一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，它涉及一種細(xì)胞內(nèi)嘌呤堿基的檢測(cè)方法。本發(fā)明要解決采用現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法獲得細(xì)胞內(nèi)核苷酸代謝過(guò)程中嘌呤單質(zhì)含量的問(wèn)題。本發(fā)明方法：一、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)儀得到電化學(xué)信號(hào)計(jì)算峰面積，繪制每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；二、裂解液的二次電化學(xué)檢測(cè)：待檢測(cè)細(xì)胞的裂解液經(jīng)第一次電化學(xué)檢測(cè)，得到黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤混合信號(hào)峰；加入黃嘌呤氧化酶溶液后經(jīng)第二次電化學(xué)檢測(cè)，得到鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰；三、計(jì)算單嘌呤的含量：用加黃嘌呤氧化酶前得到的峰面積減去加黃嘌呤氧化酶后得到的峰面積，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出每種嘌呤堿基的含量。本發(fā)明用于細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞內(nèi)嘌呤堿基的檢測(cè)方法，尤其涉及黃嘌呤氧化酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]近十年新興起的細(xì)胞電化學(xué)是基于電化學(xué)原理、實(shí)驗(yàn)方法與細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一個(gè)新的前沿領(lǐng)域，它通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)具有電活性物質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)，反映其含量的變化。目前，雖然理論和方法還不完善，但憑借其簡(jiǎn)單、快速、靈敏、無(wú)毒、費(fèi)用低等特點(diǎn)已成為細(xì)胞分析的一個(gè)重要手段。
[0003]作為一個(gè)新的研究領(lǐng)域，細(xì)胞的電化學(xué)響應(yīng)機(jī)理還很不明確，2005年鞠煶先提出完整細(xì)胞伏安響應(yīng)可能是細(xì)胞質(zhì)中的鳥(niǎo)嘌呤快速通過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)電極表面而產(chǎn)生的。并將此電化學(xué)信號(hào)用于抗癌藥物的藥敏試驗(yàn)。2009年，佳木斯大學(xué)武冬梅教授在((Studies on the origin of the voltammetric response of the PC_3cell suspension))(Talanta, 2009, 78，602) —文中進(jìn)一步確認(rèn)，細(xì)胞懸浮液中檢測(cè)到的0.7V左右的電化學(xué)信號(hào)為黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰。2012年，武冬梅課題組在《Detection of thecell viability and proliferation using two-signal electrochemical method))(Analyst, 2012，137，3230)—文中，采用離子液體/多壁碳納米管修飾電極，首次在1.0V和
0.7V左右檢測(cè)出細(xì)胞的兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)峰，分別歸屬于鳥(niǎo)嘌呤/黃嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤/次黃嘌呤的混合信號(hào)峰，并且證明此兩個(gè)混合信號(hào)峰能夠反映細(xì)胞活性，可用于抗癌藥物的篩選。
[0004]雖然目前已能夠檢測(cè)出細(xì)胞的兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)峰，并將此兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)峰用于抗癌藥物的藥敏試驗(yàn)，然而此兩個(gè)信號(hào)峰仍為黃嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤/次黃嘌呤的混合信號(hào)峰，無(wú)法反映細(xì)胞內(nèi)核苷酸代謝過(guò)程中嘌呤單質(zhì)含量的變化，進(jìn)而更精確地表現(xiàn)細(xì)胞的生理狀態(tài)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決采用現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法獲得細(xì)胞內(nèi)核苷酸代謝過(guò)程中嘌呤單質(zhì)含量的問(wèn)題，而提供了一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，按下述步驟實(shí)現(xiàn):
[0007]一、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
[0008]將標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為5 X 10_6mo I/L?15 X 10_6mo I/L的溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用電化學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的電化學(xué)信號(hào)峰，經(jīng)分析得到標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0009]步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)品為鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤或黃嘌呤氧化酶；
[0010]步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以標(biāo)準(zhǔn)品的電化學(xué)信號(hào)峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)；[0011]二、裂解液的二次電化學(xué)檢測(cè)
[0012]①、向含有3 X IO5個(gè)/皿?5 X IO5個(gè)/皿待檢測(cè)細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入500 μ L的PBS緩沖溶液，然后在溫度為45°C?55°C的條件下裂解25min?40min，得到裂解液B，將得到的裂解液B使用電化學(xué)檢測(cè)儀進(jìn)行第一次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰；
[0013]步驟二①中所述的PBS緩沖溶液是將17.5g?17.9g的Na2HPO4.12H20和6.5g?6.8g的KH2PO4溶解到250mL的雙蒸水中，混合均勻后得到的溶液，所述的PBS緩沖溶液pH值為7.0?7.4 ;
