基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的赭曲霉毒素a檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種基于兩種量子點(diǎn)間能量轉(zhuǎn)移的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法。本發(fā)明選擇綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)，紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)，二者混合后，由于抗原抗體特異性結(jié)合，兩種量子點(diǎn)間距離靠近而發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致綠色量子點(diǎn)熒光下降，紅色量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)體系含有OTA時(shí)，游離的OTA與綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)的OTA共同競(jìng)爭(zhēng)紅色量子點(diǎn)偶聯(lián)的抗體，OTA的濃度直接影響綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率，且在一定范圍內(nèi)綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率與OTA濃度對(duì)數(shù)成反比例關(guān)系。本發(fā)明方法具有檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度和準(zhǔn)確性高，操作流程簡(jiǎn)單和檢測(cè)成本低等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的赫曲霉毒素A檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物物理學(xué)分析檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種赭曲霉毒素A檢測(cè)的方法。【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素A (OTA)是糧食制品易污染的真菌毒素，對(duì)人體危害極大。加強(qiáng)對(duì)它的檢測(cè)監(jiān)控對(duì)維護(hù)人類(lèi)健康有著重要意義。目前快速篩查方法多為基于免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、免疫層析柱測(cè)定法和基于不同標(biāo)記物顯色的快速篩查試紙條等等。
[0003]1993年比利時(shí)科學(xué)家首次在Nature報(bào)道:在駱駝科動(dòng)物血液中的抗體，只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy chain of HCAb, VHH)和兩個(gè)常規(guī)的 CH2 與CH3區(qū)，更重要的是單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，VHH是目前可以得到的具有完整功能的穩(wěn)定的可結(jié)合抗原的最小單位。其相對(duì)分子質(zhì)量為15 000，僅為常規(guī)抗體的1/10左右，分子高度4.8 11111，直徑2.2 nm，所以VHH也稱(chēng)納米抗體或單域抗體。
[0004]突光共振能量轉(zhuǎn)移(FGrsterresonance energy transfer,簡(jiǎn)稱(chēng) FRET),是指受激發(fā)的能量供體將能量傳 遞給基態(tài)受體的一個(gè)非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，它對(duì)能量供受體對(duì)之間的距離及相對(duì)偶極方向的納米范圍內(nèi)變化非常敏感，只有在非常近的距離(10 nm)以?xún)?nèi)，才能夠發(fā)生有效的能量共振轉(zhuǎn)移，且這種能量轉(zhuǎn)移效率與供受體之間距離的6次方成反比(見(jiàn)公式I)。因此FRET被稱(chēng)為一種高效的“光學(xué)分子尺”，近年來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)在物理、化學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究與應(yīng)用。
[0005]公式1:E=nRQ6/ (n R06+r6)
公式I中E為能量轉(zhuǎn)移效率；n為每個(gè)能量供體分子對(duì)應(yīng)的平均能量受體分子個(gè)數(shù)；r為能量供受體之間的距離^是距離常數(shù)。
[0006]將單域抗體和抗原分別與能量供受體偶聯(lián)，抗原抗體間特異性結(jié)合會(huì)使能量供受體之間靠近并發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移。而相對(duì)于傳統(tǒng)抗體，單域抗體體積小，按照公式I中能量轉(zhuǎn)移效率與能量供受體之間距離6次方成反比，即距離越近檢測(cè)靈敏度越高，可以大大提高能量轉(zhuǎn)移效率。并且，由于整個(gè)反應(yīng)為均相的免疫學(xué)檢測(cè)反應(yīng)，免疫學(xué)反應(yīng)效率大大高于目前常規(guī)的半固相免疫學(xué)反應(yīng)，既提高了檢測(cè)靈敏度，又能縮短檢測(cè)時(shí)間，如果配有高通量熒光檢測(cè)器，可以同時(shí)測(cè)定大量樣品。
