一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備方法，屬于生物傳感器制備【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明是在經(jīng)過清洗、活化和性能測(cè)試的裸玻碳電極表面滴涂鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，然后用空殼納米金進(jìn)行修飾，再在修飾后的電極上固定毒死蜱單克隆抗體，最后用牛血清蛋白封閉。本發(fā)明制備的免疫傳感器具有靈敏度高，成本低，檢測(cè)速度快，穩(wěn)定性好，且樣品回收率高的特點(diǎn)。本發(fā)明制備的免疫傳感器的檢測(cè)限可達(dá)0.052ng/L，線性范圍為5ng/mL-2μg/mL，回收率可達(dá)82.0%-118.0%，適用于果蔬中毒死蜱殘留量的快速檢測(cè)。
【專利說明】—種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)發(fā)展對(duì)國民經(jīng)濟(jì)以及人民生活有著舉足輕重的作用。農(nóng)藥是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用于防治病、蟲、雜草對(duì)農(nóng)作物危害不可缺少的物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有著重要的作用。但是，農(nóng)藥的不合理使用，不僅造成了水環(huán)境、土壤、大氣的污染，也導(dǎo)致了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，引起人體中毒以及貿(mào)易壁壘。此外，我國每年因農(nóng)藥殘留超標(biāo)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。隨著我國人民生活水平不斷提高，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題越來越受到關(guān)注，尤其果品、蔬菜中農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)前，我國生產(chǎn)和使用的殺蟲劑絕大多數(shù)為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，其中毒死蜱是目前全世界生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲劑品種之一。毒死蜱是高效中毒的廣譜殺蟲劑兼除草劑，具有一定的內(nèi)吸性，可以通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移至人體，對(duì)人體具有潛在致癌作用，因此，毒死蜱一直是環(huán)境和食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重要項(xiàng)目?？梢?，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境，尤其是保障人類健康有著十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003]傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有:光譜法(紅外光譜法、熒光光譜法、紫外-可見光、化學(xué)發(fā)光法等)、色譜法(氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、高效液相色譜(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、酶聯(lián)免疫(ELISA)等。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低，可同時(shí)檢測(cè)多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品前處理過程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并且對(duì)分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。常用的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法有酶抑制法(酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較好的實(shí)用價(jià)值。但是，速測(cè)卡是通過肉眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜樣品的定性測(cè)量。酶抑制分光光度法的原理是基于吸光度的變化進(jìn)行檢測(cè)的，但蔬菜水果中大量的色素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。此外，上述方法存在回收率低、錯(cuò)檢、漏檢比例較高、重復(fù)性差、難以滿足低殘留和定量檢測(cè)的要求等缺點(diǎn)。免疫傳感器是基于抗原和抗體特異性結(jié)合所引發(fā)的免疫反應(yīng)的原理所研制的傳感器，與傳統(tǒng)的分析方法相比，它具有特異性強(qiáng)、分析速度快、結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。免疫傳感器的關(guān)鍵是敏感界面的構(gòu)建，其直接影響生物分子的固定化、免疫傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性等主要性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法。采取的技術(shù)方案為:
