一種百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡及制備方法
【專利摘要】一種百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡及制備方法，該試劑卡包括試劑卡槽、襯板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙，其中膠體金結(jié)合墊上含有金標(biāo)探針，襯板固定于試劑卡槽中，樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于襯板上表面，硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和對照線，檢測線和對照線上分別包被的是兔抗LSV多克隆抗體和羊抗兔IgG純化抗體；該百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡的制備方法主要是將兔抗LSV多克隆抗體包被于免疫層析膜上，同時(shí)用其制成用膠體金結(jié)合墊；該試劑卡檢測快速、準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、操作簡便，無需特殊的設(shè)備和儀器。
【專利說明】一種百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測試劑卡及制備方法，具體是一種用膠體金免疫層析法快速檢 測百合隱癥病毒（LSV)的試劑卡及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 百合（Lilium spp)是傳統(tǒng)的藥用和食用植物，現(xiàn)已成為國際上重要的球根花卉之 一。荷蘭是世界上最大的百合種球生產(chǎn)國，2005年荷蘭百合種球生產(chǎn)面積達(dá)3800hm 2,占全 球總面積的72%，每年生產(chǎn)22. 1億個(gè)百合種球，其中約1.0億個(gè)出口到中國。切花百合在 我國花卉產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值中占第四位，同時(shí)百合作為食品和藥材，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。蘭州 食用百合由于其色澤潔白、形大味甜、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)享譽(yù)海內(nèi)外。近年來，蘭州市及其周 邊定西、臨夏等地區(qū)食用百合的面積已近l〇〇〇〇hm 2,直接參與百合種植的農(nóng)戶已超過9萬 戶，已成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)戶的主要收人來源。隨著百合種植面積日益擴(kuò)大，長期無性繁殖使病毒不 斷積累，造成百合種性衰退，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)，給世界各地百合生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng) 濟(jì)損失。我國百合產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生范圍廣、為害嚴(yán)重，云南、甘肅、江蘇等百合產(chǎn)區(qū)病毒病的 自然發(fā)病率一般在20%?30%，有的達(dá)70%以上，嚴(yán)重者可高達(dá)100%。病毒病已成為危 害百合生產(chǎn)的主要病害，也是限制我國百合生產(chǎn)和切花出口的重要原因之一。
[0003] 目前文獻(xiàn)報(bào)道侵染百合的病毒有20多種，其中百合隱癥病毒（Lily symptomless virus, LSV)和百合斑駁病毒（Lily mottle virus, LMoV)是發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的兩 種病毒，其他病毒均為局部地區(qū)發(fā)生。正常條件下，LSV并不會引起百合植株產(chǎn)生明顯癥狀， 但會使鱗莖縮小，切花壽命減短。LSV與LMoV復(fù)合侵染時(shí)，導(dǎo)致百合出現(xiàn)壞死斑，并常伴隨 植株矮小、花與球莖的減產(chǎn)等。LSV屬于麝香石竹潛隱病毒屬（Carlaviru)成員，其病毒成 員多呈直形，大約占64%，彎曲形也較為常見，占36%。病毒典型長度介于509?720nm之 間，直徑介于11?13nm或者14?18nm。病毒基因組為不分段RNA，全長8.4kb，其中包括 5'端的帽子結(jié)構(gòu)和3'的poly㈧尾巴，具有6個(gè)開放閱讀框（0RF)，編碼包括外殼蛋白 (CP，32kDa)在內(nèi)的6個(gè)蛋白。其中CP亞單位是LSV基因組6個(gè)開放閱讀框編碼的唯一參 與病毒顆粒形態(tài)構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其0RF長度為876nt。CP亞單位圍繞病毒RNA分子，組裝成 病毒夕卜殼。
[0004] 目前與百合病毒相關(guān)的研究主要集中在病毒脫除和病毒檢測上，病毒檢測研究 雖有電子顯微鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫法（ELISA)以及分子生物學(xué)技術(shù)（RT-PCR和基因芯片技 術(shù)）等的相關(guān)報(bào)道，但都還停留在研究和實(shí)驗(yàn)室階段，無法滿足大規(guī)模檢測以及百合種植 現(xiàn)場和田間快速檢測的需求，從而無法掌握百合病毒感染的準(zhǔn)確信息。此外，包括ELISA和 RT-PCR等方法在內(nèi)的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測方法都存在程序復(fù)雜，檢測成本高、耗時(shí)長、對儀器設(shè) 備和檢測條件要求高，需要長期經(jīng)驗(yàn)積累和具有專業(yè)操作技能的人員才能完成等問題，因 此應(yīng)用范圍受到很大的局限性。