[0007]量子點(diǎn)是一種隨粒徑大小變化可激發(fā)出不同波長(zhǎng)熒光的納米晶體，隨粒徑或最大發(fā)射波長(zhǎng)的變化，量子點(diǎn)呈現(xiàn)出不同的顏色。如在最大發(fā)射波長(zhǎng)530 nm至550 nm范圍內(nèi)的量子點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而在最大發(fā)射波長(zhǎng)590 nm至620 nm范圍內(nèi)的量子點(diǎn)呈現(xiàn)紅色。量子點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)是熒光產(chǎn)率高，光穩(wěn)定性好，激發(fā)光譜廣而發(fā)射光譜窄，并且量子點(diǎn)表面可以修飾任何所需的化學(xué)基團(tuán)，能方便的標(biāo)記在生物分子上，是作為FRET能量供受體的良好材料。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的創(chuàng)新性在于提出了一種新的快速、靈敏和廉價(jià)的免疫學(xué)定量檢測(cè)OTA的方法，即基于紅、綠量子點(diǎn)間能量共振轉(zhuǎn)移信號(hào)來(lái)定量檢測(cè)痕量的0ΤΑ。本發(fā)明基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的OTA檢測(cè)方法，包括紅色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物(試劑I )，綠色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)物(試劑2)和結(jié)合緩沖液(試劑3)。其中紅、綠量子點(diǎn)的選擇前提是二者發(fā)射光譜沒(méi)有重疊，且綠色量子點(diǎn)的發(fā)射光譜在紅色量子點(diǎn)吸收光譜范圍內(nèi)，具體為:綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)介于530 nm至550 nm，表面氨基化修飾；紅色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)介于590 nm至620 nm,表面羧基化修飾。
[0009]抗OTA單域抗體由OTA人工抗原免疫羊駝后由羊駝血液中分離獲得。
[0010]試劑I和試劑2在激發(fā)光下都有特征發(fā)射波譜出現(xiàn)，當(dāng)試劑I和試劑2以一定比例與試劑3混合孵育片刻后，由于抗原抗體結(jié)合，兩種量子點(diǎn)靠近而產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移，綠色量子點(diǎn)的能量轉(zhuǎn)移給紅色量子點(diǎn)，使二者能量一升一降，體現(xiàn)在發(fā)射光譜上就是綠色量子點(diǎn)特征發(fā)射光檢測(cè)值下降而紅色量子點(diǎn)特征發(fā)射光檢測(cè)值提高，且升降幅度可以達(dá)到35%以上。在試劑1、試劑2和用試劑3倍比稀釋的OTA溶液混合孵育片刻后，由于游離的OTA與試劑I共同競(jìng)爭(zhēng)試劑2，導(dǎo)致部分試劑I與試劑2不能結(jié)合而使綠色量子點(diǎn)能量回升，能量轉(zhuǎn)移效率下降。也就是說(shuō)，OTA的濃度直接影響綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率，且在一定范圍二者成線(xiàn)性的反比例關(guān)系。以游離的OTA濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率為縱坐標(biāo)，繪制出的檢測(cè)OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。檢測(cè)食品樣品中OTA含量時(shí)，試劑1、試劑2和待測(cè)食品樣品中OTA提取溶液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)待測(cè)樣液)混合孵育片刻后，測(cè)定熒光強(qiáng)度，代入公式I (參見(jiàn)實(shí)施例1)，按照計(jì)算出的能量轉(zhuǎn)移效率，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出對(duì)應(yīng)的OTA含量。
[0011]本發(fā)明所述的一種基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法，技術(shù)方案包含下列步驟:
一種基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法，包含以下步驟:(1)分別制備綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)物；(2)將綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)物混合，并與梯度濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液在結(jié)合緩沖液中共孵育，在波長(zhǎng)450 nm的激發(fā)光下測(cè)定綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率；以O(shè)TA標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率為縱坐標(biāo)，繪制檢測(cè)OTA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(3)將待測(cè)樣品提取液、綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)物在結(jié)合緩沖液中共孵育，測(cè)定綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比對(duì)即得到待測(cè)樣品提取液中OTA含量。
[0012]所述綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)滿(mǎn)足:二者發(fā)射光譜要分的足夠開(kāi)，即二者的發(fā)射峰形不能有交疊，具體為:綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)介于530 nm至550 nm，表面氨基化修飾；紅色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)介于590 nm至620 nm,表面羧基化修飾。