一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，是在經(jīng)過清洗、活化和性能測(cè)試的裸玻碳電極表面滴涂鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，然后再用空殼納米金進(jìn)行修飾，再在修飾后的電極上固定毒死蜱單克隆抗體，最后用牛血清蛋白封閉，得到檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器。
[0005]所述方法的步驟如下:
1)清洗、活化并測(cè)試裸玻碳電極，獲得預(yù)處理玻碳電極；
2)制備鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液；
3)將步驟2)制備的鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液滴涂到步驟I)的預(yù)處理玻碳電極上，分散均勻后，利用空殼納米金進(jìn)行修飾，得到修飾電極；
3)在步驟3)所得的修飾電極上固定毒死蜱的單克隆抗體，獲得固定電極；
4)用牛血清蛋白封閉步驟4)所得的固定電極，得到毒死蜱免疫傳感器。
[0006]所述方法步驟I)所述清洗、活化并測(cè)試裸玻碳電極是利用熱piranha溶液浸泡裸玻碳電極后，用Al2O3漿拋光，再依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗,干燥后用循環(huán)伏安法活化，并通過檢測(cè)金電極循環(huán)伏安曲線峰電位差測(cè)試金電極。
[0007]所述方法步驟2)所述制備鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，是采用Hummers方法制備氧化石墨，在用混合堿液溶解氧化石墨后超聲處理，在加入到含有硝酸鎳和硝酸鋁的鹽溶液中制備懸池液，調(diào)節(jié)pH至10.5后,60 C下晶化6h,晶化完畢后，加熱到83 C加入硫化納溶液，回流4h后冷卻，用去離子水洗滌三次后60°C下干燥24h，最后用殼聚糖-醋酸溶液溶解，并超聲分散均勻后，得到鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液。
[0008]所述方法步驟3)所述在預(yù)處理電極表面上滴涂鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，是取6 μ L分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液滴涂在電極表面，常溫下3h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞?br> [0009]所述方法步驟3)所述利用空殼納米金修飾，是指取6 μ L空殼納米金溶液滴涂在電極上，26°C下靜置2h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈伞?br> [0010]所述方法步驟4)所述固定毒死蜱的單克隆抗體，是將修飾電極浸入5%的戊二醛溶液中，30min后取出，沖洗吹干，沉浸在毒死蜱單克隆抗體溶液中，4° C條件下浸泡8h，取出后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，晾干待用。
[0011]所述方法步驟5)所述用牛血清蛋白封閉固定電極，是指將固定電極浸入0.5%的牛血清蛋白(BSA)溶液中26°C下靜置2h。
[0012]所述方法的具體步驟如下:
O利用熱piranha溶液浸泡裸玻碳電極后,用Al2O3衆(zhòng)拋光,再依次用去離子水、ΗΝ03、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環(huán)伏安法活化，并通過檢測(cè)金電極循環(huán)伏安曲線峰電位差測(cè)試金電極，獲得預(yù)處理電極；
2)采用Hummers方法制備氧化石墨，在用混合堿液溶解氧化石墨后超聲處理，在加入到含有硝酸鎳和硝酸鋁的鹽溶液中制備懸濁液，調(diào)節(jié)PH至10.5后，60°C下晶化6h，晶化完畢后，加熱到83°C加入硫化鈉溶液，回流4h后冷卻，用去離子水洗滌三次后60°C下干燥24h，最后用殼聚糖-醋酸溶液溶解，并超聲分散均勻后，得到鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液；
3)取6μ L分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液滴涂在步驟I)所得預(yù)處理電極表面，常溫下3h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈?，再? μ L空殼納米金溶液滴涂在電極上，26°C下靜置2h，然后用pH7.5的PBS沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈珊蟮玫叫揎楇姌O； 4)將步驟3)所得修飾電極浸入5%的戊二醛溶液中，30min后取出，沖洗吹干，沉浸在毒死蜱單克隆抗體溶液中，4° C條件下浸泡8h，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，獲得固定電極；