[0014]②、向裂解液B中加入I μ L?5 μ L濃度為0.35U/mL?0.45U/mL黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后在溫度為20°C?30°C的條件下孵育40min?48min，得到經(jīng)酶催化反應(yīng)后裂解液C，將得到的裂解液C使用電化學(xué)檢測(cè)儀進(jìn)行第二次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰；
[0015]三、計(jì)算單嘌呤的含量
[0016]根據(jù)步驟二①得到的待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰以及步驟二②得到的待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰，經(jīng)分析得出黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積和腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0017]將得到的黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0018]將得到的腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到次黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0019]由得到的單嘌呤的峰面積，再結(jié)合步驟一得到的鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到裂解液B中次黃嘌呤的濃度、黃嘌呤的濃度、鳥(niǎo)嘌呤的濃度和腺嘌呤的濃度，最后通過(guò)裂解液B的體積分別計(jì)算出待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的含量。
[0020]本發(fā)明的有益效果:
[0021]1、現(xiàn)有技術(shù)中由于電極敏感性的限制，僅檢測(cè)出細(xì)胞的兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)，分別是
0.7V左右的黃嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤混合信號(hào)峰以及1.0V左右的腺嘌呤/次黃嘌呤混合信號(hào)峰。而本發(fā)明所建立的酶催化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量的方法，通過(guò)黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤催化黃嘌呤，再將黃嘌呤催化為尿酸，使細(xì)胞裂解液中的嘌呤堿基由四種減少到兩種(分別為鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤)，兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)峰由混合峰變成單體峰，通過(guò)加酶前后電化學(xué)信號(hào)變化，分別求得四種嘌呤堿基含量。采用酶催化法，將混合信號(hào)變成單質(zhì)信號(hào)，改變了電化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞中嘌呤含量的策略，突破了長(zhǎng)期以來(lái)電化學(xué)僅能檢測(cè)到兩個(gè)混合嘌呤堿基電化學(xué)信號(hào)的限制，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)四種嘌呤堿基含量的電化學(xué)法同時(shí)檢測(cè)。
[0022]2、采用本發(fā)明的方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)四種嘌呤堿基含量測(cè)定的精度提高了 5%?10%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1實(shí)施例1黃嘌呤氧化酶催化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量的電化學(xué)圖；其中，線(xiàn)I為MCF-7細(xì)胞裂解液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)2為MCF-7細(xì)胞裂解液與黃嘌呤氧化酶混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)3為黃嘌呤與次黃嘌呤混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)4為黃嘌呤、次黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)5為鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤與黃嘌呤氧化酶混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)6為鳥(niǎo)嘌呤與腺嘌呤混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)7為黃嘌呤氧化酶的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)8為尿酸的電化學(xué)曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式中一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，按下述步驟實(shí)現(xiàn):
[0025]一、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
[0026]將標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為5 X 10_6mo I/L?15 X 10_6mo I/L的溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用電化學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的電化學(xué)信號(hào)峰，經(jīng)分析得到標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0027]步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)品為鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤或黃嘌呤氧化酶；
[0028]步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以標(biāo)準(zhǔn)品的電化學(xué)信號(hào)峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)；
[0029]二、裂解液的二次電化學(xué)檢測(cè)
[0030]①、向含有3 X IO5個(gè)/皿?5 X IO5個(gè)/皿待檢測(cè)細(xì)胞的60_培養(yǎng)皿中加入500 μ L的PBS緩沖溶液，然后在溫度為45°C?55°C的條件下裂解25min?40min，得到裂解液B，然后將得到的裂解液B使用電化學(xué)檢測(cè)儀進(jìn)行第一次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰；
[0031]步驟二①中所述的PBS緩沖溶液是將17.5g?17.9g的Na2HPO4.12H20和6.5g?
