測定紫杉醇含量的時間分辨熒光免疫分析法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定紫杉醇含量的時間分辨熒光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇競爭結(jié)合抗紫杉醇的單抗，用稀土離子Eu計標記7-xylosyltaxo1-HSA復合物作為示蹤物，以增強液作為發(fā)光增強系統(tǒng)，利用間接競爭時間分辨熒光免疫分析法，測定所述樣品中的紫杉醇含量。本發(fā)明方法及試劑盒的靈敏度高，檢測范圍寬，穩(wěn)定性好，無毒性，利于樣品的快速高效檢測，具良好應(yīng)用前景。
【專利說明】測定紫杉醇含量的時間分辨熒光免疫分析法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于含量測定的化學方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種測定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時間分辨熒光免疫分析法以試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種三環(huán)二萜化合物，具有獨特的誘導微管蛋白聚合而抑制細胞分裂的抗腫瘤機制。紫杉醇在1992年被美國食品與藥物管理局(FAD)批準作為抗晚期癌癥的新藥上市,到目前為止仍然是治療乳腺癌、子宮癌、卵巢癌等癌癥的臨床一線用藥。由于紫杉醇的市場需求量不斷增大，其生產(chǎn)的主要原料紅豆杉又屬于稀缺資源，再加上它在植物中的含量極低，因此紫杉醇醫(yī)療價值和研究價值有著很大的上升潛力。
[0003]準確高效的檢測方法是紫杉醇研究中必不可少的。當前用于紫杉醇檢測的方法有薄層色譜法，毛細管電泳法，高效液相色譜，超臨界色譜法，質(zhì)譜法，生物學化學方法，其中應(yīng)用最廣泛的方法是高效液相色譜法。這些方法盡管有些具有某方面的優(yōu)勢，但總體上存在著設(shè)備投入高、操作復雜、樣品前處理復雜、時間消耗長等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的樣品預處理繁、進行大樣本測量分析時耗時長、需要使用大量有毒、昂貴的有機試劑、操作復雜、檢測范圍窄等上述缺陷，提出了一種測定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時間分辨熒光免疫分析法，采用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)，建立紫杉醇的定量分析方法。本發(fā)明方法具有操作簡便、時間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，尤其有利于大樣本或低濃度樣品的檢測。
[0005]本發(fā)明提出了一種測定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時間分辨熒光免疫分析法，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇(Paclitaxel)競爭結(jié)合一定量的抗紫杉醇的單抗；用稀土離子Eu3+標記7-xylosyltaxol-HSA復合物作為示蹤物；發(fā)光增強系統(tǒng)采用以β_ 二酮體為主的增強液；采用間接競爭時間分辨熒光免疫分析法，從而測定樣品中的紫杉醇含量。其中，所述樣品包括待測樣品或標準品。
[0006]本發(fā)明測定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時間分辨熒光免疫分析法，包括如下步驟:
[0007](I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶標板，4°C反應(yīng)過夜；
[0008](2)常溫振蕩lh，洗滌液清洗3次后，280ul/孔封閉液常溫封閉lh，清洗4次，拍干;
[0009](3)取廣州市藥檢局購得紫杉醇標準對照品，配制成溶劑為10%甲醇水的標準品，每孔加入 25ul 標準品，濃度分別為 0ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml,400ng/ml、，每個濃度3孔。再加入以稀釋緩沖液1: 2000倍稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300倍稀釋的標記抗原復合物，貼封膜，于常溫下振蕩反應(yīng)Ih;[0010](4)反應(yīng)結(jié)束后，清洗6次，拍干，加入增強液200ul (該增強液采購于廣州市達瑞抗體工程技術(shù)有限公司；成分包括:冰醋酸、鄰苯二甲酸氫鉀、Triton X-100、TOPO、β-NTA、純化水)，振蕩5min后，用熒光免疫分析儀Victor 1420測定其熒光信號。