5)將步驟4)所得固定電極浸入0.5%的BSA溶液中室溫下靜置2h。
[0013]所述一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備，其特征在于:免疫傳感器的敏感界面組成包括鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合膜和空殼納米金，進(jìn)而固定抗毒死蜱的單克隆抗體。
[0014]所述一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備，其特征在于:玻碳電極(d=3mm)的清洗，免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建及過程表征(制備鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合材料及空殼納米金材料并以殼聚糖作為分散劑進(jìn)行分散，利用鎳鋁水滑石-石墨烯及空殼納米金的協(xié)同作用共同修飾電極)，免疫傳感器工作曲線的建立，免疫傳感器性能的檢測(cè)，免疫傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0015]所述一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備，其特征在于:實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要包括抗體濃度、測(cè)試底液PH以及孵育時(shí)間；所制備的免疫傳感器的工作曲線為:%ΛΙ =-7 +14.932 LgC (ng/mL) (R2=0.9913，5-150 ng/mL), % Δ I = -57.544 + 38.724 LgC (ng/mL)(R2=0.9926，150-2000 ng/mL);免疫傳感器性能檢測(cè)包括特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、再生性以及免疫傳感器對(duì)蔬菜樣品回收率的測(cè)定。
[0016]其制備原理為:免疫傳感器以免疫生物分子作為識(shí)別元件，通過固定化技術(shù)將免疫蛋白結(jié)合到感受器表面，發(fā)生免疫識(shí)別反應(yīng)后，生成的免疫復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為與待測(cè)物質(zhì)濃度(或活度)有關(guān)的可定量或者可處理的物理化學(xué)信號(hào)，再經(jīng)過二次儀表放大并且輸出信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明采用以殼聚糖作為分散劑制備的鎳鋁水滑石-石墨烯和空殼納米金對(duì)玻碳電極進(jìn)行修飾。鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合材料，通過傳統(tǒng)的共沉淀方法在氧化石墨模板上生長鎳鋁水滑石再經(jīng)過還原制備鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合材料。水滑石是一種陰離子型類似于氫氧化物的多功能納米材料，層間陰離子的種類及數(shù)量具有可調(diào)控性，石墨烯作為二維基底提高電子傳導(dǎo)速率、增大電極傳導(dǎo)面積和維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合材料表現(xiàn)出優(yōu)良的電化學(xué)性能。殼聚糖(CS)屬于多糖類，它具有優(yōu)異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜后具有很好的吸附性、穩(wěn)定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結(jié)構(gòu)使它被廣泛用于生物分子的固定和修飾電極的制備。殼聚糖的氨基端通過金氨鍵連接空殼納米金，其擁有良好的生物兼容性，可作為抗體的固定載體，為抗體在電極表面的固定提供了一個(gè)良好的生物界面，保持了抗體的生物活性以用來和農(nóng)藥進(jìn)行有效的特異性結(jié)合。此外，空殼納米金具有較高的比表面積，且穩(wěn)定性好、密度小、成本低，作為微小的導(dǎo)電中心，充分暴露活性位點(diǎn)，內(nèi)外殼之間存在著電勢(shì)差，可促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，進(jìn)而增大免疫傳感器的響應(yīng)電流。采用本發(fā)明制成的免疫傳感器可以在蔬果采收、上市前，進(jìn)行農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，避免因食用含有殘留農(nóng)藥的蔬果而引起中毒，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。