[0013]所述步驟(I)中綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)，采用NHS、DCC法活化0ΤΑ，再與綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)，葡萄糖酸封閉綠色量子點(diǎn)表面殘留的氨基位點(diǎn)；量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)摩爾比為1:2?1:20，優(yōu)選為1:10。
[0014]所述步驟(I)中紅色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)，采用EDC，NHSS介導(dǎo)將紅色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)，氨基葡萄糖封閉紅色量子點(diǎn)表面殘留的羧基位點(diǎn)；量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)摩爾比為1:1。[0015]步驟(2)綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)物混合摩爾比為1:1?1:6，優(yōu)選為1:5。
[0016]使用的EDC和NHSS的物質(zhì)量分別是量子點(diǎn)的100?500倍和50?100倍；活化時(shí)間是20?40min ;偶聯(lián)時(shí)將pH值調(diào)至7?8,偶聯(lián)時(shí)間是20?40min ;封閉劑葡萄糖酸或氨基葡萄糖的終濃度是0.1%?2%，封閉時(shí)間是0.5?I小時(shí)；封閉后調(diào)pH值至弱酸性為pH 4.5至5.5 ;偶聯(lián)產(chǎn)物用高速離心方法分離出來(lái)，離心條件是4°C?10°C，16000r/min?20000r/min，20?40min ;復(fù)溶液為含有20%至30%丙三醇的0.05mol/L碳酸氫鈉溶液或0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
[0017]結(jié)合緩沖液為含10%甲醇的0.01 M磷酸鹽緩沖液，溶液pH值為7.4，結(jié)合溫度為37°C,結(jié)合時(shí)間20分鐘。
[0018]基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法，具體包括如下步驟:
(I)試劑I的制備:試劑I即綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物。采用NHS法制備OTA與綠色
量子點(diǎn)偶聯(lián)物，首先，OTA與NHS在DCC的輔助下脫水形成共價(jià)連接，DCC吸水形成相應(yīng)的不溶物通過(guò)離心而除去；然后，加入表面氨基修飾的綠色量子點(diǎn)，量子點(diǎn)表面氨基取代NHS與OTA偶聯(lián)；之后，用葡萄糖酸封閉量子點(diǎn)表面殘留的氨基，調(diào)pH值至弱酸性后離心純化，沉淀部分加入復(fù)溶液復(fù)溶。
[0019](2)試劑2的制備:試劑2即紅色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)物。將表面羧基修飾的紅色量子點(diǎn)用水溶性碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉(NHSS)活化，與抗OTA單域抗體偶聯(lián)，之后用氨基葡萄糖封閉，調(diào)pH值至弱酸性，離心純化，加入復(fù)溶液復(fù)溶。
[0020](3) OTA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:試劑I單獨(dú)與試劑3 (即結(jié)合溶液，含10%甲醇的
0.0lM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)混合，在激發(fā)光下測(cè)定綠色量子點(diǎn)特征發(fā)射熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)記為F。將試劑1、試劑2和用試劑3倍比稀釋的OTA溶液共同混合孵育后，在激發(fā)光下測(cè)定綠色量子點(diǎn)特征發(fā)射熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)記為Fn，其中N代表OTA溶液的濃度。將(F -Fn)/ FX 100%記錄為熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)。以O(shè)TA濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率E (%)為縱坐標(biāo)，繪制出檢測(cè)OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0021](4)0TA的檢測(cè):疑似含有OTA的待測(cè)樣液與試劑I和試劑2在37°C下孵育20min，在激發(fā)光下測(cè)定綠色量子點(diǎn)特征發(fā)射熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)帶入公式中Fn位置，計(jì)算得到E值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到待測(cè)樣液中OTA含量。
[0022]更具體的，包括如下步驟:
I)試劑I即綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物的制備:
1.1) OTA的活化:每Img OTA溶解于0.1mg無(wú)水四氫呋喃,加入0.6 mg N-輕基琥拍酰亞胺(NHS)及2mg N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)于室溫下避光劇烈搖動(dòng)I小時(shí)，活化后4000r/min離心15min。取上清,揮發(fā)四氫呋喃,殘留物溶解于0.2mL 二甲基甲酰胺；