[0011](5)根據(jù)熒光值，建立標準曲線。
[0012]以紫杉醇的標準品建立TRFIA的標準曲線。
[0013]以上步驟(3)中以同樣方法配制待測樣品，經(jīng)檢測，在步驟(5)中測得待測樣品中的紫杉醇含量。
[0014]7-xylosyltaxol-HSA 復合物的制備:在 lmll0mg/mlNa104 溶液中，加入 0.5ml 溶解7-xylosyltaxol5.0mg的甲醇溶液,室溫避光攪拌反應(yīng)lh。將反應(yīng)混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)中，用lmol/L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)至pH9左右，攪拌12h，對水透析5次。
[0015]銪標記抗原結(jié)合物的制備:將合成的7-xylosyltaxol-HSA復合物用標記緩沖液來純化、濃縮，再比例加入Eu-DTTA(抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混勻后放入室溫孵育16-20小時后，緩慢加入純化柱內(nèi)，然后換成洗脫緩沖液對樣品進行洗脫，待蛋白檢測儀顯示出現(xiàn)蛋白峰時，開始收集樣品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分裝，部分于_20°C保存，部分于4°C備用。
[0016]其中，所述增強液由南方醫(yī)科大學抗體技術(shù)研究中心提供；成分:冰醋酸、鄰苯二甲酸氫鉀、Triton X-100、T0P0、β-NTA、純化水。增強液是以β-二酮體為主的增強液。
[0017]其中，所述方法以稀土離子EU3+標記7-xylosyltaxol-HSA復合物作為示蹤物,并用增強-解離系統(tǒng)擴大熒光信號。
[0018]其中，所述方法的檢測靈敏度為0.004ug/ml。
[0019]其中，所述方法的含量檢測范圍為5_400g/ml。
[0020]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，用于進行本發(fā)明測定紫杉醇含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其包括酶標包被板，標準品，抗紫杉醇單克隆抗體，銪標記復合物，洗漆液，稀釋液以及增強液。利用本發(fā)明試劑盒，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇競爭結(jié)合抗紫杉醇的單抗，用稀土離子EU3+標記7-xylosyltaxol-HSA復合物作為示蹤物，以增強液作為發(fā)光增強系統(tǒng)，利用間接競爭時間分辨熒光免疫分析法，測定所述樣品中的紫杉醇含量。
[0021 ] 本發(fā)明試劑盒中，所述標準品溶液的濃度分別為Ong/ml、5ng/ml, 15ng/ml, 50ng/ml, 150ng/ml,400ng/ml,加樣量25ul/孔；所述抗紫杉醇單克隆抗體在測定前以稀釋液稀釋2000倍，所述銪標記復合物在測定前以稀釋液稀釋300倍，按先后順序分別加入IOOul/孔；所述增強液的加液量為200ul/孔。
[0022]本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的改進包括:用三價稀土離子及其鰲合物作為示蹤物，并用增強-解離系統(tǒng)擴大熒光信號，利用單克隆抗體技術(shù)制造出抗紫杉醇單克隆抗體，使得免疫熒光分析方法應(yīng)用于中藥成分的含量測定。本發(fā)明中采用現(xiàn)有技術(shù)來制備抗紫杉醇單克隆抗體以及制備紫杉醇與人血清白蛋白復合物。
[0023]區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明分析法包括了解離增強步驟和熒光檢測環(huán)節(jié)。