[0005] 膠體金免疫層析是以硝酸纖維素膜為載體，通過液體的滲移，利用抗原抗體的結(jié) 合，以及膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng)來檢測抗原或抗體。該方法可以避免以上幾種檢測方法的缺 點(diǎn)，以其特異性強(qiáng)、成本低、操作簡便、不需任何儀器、適合現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛接 受，已用于多種植物病毒的檢測等，包括馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草斑駁病毒、南瓜 花葉病毒等。作為一種快速篩查的手段，既可節(jié)省檢測成本，又可用于廣大基層單位開展百 合病毒的檢測和防控工作中，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。但是至今國內(nèi)外還沒有用 膠體金免疫層析法檢測LSV的相關(guān)報(bào)道，更無商品化的LSV膠體金免疫層析檢測試劑卡，很 難滿足國內(nèi)觀賞及食用百合的病毒檢測需求。因此建立科學(xué)、快速、靈敏、穩(wěn)定、易操作的 LSV檢測方法及試劑卡，是生產(chǎn)百合脫毒株的基礎(chǔ)，是提高百合產(chǎn)量和品質(zhì)的前提。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用膠體金免疫層析法快速檢測LSV的試劑卡及其制備 方法。本發(fā)明試劑卡檢測快速，檢測準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)，攜帶方便，操作簡便，檢測重復(fù)性 好，無需任何儀器和設(shè)備。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0008] -種百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡，包括：試劑卡槽（1)，襯板（10)， 樣品墊（6)，膠體金結(jié)合墊（7)，硝酸纖維素膜（8)，吸水濾紙（9)，試劑卡槽（1)包括上殼體 和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞（2)和第二孔洞（3)，樣品 墊（6)置于第一孔洞（2)下方，硝酸纖維素膜（8)置于第二孔洞（3)下方，膠體金結(jié)合墊 ⑵上含有金標(biāo)探針，襯板（10)固定于試劑卡槽⑴中，樣品墊（6)、膠體金墊（7)、硝酸纖 維素膜⑶和吸水濾紙（9)依次排列連接于襯板（10)上表面，硝酸纖維素膜⑶上設(shè)有檢 測線（4)和對照線（5)，檢測線（4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗體，對照線（5)上包被的 是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LSV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g蛋白，金標(biāo)探針 合適抗體標(biāo)記量為16 μ g / mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2. 0?2. 5yg蛋白。
[0009] 其中在用所述試劑卡檢測時(shí)，在所述第一孔洞處加入少量百合樣品的待檢溶液， 對比檢測線和對照線的顏色，即可判定被檢測百合是否感染了百合隱癥病毒；
[0010] 其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中含有LSV， 檢測樣品經(jīng)過所述膠體金墊時(shí)，LSV與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向 所述檢測線方向滲移，當(dāng)接觸到所述檢測線時(shí)發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成 可見的棕紅色條帶；未與檢測線結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述對照線方向滲移，當(dāng)接觸到所述 對照線時(shí)與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)檢測線和 對照線上均出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒；
[0011] 其中將少量待檢溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中不含LSV， 檢測樣品經(jīng)過所述膠體金墊時(shí)，則不能與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述 檢測線時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述對照線方向滲移，當(dāng)接觸到所述對照線 時(shí)與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)檢測線沒有顏色 變化而僅對照線出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品沒有感染百合隱癥病毒。