[0017]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備，其特征在于:(I)免疫傳感器制備前裸玻碳電極的清洗、活化和性能測(cè)試，如果測(cè)試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在120mV以下，氧化峰和還原峰對(duì)稱，則所述玻碳電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗好的裸玻碳電極表面滴涂分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，繼而修飾空殼納米金，然后固定毒死蜱單克隆抗體，最后用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。免疫傳感器制備結(jié)束后，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0018]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備，其特征在于:(I)將上述制備好的免疫傳感器在工作底液中以不同的掃速做循環(huán)伏安方法掃描，可以得到峰值和掃速的關(guān)系，得到是受擴(kuò)散控制的。(2)配置一系列的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到抑制率，進(jìn)一步得出上述制備的免疫傳感器的工作曲線、檢測(cè)范圍和檢測(cè)限；(3)配置一系列經(jīng)?；旌鲜褂玫霓r(nóng)藥溶液，以檢測(cè)所制備免疫傳感器的選擇性；(4;通過循環(huán)伏安掃描多段并且于冰箱中放置一段時(shí)間再次測(cè)量驗(yàn)證上述免疫傳感器的穩(wěn)定性，通過解離和再次免疫檢測(cè)其再生性能；(5)對(duì)實(shí)際果蔬樣品進(jìn)行分析得出該免疫傳感器的回收率。
[0019]本發(fā)明采用傳統(tǒng)的共沉淀方法在氧化石墨模板上生長鎳鋁水滑石再經(jīng)過還原制備鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合材料，再以具有良好生物相容性和成膜性的殼聚糖作為分散劑進(jìn)行分散，得到的納米復(fù)合物膜能夠促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，提高電極上的響應(yīng)電流，用以制備響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)和靈敏度高的免疫傳感器；具有大量氨基的納米復(fù)合膜與空殼納米金形成的金氨體系具有較高的穩(wěn)定性和高度有序性，增大免疫傳感器的電流響應(yīng)，并且改善電極表面的微環(huán)境，作為載體材料通過戊二醛共價(jià)交聯(lián)抗體，提高了傳感器表面抗體的有效固定，從而增大了檢測(cè)精度。
[0020]所述免疫傳感器的制備工藝如下:(I)取6μ L分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合膜滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極表面，常溫下靜置3h，用pH7.5的PBS沖洗電極表面；
(2)電極表面晾干后，取6 μ L空殼納米金滴涂在電極表面，常溫下靜置2h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈桑?3)將上述經(jīng)納米材料修飾好的電極浸入5%的戊二醛溶液中，30min后取出，用pH7.5的PBS沖洗吹干，沉浸在毒死蜱單克隆抗體溶液中，4° C條件下浸泡8h,取出后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面；(4)最后將上述制備好的電極浸于0.5%的BSA溶液中，室溫下靜置2h，進(jìn)而封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，免疫傳感器制作完成，保存在4° C條件下備用。
[0021]本發(fā)明的有益效果:
首先，本發(fā)明引入了一種超級(jí)電容器電極材料:鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合物，以石墨烯作為基底材料生長鎳鋁水滑石，有效地提高了導(dǎo)電性及電容，該納米復(fù)合材料與空殼納米金協(xié)同修飾電極，顯著地增強(qiáng)了信號(hào)響應(yīng)；
其次，本發(fā)明制備的免疫傳感器檢測(cè)范圍較寬，線性范圍為5ng/mL-150ng/ mL和150ng/mL-2 μ g/mL,檢測(cè)限較低，達(dá)到0.052ng/mL。以毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)比，檢測(cè)加入干擾物的混合農(nóng)藥溶液，檢測(cè)結(jié)果沒有明顯變化，可忽略不計(jì)，特異性良好。對(duì)制備好的免疫傳感器保存三周后檢測(cè)，其電流響應(yīng)仍可保持在初始電流的82%以上，穩(wěn)定性良好，且該免疫傳感器可有效地復(fù)活5次，再生性較好；
第三，本發(fā)明所制備的免疫傳感器的檢測(cè)結(jié)果與氣相色譜法的檢測(cè)結(jié)果一致，可作為蔬菜上市前農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的輔助手段。
【專利附圖】

【附圖說明】[0022]圖1氧化石墨、鎳鋁水滑石和鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物的傅立葉變換紅外光譜圖。
[0023]圖2空殼納米金的透射電鏡圖。