[0024]本發(fā)明分析法中包括的解離增強步驟:現(xiàn)有技術(shù)中的解離增強鑭系元素熒光免疫分析(DELFIA)是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪(Eu)連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復合物。但由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此，在本發(fā)明方法中采用解離-增強步驟，通過加入一種增強劑，使Eu從復合物上解離下來，解離下來的自由Eu同增強劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。
[0025]本發(fā)明分析方法中包括的熒光檢測環(huán)節(jié):普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在選擇熒光物質(zhì)作為標記物時，必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的波長差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊,相互干擾,影響檢測結(jié)果的準確性。而本發(fā)明中的熒光檢測環(huán)節(jié)，鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移,最大可達290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜問不會相互重疊，加上其發(fā)射的光譜信號峰很窄，熒光壽命長，銪的熒光壽命可達730us，檢測中只要在每個激發(fā)光脈沖過后采用延緩測量時間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開取樣門儀器記錄長壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高本發(fā)明方法的檢測精密度。TRFIA的測量儀器是時間分辨熒光計，由三大部分組成:光源:脈沖光源:氙燈(每秒閃爍1000次)；小型N2激光器；輸出脈沖波長:337nm突光信號獲取系統(tǒng)。
[0026]本發(fā)明方法中，以三價銪離子為示蹤物，標記結(jié)合7-xylosyltaxol-HSA復合物，結(jié)合抗紫杉醇單克隆抗體后，經(jīng)過解離-增強步驟，測定熒光值。TRFIA法用稀土元素離子Eu3+作為示蹤物，以其熒光壽命長，激發(fā)譜帶寬而發(fā)射光譜很窄等特點排除非特異性熒光的干擾，具有較高的靈敏度和準確性。至目前為止，尚未見有文獻報道如本發(fā)明的利用時間分辨熒光免疫分析方法來測定紫杉醇含量的先例及相應(yīng)的試劑盒。
[0027]本發(fā)明分析法及試劑盒具有較高的靈敏度和較寬的檢測范圍:圖1表示使用單克隆抗體的紫杉醇含量測定的TRFIA標準曲線，本發(fā)明方法測定紫杉醇含量的靈敏度為
0.004ug/ml，在確保線性良好又有較好的檢測結(jié)果的情況下，確定本方法的含量檢測范圍為5-400ng/ml。而現(xiàn)有文獻高效液相色譜法的紫杉醇的檢測下限為較低的8ug左右。本發(fā)明方法的靈敏度是高效液相色譜法的近2000倍。顯然本方法更為敏感，且檢測范圍更寬。
[0028]本發(fā)明分析法及試劑盒具有同樣的準確性:Chao等比較了高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法得到的結(jié)果之間的相關(guān)性，其研究證明，兩檢測系統(tǒng)測定紫杉醇濃度的相關(guān)性系數(shù)r = 0.999。本發(fā)明方法研究者研究了建立的時間分辨熒光免疫分析法和已報道的酶聯(lián)免疫吸附法測定各個紅豆杉樣品的紫杉醇的含量的相關(guān)性。圖2表示，同樣提取方法下，比較ELISA法和TRFIA法的含量測定結(jié)果的相關(guān)性，r2 = 0.9972。表明，本發(fā)明建立的TRFIA分析法與HPLC法、ELISA法有同樣的準確性。
[0029]本發(fā)明有益效果包括:(I)零背景、高特異性:利用斕系元素極長的熒光衰退時間這一特點，激發(fā)后以固定時間檢測熒光，在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減消失，從而通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，可以避免本底熒光干擾，提高檢測的精密度。利用斕系元素發(fā)射光與激發(fā)光波長問巨大的Strokes位移這一熒光重要特征。(2)靈敏度高:解離一增強使熒光性大大提高近百萬倍，此步驟加入一種增強劑，使Eu從復合物上解離下來，自由Eu同增強劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。