[0012] 一種百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：1、 兔抗LSV多克隆抗體的制備：從感染了 LSV的百合葉片中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 式反應(yīng)（RT-PCR)，擴(kuò)增LSV的CP基因片段。通過酶切克隆至pET-28a載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化入大腸桿菌BL21，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化獲得大小32. OkDa的LSV CP基因工程融合蛋白。用lmg / mL的LSV CP基因工程融合蛋白作為免疫原分別免疫新西 蘭大白兔，獲得抗血清。所得抗血清依次通過20%、50%、33%三個(gè)飽和度的硫酸銨沉淀粗 提后，透析至PH7. 8的磷酸緩沖液，然后使用DE52陰離子交換柱進(jìn)行純化而獲得兔抗LSV 多克隆抗體IgG ;2、膠體金標(biāo)記兔抗LSV多克隆抗體的方法：分別取半徑為30nm的膠體金 10mL及兔抗LSV多克隆抗體160 μ g，在PH7. 5的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛 血清白蛋白（BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終濃度為1%，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆 抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-抗體結(jié) 合物；3、膠體金結(jié)合墊的制備：用1 / 10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮膠體金-抗 體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成膠體金結(jié)合墊；4、 免疫層析膜的包被：檢測線上包被的是兔抗LSV多克隆抗體，對照線上包被的是羊抗兔IgG 純化抗體；5、試劑卡的組裝：將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然 后樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于襯板上表面，再將試劑 卡槽上殼體與下殼體通過卡扣連接，就得到LSV膠體金免疫層析檢測試劑卡。
[0013] 本發(fā)明的試劑卡具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0014] 檢測時(shí)，吸取少量百合樣品的待檢測溶液，滴在試劑卡槽上殼體第一孔洞處，對比 檢測線和對照線的顏色，即可判定百合植株是否感染了 LSV。
[0015] 1、檢測快速：檢測時(shí)間只需5?10分鐘，可以滿足現(xiàn)場檢測的需要。
[0016] 2、檢測準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)：本反應(yīng)與其他百合主要病毒沒有交叉反應(yīng)，檢測靈敏 度高。
[0017] 3、攜帶方便，操作簡便：本發(fā)明不需要借助其他儀器設(shè)備，適合廣大基層單位開展 百合病毒的檢測和防控工作，也適合百合生產(chǎn)的企業(yè)、公司以及百合種植的農(nóng)戶使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡平面結(jié)構(gòu)示意圖
[0019] 圖2為本發(fā)明百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

【具體實(shí)施方式】
[0020] 如圖1和圖2所示的LSV膠體金免疫層析檢測試劑卡，包括試劑卡槽1，襯板10， 樣品墊6,膠體金結(jié)合墊7,硝酸纖維素膜8,吸水濾紙9,其中試劑卡槽1包括上殼體和下殼 體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞2和第二孔洞3,樣品墊6置于第 一孔洞2下方，硝酸纖維素膜8置于第二孔洞3下方，膠體金結(jié)合墊7上含有金標(biāo)探針，襯 板10固定于試劑卡槽1中，樣品墊6、膠體金結(jié)合墊7、硝酸纖維素膜8和吸水濾紙9依次 排列連接于襯板10上表面，硝酸纖維素膜8上設(shè)有檢測線4和對照線5,檢測線4上包被的 是兔抗LSV多克隆抗體，對照線5上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LSV多克隆抗體合 適包被量為1.5?2. Oyg蛋白，金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為16 μ g / mL,羊抗兔IgG純化 抗體合適包被量為2. 0?2. 5 μ g蛋白。
[0021] 其中，樣品墊和膠體金結(jié)合墊材質(zhì)均為玻璃纖維素膜，襯板為聚氯乙烯材質(zhì)做成， 起支持作用。
[0022] 本發(fā)明試劑卡的制備方法：
[0023] 1、本發(fā)明中兔抗LSV多克隆抗體的制備方法