1.2)偶聯(lián):每在潔凈的小燒杯中加入0.2mL硼酸鹽緩沖液和5 μ L濃度為ΙΟμΜ的綠色量子點(diǎn)，緩慢加入濃度為ΙΟμΜ的OTA活化物50 μ L，使OTA與綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為10，室溫、避光下偶聯(lián)1.5h ；
1.3)封閉:加入1%葡萄糖酸100 μ L封閉45min,緩調(diào)pH至5.0 ;
1.4)純化:4°C，19000r/min，離心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20 μ L復(fù)溶，得到的復(fù)溶液為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的1，000Χ試劑I母液； 2)試劑2即紅色量子點(diǎn)偶聯(lián)OTA單域抗體的制備:
2.1)紅色量子點(diǎn)活化:每在潔凈小燒杯中加入0.2mL硼酸水溶液，緩慢加入5 μ L濃度為ΙΟμΜ的紅色量子點(diǎn)，將8 μ L 0.5mg/mL 1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2 μ L 0.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS):混勻后加入，室溫活化20min:
2.2)偶聯(lián):逐滴加入濃度為ΙΟμΜ的OTA單域抗體5 μ L，使OTA單域抗體與紅色量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為3:1，用0.1M NaOH調(diào)pH至7.4，室溫偶聯(lián)30min ；
2.3)封閉:加入5%氨基葡萄糖100 μ L封閉45min，用0.1M鹽酸緩調(diào)pH至5.0 ;
2.4)純化:4°C，19000r/min,離心30min，吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸緩沖液(0.0lmol PB, pH7.4) 20 μ L復(fù)溶，得到的復(fù)溶液為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的200Χ試劑2母液；
3)0ΤΑ濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:每各取試劑I和試劑2母液Iμ L，分別用ImL和0.2mL超純水稀釋?zhuān)玫皆噭㊣和試劑2待用液;10μ L試劑I與90μ L試劑3(含10%甲醇的1XPBS，ΡΗ7.4)混合，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度(F2700型分光光度計(jì)，日立)，得到數(shù)據(jù)記為F ;將10 μ L試劑1、10 μ L試劑2和用80 μ L試劑3倍比稀釋的OTA溶液(Ong/mL至20ng/mL)，37°C孵育20min后，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)記錄為Fn，分別代表Ftl, F0.01, F0.06, F0.08, Fa 1、F0.3> Fa 5、F1和F5，其中下標(biāo)數(shù)值代表OTA溶液濃度(ng/mL);將(F — Fn) / FX 100%記錄為熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)；以O(shè)TA濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)為縱坐標(biāo)，繪制出的檢測(cè)OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
4)OTA的檢測(cè):
4.1)待測(cè)樣品溶液準(zhǔn)備:每取待測(cè)樣品lg，用5mL 60%甲醇水溶液震蕩提取5min，5000g離心IOmin,上清液經(jīng)0.45 μ m濾器過(guò)濾，取100 μ L體積加入100 μ L 0.01Μ, ρΗ7.4的2 X PBS和400 μ L的ρΗ7.4的I XPBS稀釋?zhuān)吹?0倍稀釋的待測(cè)樣液；
4.2)取80 μ L待測(cè)樣液與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，計(jì)算待測(cè)物的E (%)值，代入OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即得到待測(cè)樣液中OTA含量。
[0023]本發(fā)明技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明技術(shù)方案靈敏度高，由于巧妙的運(yùn)用了兩種量子點(diǎn)作為OTA和其單域抗體的標(biāo)記物，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性確保了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。而量子點(diǎn)間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移這一“分子尺”直接用于測(cè)定OTA的濃度信號(hào)，單域抗體的小尺寸大大縮小了紅綠量子點(diǎn)之間的距離，提高能量轉(zhuǎn)移效率。由于整個(gè)反應(yīng)為均相的免疫學(xué)檢測(cè)反應(yīng)，免疫學(xué)反應(yīng)效率大大高于目前常規(guī)的半固相免疫學(xué)反應(yīng)，提高了檢測(cè)靈敏度，且免去了常規(guī)ELISA反復(fù)洗板的繁瑣過(guò)程。
[0024](2)本發(fā)明技術(shù)方案操作方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短。由于量子點(diǎn)具有優(yōu)良的光化學(xué)穩(wěn)定性，測(cè)試者在一臺(tái)熒光分光光度計(jì)做好OTA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后，每次檢測(cè)只需要將3種試劑與待測(cè)樣液混合20min，讀取I個(gè)熒光數(shù)據(jù)，帶入公式即可得到準(zhǔn)確的OTA濃度，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在30min內(nèi)完成。如果配有高通量熒光檢測(cè)器,此方法可以同時(shí)測(cè)定大量樣品。