(3)高穩(wěn)定性、高精確度:低分子量原子標記，不影響被標記物的空間立體結(jié)構(gòu)，保證其穩(wěn)定性。且衰變壽命較長、受環(huán)境影響小。標記粒子的鰲合物穩(wěn)定性強，產(chǎn)生的熒光強度高，又使其靈敏度高、重復性更好、線性范圍更寬。時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩(wěn)定穩(wěn)定可達一年以上。例如在具體實施中，本發(fā)明方法的靈敏度為0.004ug/ml，設(shè)定其檢測范圍為5?400ng/ml，批內(nèi)CV平均值為7.98%，批問CV為7.76%。平均回收率為107.7%，相關(guān)系數(shù)為0.992。
[0030]本發(fā)明分析法(TRFDWi)與HPLC法比較，其取樣量少，前處理簡單，并可在同一塊板上同時測定40多個樣品。樣品的提取時用少量甲醇，測定過程不需有機溶劑，毒性小，對人體的健康和環(huán)境影響小，節(jié)省人力、物力。本發(fā)明分析法與ELISA法相比，用稀土元素離子Eu3+作為示蹤物，以其熒光壽命長，激發(fā)譜帶寬而發(fā)射光譜很窄等特點排除非特異性熒光的干擾，具有較高的靈敏度和準確性。傳統(tǒng)的紫杉醇的含量檢測方法包括薄層掃描色譜法、高效液相色譜法等。高效液相色譜法要求的樣品預處理繁瑣，精度要求高，進行大樣本測量分析時耗時長，需要使用大量有毒、昂貴的有機試劑。相對于傳統(tǒng)的測定方法，本發(fā)明方法利用單克隆抗體技術(shù)和熒光免疫分析技術(shù)，簡化樣品前處理操作，減少有機試劑的使用，降低對環(huán)境和人體健康的的危害；大大提高測定方法的靈敏度；同時可進行多個樣本的測定。
[0031]本發(fā)明提供了紫杉醇單克隆抗體的制備及使用該單抗建立起的用于紫杉醇檢測的間接競爭TRFIA方法。相對于傳統(tǒng)的測定方法，本發(fā)明TRFIA利用單克隆抗體技術(shù)和熒光免疫分析技術(shù)，簡化樣品前處理操作，減少有機試劑的使用，降低對環(huán)境和人體健康的的危害；大大提高測定方法的靈敏度；同時可進行多個樣本的測定。TRFIA多用于臨床生化指標和病原微生物的檢測，目前，尚未見其在中藥成分含量測定上的應(yīng)用。本發(fā)明中，用三價稀土離子及其鰲合物作為示蹤物代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學發(fā)光物質(zhì)標記蛋白質(zhì)、多肽，激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞；當反應(yīng)體系發(fā)生后，如抗原抗體免疫反應(yīng)，革巴細胞和效應(yīng)細胞的殺傷反應(yīng)，核酸探針雜交反應(yīng)等發(fā)生后，用時間分辨熒光儀測定最后產(chǎn)物的熒光強度根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的。相較于酶聯(lián)免疫吸附法的酶標記物不穩(wěn)定性，熒光衰變周期短。本發(fā)明分析法(TRFIA法)用稀土元素離子Eu3+作為示蹤物，以其熒光壽命長，激發(fā)譜帶寬而發(fā)射光譜很窄等特點排除非特異性熒光的干擾，具有較高的靈敏度和準確性。本發(fā)明方法的靈敏度高，檢測范圍寬，穩(wěn)定性好，無毒性，尤其利于大樣本的檢測時快速、高效，極為良好的廣泛應(yīng)用價值。此外，我國有豐富稀土元素資源，本發(fā)明方法具有穩(wěn)定性好的同時又合理利用了稀土元素資源。至今尚未見有文獻報道本發(fā)明方法用于中藥材成分測定領(lǐng)域。在中藥材成分測定領(lǐng)域的應(yīng)用中，本發(fā)明方法可成為一種行之有效的新方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1表示本發(fā)明分析法測定紫杉醇的標準曲線。
[0033]圖2表示本發(fā)明分析法和ELISA法測定紅豆杉中紫杉醇含量的相關(guān)性。
【具體實施方式】
[0034]結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0035]實驗儀器和試劑:96孔酶標反應(yīng)板(丹麥Nunc);半自動VICT0R?1420熒光檢測儀(PerkinElmer產(chǎn)品)；紫杉醇(Paclitaxel)標準品(中國藥品生物制品檢定所)；人血清白蛋白(HSA)(美國Sigma公司);兔抗鼠IgG(Rockland公司);銪離子標記HAS-Paclitaxel復合物；小鼠抗Paclitaxel單克隆抗體(自制)；增強液，洗漆液來自南方醫(yī)科大學抗體技術(shù)研究中心；紫杉醇藥材樣品來自各藥店；其它試劑:蒸餾水，甲醇等為國產(chǎn)分析純。