6.8g的KH2PO4溶解到250mL的雙蒸水中，混合均勻后得到的溶液，所述的PBS緩沖溶液pH值為7.0?7.4 ;
[0032]②、向裂解液B中加入I μ L?5 μ L濃度為0.35U/mL?0.45U/mL黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后在溫度為20°C?30°C的條件下孵育40min?48min，得到經(jīng)酶催化反應(yīng)后裂解液C，將得到的裂解液C使用電化學(xué)檢測(cè)儀進(jìn)行第二次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰；
[0033]三、計(jì)算單嘌呤的含量
[0034]根據(jù)步驟二①得到的待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰以及步驟二②得到的待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰，經(jīng)分析得出黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積和腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0035]將得到的黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0036]將得到的腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到次黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0037]由得到的單嘌呤的峰面積，再結(jié)合步驟一得到的鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到裂解液B中次黃嘌呤的濃度、黃嘌呤的濃度、鳥(niǎo)嘌呤的濃度和腺嘌呤的濃度，最后通過(guò)裂解液B的體積分別計(jì)算出待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的含量。
[0038]本實(shí)施方式中步驟一中所述的電化學(xué)檢測(cè)、步驟二①中所述的電化學(xué)檢測(cè)和步驟二②中所述的電化學(xué)檢測(cè)中所涉及的檢測(cè)參數(shù)相同。
[0039]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一的不同之處是，步驟一中所述的電化學(xué)檢測(cè)儀為三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)儀。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0040]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二的不同之處是，步驟一中所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0041]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一的不同之處是，步驟二①中所述的PBS緩沖溶液是將17.9g的Na2HPO4.12H20和6.8g的KH2PO4溶解至Ij 250mL的雙蒸水中，混合均勻后得到的溶液，所述的PBS緩沖溶液pH值為7.4。其它參數(shù)與具體實(shí)施
方式一至三之一相同。
[0042]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一的不同之處是，步驟二
①中所述的第一次電化學(xué)檢測(cè)方法為循環(huán)伏安法或差示脈沖法。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0043]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一的不同之處是，步驟二
②中所述的第二次電化學(xué)檢測(cè)方法為循環(huán)伏安法或差示脈沖法。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】
一至五之一相同。
[0044]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一的不同之處是，步驟二①中所述的電化學(xué)檢測(cè)儀為三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)儀。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至六之一相同。
[0045]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至七之一的不同之處是，步驟二
①中所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至七之一相同。
[0046]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至八之一的不同之處是，步驟二
②中所述的電化學(xué)檢測(cè)儀為三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)儀。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至八之一相同。
[0047]【具體實(shí)施方式】十:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至九之一的不同之處是，步驟二
②中所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極。其它參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至九之一相同。
[0048]通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0049]實(shí)施例1:本實(shí)施例中一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，按下述步驟實(shí)現(xiàn):
[0050]一:標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
[0051]將標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為5X10_6mol/L的溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用電化學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的電化學(xué)信號(hào)峰，經(jīng)分析得到標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0052]步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)品為鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或黃嘌呤氧化酶；
[0053]步驟一中所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極；[0054]二:裂解液的二次電化學(xué)檢測(cè)
[0055]①、向含有5 X IO5個(gè)/皿待檢測(cè)細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入500 μ L的PBS緩沖溶液，然后在溫度為50°C的條件下裂解30min，得到裂解液B，然后將得到的裂解液B使用電化學(xué)檢測(cè)儀采用三級(jí)電極體系進(jìn)行第一次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰以及腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰；
[0056]②、向裂解液B中加入I μ L濃度為0.45U/mL黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，孵育40min,得到經(jīng)酶催化反應(yīng)后裂解液C，將得到的裂解液C使用電化學(xué)檢測(cè)儀采用三級(jí)電極體系進(jìn)行第二次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰；
[0057]步驟二①中所述的PBS緩沖溶液是由17.9g的Na2HPO4.12H20和6.8g的KH2PO4溶解到250mL的雙蒸水中，混合均勻后得到的溶液，所述的PBS緩沖溶液pH值為7.4 ；
[0058]步驟二①中所述的待檢測(cè)細(xì)胞為MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)；
[0059]三、計(jì)算單嘌呤的含量