[0025](3)本發(fā)明技術(shù)方案樣品和試劑用量少，檢測(cè)成本低。I微摩爾偶聯(lián)OTA的綠色量子點(diǎn)和5微摩爾偶聯(lián)OTA單域抗體的紅色量子點(diǎn)可以檢測(cè)5萬(wàn)份OTA疑似污染的樣品?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明基于綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)間能量共振轉(zhuǎn)移建立的OTA檢測(cè)方法的熒光掃描圖。圖中實(shí)線(xiàn)是?ο μ L試劑I——偶聯(lián)OTA的綠色量子點(diǎn)(最大發(fā)射波長(zhǎng)530nm)和10 μ L試劑2——偶聯(lián)單域抗體的紅色量子點(diǎn)(最大發(fā)射波長(zhǎng)620nm)分別在90 μ L磷酸鹽緩沖液中的熒光發(fā)射掃描圖譜，即紅、綠量子點(diǎn)原有的能量發(fā)射圖譜；虛線(xiàn)圓點(diǎn)是10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在磷酸鹽緩沖液中37°C孵育20min后的熒光發(fā)射掃描圖譜，此時(shí)因抗原抗體結(jié)合使兩種量子點(diǎn)靠近而發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致綠色量子點(diǎn)能量下降而紅色量子點(diǎn)能量升高；虛線(xiàn)短線(xiàn)是10 μ L試劑I和10 μ L試劑2與80 μ L濃度為3 ng/mL OTA的試劑3 (含10%甲醇的磷酸鹽緩沖液)37°C孵育20min后的熒光發(fā)射掃描圖譜，由于游離的OTA介入，能量轉(zhuǎn)移強(qiáng)度下降。上述激發(fā)波長(zhǎng)均為450nm ；
圖2為實(shí)施例1中制作的OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
基于最大發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm的綠色量子點(diǎn)和最大發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm紅色量子點(diǎn)間能量共振轉(zhuǎn)移建立的OTA檢測(cè)方法，包括以下主要步驟。
[0028](I)綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物(試劑I)的制備:綠色量子點(diǎn)(貨號(hào)QSA a -530-20,表面氨基化修飾，Oceannano公司，美國(guó))，OTA (Sigma公司，美國(guó))；
DOTA的活化:每Img OTA溶解于0.1mg無(wú)水四氫呋喃，加入0.6 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及2mg N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)于室溫下避光劇烈搖動(dòng)I小時(shí)，之后4000r/min離心15min。取上清，揮發(fā)四氫呋喃，殘留物溶解于0.2mL 二甲基甲酰胺；
2)偶聯(lián):每在潔凈的小燒杯中加入0.2mL硼酸鹽緩沖液和5 μ L濃度為ΙΟμΜ的綠色量子點(diǎn)，緩慢加入濃度為ΙΟμΜ的OTA活化物50 μ L，使OTA與綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為10，室溫、避光下偶聯(lián)1.5h。偶聯(lián)全過(guò)程用磁力攪拌器勻速緩慢攪拌；
3)封閉:加入1%葡萄糖酸100μ L封閉45min，緩調(diào)pH至5.0 ;
4)純化:4°C，19000r/min,離心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20μ L復(fù)溶，得到的復(fù)溶液為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的1，000Χ試劑I母液。
[0029](2)紅色量子點(diǎn)與OTA單域抗體偶聯(lián)物(試劑2)的制備:量子點(diǎn)(貨號(hào)QSHb-620-20，表面羧基化修飾，Oceannano公司，美國(guó))，OTA單域抗體(通過(guò)免疫羊駝、分離血清獲得);
1)量子點(diǎn)活化:每在潔凈小燒杯中加入0.2mL硼酸水溶液，緩慢加入5 μ L濃度為ΙΟμΜ的量子點(diǎn)，將8yL 0.5mg/mL 1_乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2 μ L 0.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS) '混勻后加入，室溫活化20min:
2)偶聯(lián):逐滴加入濃度為ΙΟμΜ的OTA單域抗體5μ L，使OTA單域抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為1:1，用0.1M NaOH調(diào)pH至7.4，室溫偶聯(lián)3011^11 ；
3)封閉:加入5%氨基葡萄糖100μ L封閉45min，用0.1M鹽酸緩調(diào)pH至5.0 ;
4)純化:4°C，19000r/min,離心30min，吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸緩沖液(0.01mol PB, pH7.4) 20 μ L復(fù)溶，得到的復(fù)溶液為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的200Χ試劑2母液。[0030](3)綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)OTA、紅色量子點(diǎn)偶聯(lián)單域抗體后兩種量子點(diǎn)之間相互作用的考察:使用熒光掃描(附圖1)考察了兩種量子點(diǎn)偶聯(lián)抗原抗體后具體的行為關(guān)系。