[0036]本發(fā)明提出的測定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時間分辨熒光免疫分析法，是以兔抗鼠IgG包被96孔酶標反應(yīng)板，與樣品或標準品中的紫杉醇競爭結(jié)合一定量的抗紫杉醇的單抗；用稀土離子EU3+標記7-xylosyltaxol-HSA復合物作為示蹤物,采用以β - 二酮體為主的增強液作為發(fā)光增強系統(tǒng)，利用間接競爭TRFIA法測定紅豆杉藥材中紫杉醇的含量。
[0037]本發(fā)明測定紫杉醇(Paclitaxel)含量的時間分辨熒光免疫分析法，方法建立的基本步驟:
[0038](I)以4ug/ml兔抗鼠IgGlOOul/孔包被96孔酶標板，4°C反應(yīng)過夜；
[0039](2)常溫振蕩lh，洗滌液清洗3次后，280ul/孔封閉液常溫封閉lh，清洗4次，拍干;
[0040](3)取廣州市藥檢局購得紫杉醇標準對照品，配制成溶劑為10%甲醇水的標準品，每孔加入 25ul 標準品，濃度分別為 0ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml,400ng/ml、，每個濃度3孔。再加入以稀釋緩沖液1: 2000倍稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300倍稀釋的標記抗原復合物，貼封膜，于常溫下振蕩反應(yīng)Ih;
[0041]其中，稀釋緩沖液由南方醫(yī)科大學抗體技術(shù)研究中心提供；成分:Tris-base、DTPA、NaCl、Tween-20、BSA、ProClin300、Bovine gamma globulin、PHloxine B?？棺仙即荚碥諉慰寺】贵w溶液是以稀釋液稀釋后的抗紫杉醇單克隆抗體溶液。其中，標記抗原復合物是以3價銪離子標記的已合成的7-木糖基紫杉醇和人血清白蛋白復合物。
[0042](4)反應(yīng)結(jié)束后，清洗6次，拍干，加入增強液(由南方醫(yī)科大學抗體技術(shù)研究中心提供；成分:冰醋酸、鄰苯二甲酸氫鉀、Triton Χ-100、Τ0Ρ0、β-ΝΤΑ、純化水)200ul，振蕩5min后，用熒光免疫分析儀Victor 1420測定其熒光信號。
[0043](5)根據(jù)熒光值，建立標準曲線。
[0044]以紫杉醇的標準品建立TRFIA的標準曲線，見圖1。
[0045]在上述步驟(2)中，在每孔加入25ul待測樣品，其他步驟及條件相同，則測得待測樣品的熒光值。
[0046]7-xylosyltaxol-HSA 復合物的制備:
[0047]在lmll0mg/mlNal04 溶液中，加入 0.5ml 溶解 Paclitaxel5.0mg 的甲醇溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)lh。將反應(yīng)混合物加至lml5mg/ml的HSA溶液(50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)中，用lmol/L的Na2C03溶液調(diào)節(jié)至pH9左右，攪拌12h，對水透析5次。
[0048]銪標記抗原結(jié)合物的制備:
[0049]將合成的7-xylosyltaxol-HSA復合物用標記緩沖液來純化、濃縮，再比例加入Eu-DTTA (抗原:Eu-DTTA = 2: I)，充分混勻后放入室溫孵育16-20小時后，緩慢加入純化柱內(nèi)，然后換成洗脫緩沖液對樣品進行洗脫，待蛋白檢測儀顯示出現(xiàn)蛋白峰時，開始收集樣品，1.5ml/管，加BSA溶液至含量0.1 %。分裝，部分于_20°C保存，部分于4°C備用。
[0050]對于間接競爭法標記免疫分析，1g-1ogit數(shù)學模型的計算方法相對簡單，且大多數(shù)情況下可以得到較好相關(guān)性，因此是評價這類試劑盒的首選數(shù)學模型。方程式:1gitY = A+B*log X，式中:1git Y = B/B0/(1-B/B0)，同時，曲線最高濃度點和最低濃度點之間，使曲線在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)有足夠的落差，即結(jié)合率(Β/Β0%)為25% (或20%)所對應(yīng)的劑量濃度點應(yīng)小于曲線最高劑量點，結(jié)合率為75%或(80% )所對應(yīng)的劑量濃度點應(yīng)大于曲線最低劑量點。本發(fā)明分析方法中，以紫杉醇的標準品建立TRFIA的標準曲線利用間接競爭法測定樣品中的紫杉醇的熒光值，經(jīng)1g-1ogit函數(shù)處理得標準曲線見圖1。間接競爭法測定紫杉醇的突光值，經(jīng)1g-1ogit函數(shù)處理得標準曲線見圖1。1gitY = ln[Y/(1-Y)]，Y = B/B0, B0為零濃度點的的熒光值。在測量范圍5-400ng/ml問相關(guān)系數(shù)R2 =
