所組成的抗體對經(jīng)歸一化處理后的檢測信號為SAB，標(biāo)記Biotin的抗體分子B與標(biāo)記HRP的抗體分子A所組成的抗體對經(jīng)歸一化處理后的檢測信號為SBA，那么(SABXSBA) XSAXSB)，并且超過越多則越佳，篩選過程排除了偶聯(lián)標(biāo)記效率的影響，所得到的抗體對是與待測抗原之間具有較高的親和力。
[0033]實施例1:針對大分子蛋白藥物ELISA夾心法檢測用特異性抗體對的篩選
[0034]1.實驗?zāi)康?br> [0035]針對大分子蛋白藥物建立ELISA夾心檢測法，對該蛋白藥物進行定量分析，用于表達(dá)量檢測、PK檢測等。利用免疫小鼠雜交瘤融合技術(shù)得到6個針對該蛋白藥物的特異性抗體，分別記作Mabl、Mab2、Mab3、Mab4、Mab5、Mab6。利用該特異性抗體對的篩選方法從這6個抗體中挑選合適的抗體對，使得該ELISA夾心檢測法具有較小的檢測限和較寬的定量范圍。
[0036]2.實驗過程及結(jié)果
[0037](1)標(biāo)記偶聯(lián):
[0038]利用商品化試劑盒(氨基活化偶聯(lián)法)分別對待篩選的6個針對蛋白藥物的特異性抗體偶聯(lián)生物素(Biotin)，記作 Mabl-B、Mab2_B、Mab3_B、Mab4_B、Mab5_B、Mab6_B ;偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)，記作 Mab 1-H、Mab2_H、Mab3_H、Mab4_H、Mab5_H。
[0039](2)標(biāo)記檢測:
[0040]針對生物素標(biāo)記，取包被了親和素(Avidin)的ELISA孔板，先加入生物素偶聯(lián)的特異性抗體結(jié)合，接著加入帶HRP標(biāo)記的抗小鼠Mab的抗體進行檢測，考察這6個偶聯(lián)生物素的特異性抗體是否成功標(biāo)記，結(jié)果見表1，“ + ”越多則代表信號值越強。
[0041]針對HRP標(biāo)記，取包被了抗小鼠Mab的ELISA孔板，加入HRP標(biāo)記偶聯(lián)的特異性抗體結(jié)合，直接檢測，考察這6個偶聯(lián)HRP的特異性抗體是否成功標(biāo)記，結(jié)果見表2，同樣的“ + ”越多則代表信號值越強。
[0042]從表1和表2的結(jié)果示例，可以發(fā)現(xiàn)Mab4_B和Mab4_H的偶聯(lián)標(biāo)記檢測情況并不理想，不適合繼續(xù)后續(xù)的抗體對篩選。而其他待篩選抗體均成功偶聯(lián)生物素或HRP，但偶聯(lián)檢測信號(偶聯(lián)效率)存在差異。
[0043]表1待篩選抗體Biotin標(biāo)記檢測
[0044]
【權(quán)利要求】
1.針對ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:將待篩選的至少兩個抗體分子分別標(biāo)記生物素和顯色化合物，成為標(biāo)記生物素抗體分子和標(biāo)記顯色化合物抗體分子； 步驟二:檢測所述標(biāo)記生物素抗體分子和所述標(biāo)記顯色化合物抗體分子是否成功標(biāo)記； 步驟三:分別將選自所述標(biāo)記生物素抗體分子中的單個標(biāo)記生物素抗體分子和選自所述標(biāo)記顯色化合物抗體分子的單個標(biāo)記顯色化合物抗體分子兩兩配對成抗體對，利用包被親和素的ELISA板，以所述單個標(biāo)記生物素抗體分子作為捕獲抗體，所述單個標(biāo)記顯色化合物抗體分子作為檢測抗體，對待測抗原進行ELISA檢測，采集抗體對檢測信號； 步驟四:根據(jù)同一抗體分子所組成的抗體對的檢測信號不強于該抗體分子與另一抗體分子所組成的抗體對的檢測信號這一原則，根據(jù)所述抗體對檢測信號強弱對所述待篩選的至少兩個抗體分子對進行篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述ELISA檢測包括固相反應(yīng)或液相反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述待篩選的至少兩個抗體分子均為單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述顯色化合物為酶標(biāo)記物、熒光染料、化學(xué)發(fā)光染料以及放射性標(biāo)記中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記物或堿性磷酸酶標(biāo)記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述待測抗原包括生物大分子藥物、病毒、病原菌以及細(xì)胞因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的采集抗體對檢測信號的步驟之后還包括以下步驟: 對所述的抗體對檢測信號進行歸一化處理。
【文檔編號】G01N33/577GK103884842SQ201410133231
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】王少雄, 呂品 申請人:王少雄, 呂品