[0031](4) OTA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:每各取試劑I和試劑2母液I μ L，分別用ImL和
0.2mL超純水稀釋?zhuān)玫皆噭㊣和試劑2待用液；10 μ L試劑I與90 μ L試劑3 (含10%甲醇的1XPBS，ΡΗ7.4)混合，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度(F2700型分光光度計(jì)，日立)，得到數(shù)據(jù)記為F ;將10 μ L試劑1、10 μ L試劑2和用80 μ L試劑3倍比稀釋的OTA溶液(Ong/mL至5ng/mL)，37°C孵育20min后，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)記錄為Fn，分別代表Ftl, F0.01, F0.06, F0.08,F0.” F0.3、F0.5、F1和F5，其中下標(biāo)數(shù)值代表OTA溶液濃度(ng/mL);將(F — Fn) / FX 100%記錄為熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)；以O(shè)TA濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)為縱坐標(biāo)，繪制出的檢測(cè)OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:0ΤΑ含量(ng/mL) =e
(E—16.54)/ 5.54
[0032](5) OTA 的檢測(cè):
1)待測(cè)樣品溶液準(zhǔn)備:每取待測(cè)樣品lg，用5mL60%甲醇水溶液震蕩提取5min，5000g離心10min,上清液經(jīng)0.45 μ m濾器過(guò)濾，取100 μ L體積加入100 μ L 0.01Μ, ρΗ7.4的2 X PBS和400 μ L的ρΗ7.4的I XPBS稀釋?zhuān)吹?0倍稀釋的待測(cè)樣液；
2)取80μ L待測(cè)樣液與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，計(jì)算待測(cè)物的E (%)值，代入OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程即得到待測(cè)樣液中OTA含量，再乘以稀釋倍數(shù)30即得到對(duì)應(yīng)樣品中OTA含量(μ g/kg)。
[0033]實(shí)施例2
基于最大發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm的綠色量子點(diǎn)和最大發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm的紅色量子點(diǎn)間能量共振轉(zhuǎn)移建立的OTA檢測(cè)方法，使用高通量檢測(cè)設(shè)備(全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀，熱電公司，美國(guó))和96孔黑色熒光板(3603型，康寧，美國(guó))。
[0034](I)綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物(試劑I)的制備:使用最大發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm的綠色量子點(diǎn)(QSA a-535-20，表面氨基化修飾，Oceannano公司，美國(guó))，基本操作步驟同于實(shí)施例I。
[0035](2)紅色量子點(diǎn)與OTA單域抗體偶聯(lián)物(試劑2)的制備:基本操作步驟同于實(shí)施例I。
[0036](3) OTA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:分別取I μ L試劑I母液和5 μ L試劑2母液，各用ImL超純水稀釋?zhuān)玫皆噭㊣和試劑2。10 μ L試劑I與90 μ L試劑3 (即結(jié)合溶液，含10%甲醇的lXPBS，pH7.4)混合，加入96孔黑色熒光板孔al ;再將10 μ L試劑1、10yL試劑2和 80 μ L 試劑 3 稀釋的 OTA 溶液(濃度分別為 0.06ng/mL, 0.08 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.5 ng/mL, I ng/mL和5 ng/mL)于37°C孵育20min后,加入96孔黑色突光板孔a2至a8。在激發(fā)光450nm下測(cè)定535nm處熒光強(qiáng)度，孔al數(shù)據(jù)記為F。孔a2至a8得到數(shù)據(jù)分別記為匕^匕吣匕^匕丨匕^匕和匕代入公式丨(見(jiàn)實(shí)施例1)中Fn的位置，計(jì)算E (%)值。以游離的OTA濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，E (%)為縱坐標(biāo)，繪制檢測(cè)OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0037](4) OTA的檢測(cè):24份可疑含有OTA的花生樣品和24份玉米樣品分別粉碎，各稱(chēng)取Ig待測(cè)。每份樣品用5mL 60%甲醇水溶液震蕩提取15min，9000 g離心10min，上清液經(jīng) 0.45 μ m 濾器過(guò)濾，取 100 μ L 體積加入 100 μ L 的 2XPBS (0.01Μ, ρΗ7.4)和 400 μ L 的I XPBS (ρΗ7.4)稀釋?zhuān)吹?0倍稀釋的待測(cè)樣液。每份待測(cè)樣液分別取80 μ L與10 μ L試劑I和1(^1^試劑2在371:下孵育20min，加入黑色熒光板相應(yīng)各孔，在激發(fā)光450nm下測(cè)定540nm處熒光強(qiáng)度，得到每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)分別帶入公式(I)(見(jiàn)實(shí)施例1)中Fn位置，計(jì)算得到E值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算即得到待測(cè)樣液中OTA含量，再乘以稀釋倍數(shù)30即得到對(duì)應(yīng)樣品中OTA含量(μ g/kg)。