[0024]圖3鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物和空殼納米金的掃描電鏡圖；
(a，低倍率下鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物的掃描電鏡圖；b，高倍率下鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物的掃描電鏡圖，空殼納米金掃描電鏡圖)。
[0025]圖4玻碳電極修飾過程的循環(huán)伏安圖；
(a，玻碳電極；b，鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物修飾后的電極；c，空殼納米金修飾后的電極；d，固定抗體后的電極；e，牛血清白蛋白封閉后的電極；f，孵育農(nóng)藥后的電極)。
[0026]圖5免疫傳感器的工作曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液的制備
采用Hmnmers方法制備氧化石墨。具體的工藝流程:在冰水浴中裝配好250mL的反應(yīng)瓶，加入Ig石墨粉、Ig硝酸鈉和46mL硫酸，攪拌30min，再分次加入5g高錳酸鉀，控制反應(yīng)溫度不超過20°C，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，然后升溫至35°C左右，繼續(xù)攪拌30min，再緩慢加入80mL去離子水，續(xù)拌20min后，加入6mL30%的雙氧水還原殘留的氧化劑，使溶液變?yōu)榱咙S色。趁熱過濾，并用5%HC1溶液和去離子水洗滌直到濾液中無硫酸根被檢測(cè)到為止。最后將濾餅置于60°C的真空干燥箱中充分干燥，即得氧化石墨。30mg氧化石墨加入50mL含有氫氧化鈉(0.2M)和無水碳酸鈉(0.05M)的混合堿溶液里超聲30min，在室溫劇烈攪拌下加入50mL含有硝酸鎳(0.075M)和硝酸鋁(0.025M)的鹽溶液得到懸浮液。0.2M的氫氧化鈉溶液加入到上述懸浮液里調(diào)節(jié)溶液的pH值到10.5。然后懸浮液在60 C下晶化6小時(shí)，接著溶液于劇烈攪拌下被繼續(xù)加熱到83 C，34mg/mL的硫化鈉溶液快速加入到上述溶液中，回流4小時(shí)后溶液冷卻至室溫，用去離子水洗滌三次離心，60 C下干燥24h。同時(shí)，作為對(duì)t匕，在不加入基底氧化石墨的情況下按照上述相同合成條件合成鎳鋁水滑石材料。將殼聚糖(CS)溶于1.0%的醋酸溶液中，配制0.3% CS溶液，室溫下磁力攪拌至殼聚糖完全溶解。稱取2mg鎳鋁水滑石-石墨烯加入到ImL0.3%CS溶液中，超聲分散8h得到分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液。圖1為氧化石墨、鎳鋁水滑石和鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物的傅立葉變換紅外光譜圖。觀察紅外特征吸收峰，可看到鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物的吸收峰與鎳鋁水滑石相似，略有偏移是由于石墨烯的存在，證實(shí)了鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物的形成
實(shí)施例2空殼納米金的制備
以Co納米粒子作為犧牲模板合成空殼納米金。首先向50mL水中通高純N2除氧，攪拌下加入8.4mg檸檬酸和15mg硼氫化鈉。然后注入50 μ L 0.4Μ CoCI2溶液(反應(yīng)始終在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下進(jìn)行以防止生成的Co納米顆粒被氧化)。20min后停止通N2,取30mL鈷納米膠體溶液加入到18mL的氯金酸溶液中(ImM)，繼續(xù)攬拌30min。最后將產(chǎn)物離心，棄去上清液，所得沉淀分散于5mL pH7.5 PBS中備用。取2mL空殼納米金膠體溶液加入到5mL 0.5%的殼聚糖溶液中，室溫下攪拌2h，用以作電極修飾材料。圖2為制備好的空殼納米金的透射電鏡圖，從圖中可看到空殼納米金呈現(xiàn)球狀，中心顏色淺，邊緣顏色暗，證實(shí)了其空心結(jié)構(gòu)，有利于免疫傳感器的構(gòu)建。圖3為鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合物和空殼納米金的掃描電鏡圖，從圖a及b中可看到結(jié)構(gòu)規(guī)則、大小均勻、結(jié)晶度高的六邊形塊狀晶體，晶體結(jié)構(gòu)完整。從圖c中可看到空殼納米金呈現(xiàn)分布均勻、致密的球狀形態(tài)實(shí)施例3玻碳電極的清洗、活化和測(cè)試
玻碳電極修飾前，首先浸入熱的“piranha”溶液(H2S04:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干凈，接下來用0.3 μ m、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用去離子水清洗去除表面污物，然后依次用6mol/L的HNO3、無水乙醇和去離子水各自超聲清洗5min,氮?dú)猸h(huán)境下干燥。
[0028]玻碳電極的活化:徹底清洗后，電極在0.5mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍1.0V?-1.0V，反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。