0.992，實驗結(jié)果表明標準曲線量很高。
[0051]實施例1測定不同種紅豆杉不同部位紫杉醇的含量
[0052]樣品前處理:將采得的紅豆杉分別取莖皮和葉，烘干，分別粉碎，過四號篩，精密稱取50mg,加入1ml甲醇,超聲處理10分鐘，10000r/min離心10min,取上清液,重復3次,合并上清液待溶劑揮干，用甲醇將提取物溶解轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶定容。將其適當稀釋成含20%甲醇的溶液，進行檢測。
[0053]實驗方法:測定時，取出包被好的酶反應(yīng)板，每孔加入25ul標準品/樣本，復孔加樣。再加入以稀釋緩沖液1: 2000稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300稀釋的標記抗原復合物于常溫下振蕩反應(yīng)Ih ;反應(yīng)結(jié)束后，清洗6次，加入增強液200ul，振蕩5min后，用Victorl420測定其熒光信號，取得樣品濃度。實驗結(jié)果見表3。
[0054]表3TRFIA法測定紅豆杉樣品中的紫杉醇的含量
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種測定紫杉醇含量的時間分辨熒光免疫分析法，其特征在于，以兔抗鼠IgG包被96孔酶標反應(yīng)板，與樣品中的紫杉醇競爭結(jié)合抗紫杉醇的單抗，用稀土離子Eu3+標記7-xylosyltaxol-HSA復合物作為示蹤物，以增強液作為發(fā)光增強系統(tǒng)，利用間接競爭時間分辨熒光免疫分析法，測定所述樣品中的紫杉醇含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以兔抗鼠IgG包被96孔酶標板，4°C反應(yīng)過夜； (2)常溫振蕩，洗滌液清洗，常溫封閉，清洗，拍干； (3)配制紫杉醇標準品或待測樣品，溶劑為10%甲醇水，每孔加入標準品或待測樣品，濃度分別為 Ong/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150ng/ml, 400ng/ml ;再加入以稀釋緩沖液I: 2000倍稀釋的抗紫杉醇皂苷單克隆抗體溶液和1: 300倍稀釋的標記抗原復合物，貼封膜，常溫下振蕩反應(yīng)； (4)清洗，拍干，加入增強液，振蕩后，用熒光免疫分析儀VictOrl420測定其熒光信號； (5)測得標準品的熒光值，建立標準曲線；測得待測樣品的熒光值即得為樣品的紫杉醇含量。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法以稀土離子Eu3+標記7-xylosyltaxol-HSA復合物作為示蹤物，并用增強-解離系統(tǒng)擴大熒光信號。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測靈敏度為0.004ug/ml。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的含量檢測范圍為5-400ng/ml ο
6.一種試劑盒，用于測定紫杉醇含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于，包括酶標包被板，標準品，抗紫杉醇單克隆抗體，銪標記復合物，洗滌液，稀釋液以及增強液。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于,所述標準品的濃度分別為0ng/ml、5ng/ml, 15ng/ml, 50ng/ml, 150ng/ml, 400ng/ml,加樣量25ul/孔；所述抗紫杉醇單克隆抗體在測定前以稀釋液稀釋2000倍，所述銪標記復合物在測定前以稀釋液稀釋300倍，按先后順序分別加入IOOul/孔；所述增強液的加液量為200ul/孔。
【文檔編號】G01N33/15GK103884843SQ201410134000
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】晁志, 崔倩 申請人:南方醫(yī)科大學