[0024] 從感染了 LSV的百合葉片中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)，擴(kuò) 增LSV的CP基因片段。通過酶切克隆至pET-28a載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21， 37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化獲得大小32. OkDa的LSV CP基因工程融合蛋 白。用lmg / mL的LSV CP基因工程融合蛋白作為免疫原分別免疫新西蘭大白兔。初次免 疫中，將蛋白抗原與弗氏完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免 疫，將蛋白抗原與弗氏不完全佐劑等體積充分混勻，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。以后每兩周加強(qiáng)免 疫一次，在第4次加強(qiáng)免疫后的5?7天頸動(dòng)脈采血，靜至，離心，收集到的血清加入質(zhì)量百 分比濃度0.02%的疊氮鈉，-20°C保存。所得抗血清依次通過20%、50%、33%三個(gè)飽和度 的硫酸銨沉淀粗提后，透析至PH7. 8的磷酸緩沖液，然后使用DE52陰離子交換柱進(jìn)行純化 而獲得兔抗LSV多克隆抗體IgG。
[0025] 2、膠體金標(biāo)記兔抗LSV多克隆抗體的方法
[0026] 分別取半徑為30nm的膠體金10mL及兔抗LSV多克隆抗體160 μ g，在PH7. 5的條 件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白（BSA)作為穩(wěn)定劑，使得終濃度為1%， 采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及去凝聚物，在離心管底 部的深紅色沉淀即為膠體金-抗體結(jié)合物。
[0027] 3、膠體金結(jié)合墊的制備
[0028] 用1 / 10標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清 液用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維素膜上，37 °C烘干，制成膠體金結(jié)合墊。
[0029] 4、免疫層析膜的包被
[0030] 檢測線包被的是兔抗LSV多克隆抗體，對照線包被的是羊抗兔IgG純化抗體，每條 線寬2mm，兔抗LSV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適 包被量為2.0?2. 5yg蛋白。
[0031] 5、膠體金試劑卡的組裝
[0032] 聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中，然后樣品墊、膠體金結(jié)合 墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于聚氯乙烯襯板上表面，再將試劑卡槽上殼體 與下殼體通過卡扣連接。
[0033] 6、膠體金試劑卡的使用及結(jié)果判定
[0034] 吸取少量百合樣品的待檢測溶液，滴在試劑卡槽上殼體第一孔洞2處，由于毛細(xì) 效應(yīng)液體往前移動(dòng)，若待測液中含有LSV，檢測樣品經(jīng)過膠體金墊時(shí)，LSV與金標(biāo)墊上的金 標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述檢測線方向?qū)游鲇緞?dòng)，當(dāng)接觸到檢測線時(shí)與兔 抗LSV多克隆抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；未結(jié)合 的復(fù)合物繼續(xù)向?qū)φ站€方向滲移，當(dāng)接觸到對照線時(shí)與固定在對照線上的羊抗兔IgG純化 抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶。即當(dāng)檢測線和對照線上均出現(xiàn)棕紅色的 條帶時(shí)，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒。
[0035] 若待測液中不含LSV，檢測樣品經(jīng)過膠體金墊時(shí)，則不能與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆 抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述檢測線時(shí)不發(fā)生反應(yīng)，金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向?qū)φ站€方向滲移，當(dāng) 接觸到對照線時(shí)與固定在對照線上的羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的 棕紅色條帶。即當(dāng)檢測線沒有顏色變化而僅對照線出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品 沒有感染百合隱癥病毒。
[0036] 上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明可直接對LSV進(jìn)行檢測，一般人員不需專門培訓(xùn)即 可操作，5?10分鐘就可出結(jié)果，從而達(dá)到快速、簡便、及時(shí)檢測該病毒的目的。
【權(quán)利要求】