[0029]預(yù)處理好的玻碳電極的測(cè)試:在含有l(wèi)X10_3mol/L K3Fe (CN)6的0.20 mo I/L KNO3溶液中跑循環(huán)伏安曲線，掃描速度50mV/S，掃描范圍為-0.1V?0.6V，以測(cè)試玻碳電極的性能；當(dāng)循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在SOmV以下，并盡可能接近64mV，所述玻碳電極可使用，否則要重新進(jìn)行清洗，處理所述玻碳電極，直到符合要求。圖4為玻碳電極修飾過程的循環(huán)伏安圖。在玻碳電極表面修飾鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合物及空殼納米金之后，電流依次增大，由于二者均具有良好的導(dǎo)電性。固定抗體、封閉牛血清白蛋白及孵育農(nóng)藥之后，電流逐步減小，是由于其均為惰性蛋白分子，修飾在電極表面會(huì)阻礙電子的傳遞。
[0030]實(shí)施例4免疫傳感器的制備
取6 μ L分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液滴涂在電極表面，常溫下3h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞Ｔ偃? μ L制備好的空殼納米金溶液滴涂在電極上，常溫下2h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈?。再將上述?jīng)納米材料修飾的電極浸入5%的戊二醛溶液中，30min后取出，沖洗吹干，沉浸在1.5mL 5 μ g/mL的毒死蜱單克隆抗體溶液中。4° C條件下浸泡8h，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，晾干待用。最后將上述電極浸入0.5%的BSA溶液中室溫下靜置2h，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，免疫傳感器制作完成，保存在4° C條件下備用。
[0031]實(shí)施例5免疫傳感器使用條件的優(yōu)化及測(cè)定
從抗體濃度、測(cè)試底液PH和孵育時(shí)間三方面對(duì)所制備的免疫傳感器的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，抗體濃度的范圍為50ng/mL-50 μ g/mL，pH的范圍為5.0-8.5，孵育時(shí)間的范圍為5-45min。經(jīng)過試驗(yàn)分析,確定最優(yōu)抗體濃度為5 μ g/mL,測(cè)試底液的最佳pH值為7.0,最佳孵育時(shí)間為30min。
[0032]配置5-2000 ng/mL的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，將上述制備好的免疫傳感器分別浸入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，在常溫下孵育30min，檢測(cè)免疫反應(yīng)前后電流變化得到其工作曲線(圖 5)。
[0033]將免疫傳感器在久效磷、西維因、克百威、3-羥基克百威等干擾物存在的情況下對(duì)200ng/mL的毒死蜱進(jìn)行測(cè)試，以檢測(cè)其選擇性；選5根于相同條件下制備好的免疫傳感器檢測(cè)其重現(xiàn)性；連續(xù)15天依次檢測(cè)相同濃度的毒死蜱溶液以檢測(cè)其穩(wěn)定性；將免疫后的傳感器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.8)解離毒死蜱農(nóng)藥5min后再次免疫，檢測(cè)其再生能力。
[0034]把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3次，噴灑上一定濃度的農(nóng)藥，放置5h后，用IOmL丙酮/0.1M pH7.5磷酸鹽緩沖溶液(1/9，v/v)做溶劑超聲處理20min，然后再離心IOmin (IOOOOrpm)，得到的上清液用來檢測(cè)實(shí)際樣品的回收率，其回收率可以達(dá)到82.0%-118.0%。加標(biāo)回收率檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.68-5.82%，且傳感器的重現(xiàn)性良好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為3.9%和6.2%。
[0035]此種免疫傳感器檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法操作工藝簡單，檢測(cè)時(shí)間較短，檢測(cè)農(nóng)藥濃度范圍廣，靈敏度高，穩(wěn)定性好，再生能力高以及對(duì)實(shí)際樣品分析有較好的回收率和重現(xiàn)性，符合我國農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和國際化要求。