[0038]實(shí)施例3
基于最大發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm的綠色量子點(diǎn)和最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm的紅色量子點(diǎn)間能量共振轉(zhuǎn)移建立的OTA檢測(cè)方法。
[0039](I)綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物(試劑I)的制備:使用最大發(fā)射波長(zhǎng)為540nm的綠色量子點(diǎn)(QSAa-540-20，表面氨基化修飾，Oceannano公司，美國(guó))，基本操作步驟同于實(shí)施例I。
[0040](2)紅色量子點(diǎn)與OTA單域抗體偶聯(lián)物(試劑2)的制備:使用最大發(fā)射波長(zhǎng)為610nm的紅色量子點(diǎn)(QSHb-610-20，表面羧基化修飾，Oceannano公司，美國(guó))，基本操作步驟同于實(shí)施例1。
[0041](3) OTA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:基本操作步驟同于實(shí)施例1。
[0042](4) OTA的檢測(cè):可疑含有OTA的待測(cè)樣液(制備方法同實(shí)施例2) 80 μ L與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發(fā)光450nm下測(cè)定520nm熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)帶入公式(I)(見(jiàn)實(shí) 施例1)中Fn位置，計(jì)算得到E值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式即得到待測(cè)樣液中OTA含量。
【權(quán)利要求】
1.一種基于兩種量子點(diǎn)之間能量轉(zhuǎn)移的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法，其特征在于包含以下步驟:(1)分別制備綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)物；(2)將綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)物混合，并與梯度濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液在結(jié)合緩沖液中共孵育，在波長(zhǎng)450 nm的激發(fā)光下測(cè)定綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率；以O(shè)TA標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率為縱坐標(biāo)，繪制檢測(cè)OTA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(3)將待測(cè)樣品提取液、綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)物在結(jié)合緩沖液中共孵育，測(cè)定綠色量子點(diǎn)能量轉(zhuǎn)移效率，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比對(duì)即得到待測(cè)樣品提取液中OTA含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述綠色量子點(diǎn)和紅色量子點(diǎn)滿(mǎn)足:綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)介于530 nm至550 nm，表面氨基化修飾的量子點(diǎn)；紅色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)介于590 nm至620 nm,表面羧基化修飾的量子點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)，采用NHS活化法制備OTA與綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)物，葡萄糖酸封閉綠色量子點(diǎn)表面殘留的氨基位點(diǎn)；量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)摩爾比為1:2~1:20，優(yōu)選為1:10。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中紅色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)，抗OTA單域抗體 通過(guò)免疫羊駝后分離血清獲得，采用EDC，NHSS介導(dǎo)將紅色量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)，氨基葡萄糖封閉紅色量子點(diǎn)表面殘留的羧基位點(diǎn)，量子點(diǎn)與抗OTA的單域抗體偶聯(lián)摩爾比為1:1。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物、紅色量子點(diǎn)與抗OTA單域抗體偶聯(lián)物混合摩爾比為1:1~1:6，優(yōu)選為1:5。