1. 一種百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡，包括：試劑卡槽（1)，襯板（10)，樣 品墊（6)，膠體金結(jié)合墊（7)，硝酸纖維素膜（8)，吸水濾紙（9)，其特征在于：試劑卡槽（1) 包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設(shè)有第一孔洞（2)和第二孔 洞（3)，樣品墊（6)置于第一孔洞（2)下方，硝酸纖維素膜（8)置于第二孔洞（3)下方，膠體 金結(jié)合墊（7)上含有金標(biāo)探針，襯板（10)固定于試劑卡槽（1)中，樣品墊（6)、膠體金結(jié)合 墊（7)、硝酸纖維素膜（8)和吸水濾紙（9)依次排列連接于襯板（10)上表面，硝酸纖維素 膜（8)上設(shè)有檢測線（4)和對照線（5)，檢測線（4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗體，對照 線（5)上包被的是羊抗兔IgG純化抗體，兔抗LSV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g 蛋白，金標(biāo)探針合適抗體標(biāo)記量為16 μ g/mL,羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2. 0? 2. 5 μ g蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡，其中在用所述百 合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡檢測時(shí)，在所述第一孔洞處加入少量百合樣品的待 檢溶液，對比檢測線和對照線的顏色，即可判定被檢測百合是否感染了百合隱癥病毒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡，其中將少量待檢 溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中含有LSV，檢測樣品經(jīng)過所述膠體 金結(jié)合墊時(shí)，LSV與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體形成復(fù)合物，然后繼續(xù)向所述檢測線方向滲 移，當(dāng)接觸到所述檢測線時(shí)與兔抗LSV多克隆抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而被截留下來， 形成可見的棕紅色條帶；未與檢測線結(jié)合的復(fù)合物繼續(xù)向所述對照線方向滲移，當(dāng)接觸到 所述對照線時(shí)與羊抗兔IgG純化抗體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)檢測 線和對照線上均出現(xiàn)棕紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品感染了百合隱癥病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的百合斑駁病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡，其中將少量待檢 溶液加入所述第一孔洞處5?10分鐘后，若待檢溶液中不含LSV，檢測樣品經(jīng)過所述膠體金 結(jié)合墊時(shí)，則不能與金標(biāo)墊上的金標(biāo)多克隆抗體結(jié)合，當(dāng)接觸到所述檢測線時(shí)不發(fā)生反應(yīng)， 金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)向所述對照線方向滲移，當(dāng)接觸到所述對照線時(shí)與羊抗兔IgG純化抗 體結(jié)合而被截留下來，形成可見的棕紅色條帶；當(dāng)檢測線沒有顏色變化而僅對照線出現(xiàn)棕 紅色的條帶時(shí)，則判定被檢樣品沒有感染百合隱癥病毒。
5. -種如權(quán)利要求1-4所述的百合隱癥病毒膠體金免疫層析檢測試劑卡的制備方法， 其特征在于按以下步驟進(jìn)行：（1)兔抗LSV多克隆抗體的制備；（2)膠體金標(biāo)記兔抗LSV 多克隆抗體的方法：分別取半徑為30nm的膠體金10mL及兔抗LSV多克隆抗體160 μ g，在 PH7. 5的條件下通過磁力攪拌震蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白（BSA)作為穩(wěn)定劑，且使得終 濃度為1 %，采用高速離心法除去未結(jié)合的多克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物， 在離心管底部的深紅色沉淀即為膠體金-抗體結(jié)合物；（3)膠體金結(jié)合墊的制備：用1 / 10 標(biāo)記前膠體金溶液體積的重懸液懸浮膠體金-抗體結(jié)合物，離心，上清液用噴涂設(shè)備涂于 玻璃纖維素膜上，37°C烘干，制成膠體金結(jié)合墊；(4)免疫層析膜的包被：在硝酸纖維素膜 上分別包被兔抗LSV多克隆抗體檢測線和羊抗兔IgG純化抗體對照線，每條線寬2mm，兔抗 LSV多克隆抗體合適包被量為1. 5?2. 0 μ g蛋白，羊抗兔IgG純化抗體合適包被量為2. 0? 2. 5 μ g蛋白；（5)試劑卡的組裝：將聚氯乙烯襯板作為支撐載體固定于試劑卡槽下殼體中， 然后樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次排列連接于襯板上表面，再將試 劑卡槽上殼體與下殼體通過卡扣連接，就得到LSV膠體金免疫層析檢測試劑卡。
【文檔編號】G01N33/543GK104122390SQ201410151342
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】張玉寶, 王亞軍, 謝忠奎, 王若愚, 郭志鴻, 張麗華 申請人:中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所