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，是在經(jīng)過清洗、活化和性能測(cè)試的裸玻碳電極表面滴涂鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，然后用空殼納米金進(jìn)行修飾，再在修飾后的電極上固定毒死蜱單克隆抗體，最后用牛血清蛋白封閉，得到檢測(cè)毒死蜱的免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: 清洗、活化并測(cè)試裸玻碳電極，獲得預(yù)處理玻碳電極； 制備鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液； 將步驟2)制備的鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液滴涂到步驟I)的預(yù)處理玻碳電極上，分散均勻后，利用空殼納米金進(jìn)行修飾，得到修飾電極； 在步驟3)所得的修飾電極上固定毒死蜱的單克隆抗體，獲得固定電極； 用牛血清蛋白封閉步驟4)所得的固定電極，得到毒死蜱免疫傳感器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟I)所述清洗、活化并測(cè)試裸玻碳電極是利用熱piranha溶液浸泡裸玻碳電極后,用Al2O3衆(zhòng)拋光,再依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環(huán)伏安法活化，并通過檢測(cè)金電極循環(huán)伏安曲線峰電位差測(cè)試金電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)所述制備鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，是采用Hummers方法 制備氧化石墨，再用混合堿液溶解氧化石墨后超聲處理，再加入到含有硝酸鎳和硝酸鋁的鹽溶液中制備懸濁液，調(diào)節(jié)PH至10.5后，60°C下晶化6h，晶化完畢后，加熱到83°C加入硫化鈉溶液，回流4h后冷卻，用去離子水洗滌三次后60°C下干燥24h，最后用殼聚糖-醋酸溶液溶解，并超聲分散均勻后，得到鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述在預(yù)處理電極表面上滴涂鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液，是取6 μ L分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液滴涂在電極表面，26°C下靜置3h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈伞?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述利用空殼納米金修飾，是指取6μ L空殼納米金溶液滴涂在電極上，26 °C下靜置2h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈伞?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)所述固定毒死蜱的單克隆抗體，是將修飾電極浸入5%的戊二醛溶液中，30min后取出，沖洗吹干，沉浸在毒死蜱單克隆抗體溶液中，4° C條件下浸泡8h，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，晾干待用。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟5)所述用牛血清蛋白封閉固定電極，是指將固定電極浸入0.5%的BSA溶液中26°C下靜置2h。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 利用熱piranha溶液浸泡裸玻碳電極后,用Al2O3衆(zhòng)拋光,再依次用去離子水、HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，干燥后用循環(huán)伏安法活化，并通過檢測(cè)金電極循環(huán)伏安曲線峰電位差測(cè)試金電極，獲得預(yù)處理電極； 采用Hummers方法制備氧化石墨，在用混合堿液溶解氧化石墨后超聲處理，在加入到含有硝酸鎳和硝酸鋁的鹽溶液中制備懸濁液，調(diào)節(jié)PH至10.5后，60°C下晶化6h，晶化完畢后，加熱到83°C加入硫化鈉溶液，回流4h后冷卻，用去離子水洗滌三次后60°C下干燥24h，最后用殼聚糖-醋酸溶液溶解，并超聲分散均勻后，得到鎳鋁水滑石-石墨烯復(fù)合液；取6 μ L分散均勻的鎳鋁水滑石-石墨烯納米復(fù)合液滴涂在步驟I)所得預(yù)處理電極表面，常溫下3h，然后用pH7.5的PBS緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈桑偃? μ L空殼納米金溶液滴涂在電極上，26°C下靜置2h，然后用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈珊蟮玫叫揎楇姌O； 將步驟3)所得修飾電極浸入5%的戊二醛溶液中，30min后取出，沖洗吹干，沉浸在毒死蜱單克隆抗體溶液中，4° C條件下浸泡8h，取出后用PBS緩沖液沖洗表面，獲得固定電極；將步驟4)所得固定電極浸 入0.5%的BSA溶液中26°C下靜置2h。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK103941008SQ201410142965
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】郭業(yè)民, 喬璐, 孫霞, 王相友, 劉君峰 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)