6.如權(quán)利要求3或4所述方法，使用的EDC和NHSS的物質(zhì)量分別是量子點(diǎn)的100~500倍和50~100倍；活化時(shí)間是20~40min ;偶聯(lián)時(shí)將pH值調(diào)至7~8，偶聯(lián)時(shí)間是20~40min ;封閉劑葡萄糖酸或氨基葡萄糖的終濃度是0.1%~2%，封閉時(shí)間是0.5~I小時(shí)；封閉后調(diào)PH值至弱酸性為pH 4.5至5.5 ;偶聯(lián)產(chǎn)物用高速離心方法分離出來(lái)，離心條件是 4°C~10°C，12000r/min ~20000r/min ,20 ~40min ;復(fù)溶液為含有 20% 至 30% 丙三醇的O至0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(2)結(jié)合緩沖液為含10%甲醇的0.01M磷酸鹽緩沖液，溶液PH值為7.4，結(jié)合溫度為37°C，結(jié)合時(shí)間20分鐘。
8.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于具體包括如下步驟: (1)試劑I即綠色量子點(diǎn)與OTA偶聯(lián)物的制備: I)OTA的活化:每Img OTA溶解于0.1mg無(wú)水四氫呋喃，加入0.6 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及2mg N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)于室溫下避光劇烈搖動(dòng)I小時(shí)，活化后4000r/min離心15min ;取上清，揮發(fā)四氫呋喃，殘留物溶解于0.2mL 二甲基甲酰胺；2)偶聯(lián):每在潔凈的小燒杯中加入0.2mL硼酸鹽緩沖液和5 μ L濃度為ΙΟμΜ的綠色量子點(diǎn)，緩慢加入濃度為ΙΟμΜ的OTA活化物50 μ L，使OTA與綠色量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為10，室溫、避光下偶聯(lián)1.5h ; 3)封閉:加入質(zhì)量濃度1%的葡萄糖酸100 μ L封閉45min，緩調(diào)pH至5.0 ;4)純化:4°C，19000r/min，離心30min，吸去上清液，沉淀部分用20%甘油水溶液20 μ L復(fù)溶，得到的復(fù)溶液為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的1000Χ試劑I母液； (2)試劑2即紅色量子點(diǎn)與OTA單域抗體偶聯(lián)物的制備:1)紅色量子點(diǎn)活化:每在潔凈小燒杯中加入0.2mL硼酸水溶液，緩慢加入5 μ L濃度為ΙΟμΜ的紅色量子點(diǎn)，將8yL 0.5mg/mL 1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和2 μ L 0.5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS)混勻后加入，室溫活化.20min ； 2)偶聯(lián):逐滴加入濃度為ΙΟμΜ的OTA單域抗體5 μ L，使OTA單域抗體與紅色量子點(diǎn)偶聯(lián)摩爾比為1:1，用0.1M NaOH調(diào)pH至7.4，室溫偶聯(lián)30min ； 3)封閉:加入5%氨基葡萄糖100 μ L封閉45min,用0.1M鹽酸緩調(diào)pH至5.0 ; 4)純化:4°C, 19000r/min,離心.3 0min,吸去上清液，沉淀部分用含有20%甘油的磷酸緩沖液(0.01mol PB, pH7.4) 20 μ L復(fù)溶，得到的復(fù)溶液為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的200Χ試劑2母液； (3)OTA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:每各取試劑I和試劑2母液I μ L，分別用ImL和0.2mL超純水稀釋?zhuān)玫皆噭㊣和試劑2待用液；10 μ L試劑I與90 μ L試劑3 (含10%甲醇的lXPBS，pH7.4)混合，在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)記為F ;將10 μ L試劑1、10 μ L試劑2和用80 μ L試劑3倍比稀釋的OTA溶液(O ng/mL至5 ng/mL), 37°C孵育20min后,在激發(fā)光450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，得到數(shù)據(jù)記錄為Fn，分別代表FcFdFdFdFdFc^FdF1和F5，其中下標(biāo)數(shù)值代表OTA溶液濃度(ng/mL) df(F — Fn) / FX 100%記錄為熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)；以O(shè)TA濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光能量轉(zhuǎn)移效率E (%)為縱坐標(biāo)，繪制出的檢測(cè)OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (4)OTA的檢 測(cè): .1)待測(cè)樣品溶液準(zhǔn)備:每取待測(cè)樣品lg，用5mL60%甲醇水溶液震蕩提取5min，5000g離心10min,上清液經(jīng)0.45 μ m濾器過(guò)濾，取100 μ L體積加入100 μ L 0.01Μ, ρΗ7.4的.2 X PBS和400 μ L的ρΗ7.4的I XPBS稀釋?zhuān)吹?0倍稀釋的待測(cè)樣液； . 2)取80μ L待測(cè)樣液與10 μ L試劑I和10 μ L試劑2在37°C下孵育20min，在激發(fā)光.450nm下測(cè)定綠色量子點(diǎn)最大發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，計(jì)算待測(cè)物的E (%)值，代入OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即得到待測(cè)樣液中OTA含量。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103983622SQ201410151512
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】熊勇華, 江湖, 許楊, 郭亮, 許恒毅 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)