[0060]根據(jù)步驟二①得到的待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰以及腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰和步驟二②得到的待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰，經(jīng)分析得出黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積和腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0061]將得到的黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0062]將得到的腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到次黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積；
[0063]由得到的單嘌呤的峰面積，再結(jié)合步驟一得到的鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到裂解液B中次黃嘌呤的濃度、黃嘌呤的濃度、鳥(niǎo)嘌呤的濃度和腺嘌呤的濃度，最后通過(guò)裂解液B的體積分別計(jì)算出待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的含量。
[0064]圖1為本實(shí)施例黃嘌呤氧化酶催化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)嘌呤含量的電化學(xué)圖；其中，線(xiàn)I為MCF-7細(xì)胞裂解液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)2為MCF-7細(xì)胞裂解液與黃嘌呤氧化酶混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)3為黃嘌呤與次黃嘌呤混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)4為黃嘌呤、次黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)5為鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤與黃嘌呤氧化酶混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)6為鳥(niǎo)嘌呤與腺嘌呤混合液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)7為黃嘌呤氧化酶的電化學(xué)曲線(xiàn)圖；線(xiàn)8為尿酸的電化學(xué)曲線(xiàn)圖。
[0065]本驗(yàn)證試驗(yàn)中采用的酶催化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)四種嘌呤堿基含量，從圖1可以看出:步驟二①分別為0.7V左右的黃嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰(信號(hào)I)以及0.9V左右的腺嘌呤/次黃嘌呤混合信號(hào)峰(信號(hào)II)。向裂解液B中加入黃嘌呤氧化酶后，峰面積均減小，說(shuō)明向裂解液B中加入的黃嘌呤氧化酶，黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤催化黃嘌呤，再將黃嘌呤催化為尿酸，使細(xì)胞裂解液中的嘌呤堿基由四種減少到兩種，分別為鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤，使混合信號(hào)峰變成了鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的嘌呤單體信號(hào)峰。利用此種酶催化反應(yīng)，可以方便地檢測(cè)到細(xì)胞中嘌呤單體的含量。
[0066]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0067]本實(shí)施例通過(guò)向裂解液B中加入的黃嘌呤氧化酶將信號(hào)I的黃嘌呤和信號(hào)II的次黃嘌呤均氧化為尿酸，此催化反應(yīng)在40min~48min內(nèi)完成，與加黃嘌呤氧化酶前相比，信號(hào)I (黃嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤混合信號(hào)峰)峰面積減少1.158X 10_6，信號(hào)II (腺嘌呤/次黃嘌呤混合信號(hào)峰)峰面積減少9.58X10_6，說(shuō)明信號(hào)I和信號(hào)II中的黃嘌呤和次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶氧化為尿酸，僅剩下鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的信號(hào)峰，通過(guò)數(shù)學(xué)處理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出四種嘌呤的含量如下表。
[0068]表1加酶前后細(xì)胞中嘌呤含量變化
【權(quán)利要求】
1.一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，按下述步驟實(shí)現(xiàn): 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 將標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為5X 10_6mol/L~15X 10_6mol/L的溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用電化學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的電化學(xué)信號(hào)峰，經(jīng)分析得到標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； 步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)品為鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤或黃嘌呤氧化酶； 步驟一中所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以標(biāo)準(zhǔn)品的電化學(xué)信號(hào)峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)； 二、裂解液的二次電化學(xué)檢測(cè) ①、向含有3X IO5個(gè)/皿~5 X IO5個(gè)/皿待檢測(cè)細(xì)胞的60mm培養(yǎng)皿中加入500 μ L的PBS緩沖溶液，然后在溫度為45°C~55°C的條件下裂解25min~40min，得到裂解液B，將得到的裂解液B使用電化學(xué)檢測(cè)儀進(jìn)行第一次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰； 步驟二①中所述的PBS緩沖溶液是將17.5g~17.9g的Na2HPO4.12H20和6.5g~6.8g的KH2PO4溶解到250mL的雙蒸水中，混合均勻后得到的溶液，所述的PBS緩沖溶液pH值為7.0 ~7.4 ; ②、向裂解液B中加入Iμ L~5 μ L濃度為0.35U/mL~0.45U/mL黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后在溫度為20°C~30°C的條件下孵育40min~48min,得到經(jīng)酶催化反應(yīng)后裂解液C，將得到的裂解液C使用電化學(xué)檢測(cè)儀進(jìn)行第二次電化學(xué)檢測(cè)，得到待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰； 三、計(jì)算單嘌呤的含量 根據(jù)步驟二①得到的待檢測(cè)細(xì)胞中黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰和腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰以及步驟二②得到的待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰和腺嘌呤信號(hào)峰，經(jīng)分析得出黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積、鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積和腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積； 將得到的黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與鳥(niǎo)嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積； 將得到的腺嘌呤-次黃嘌呤的混合信號(hào)峰的峰面積與腺嘌呤信號(hào)峰的峰面積做差得到次黃嘌呤信號(hào)峰的峰面積； 由得到的單嘌呤的峰面積，再結(jié)合步驟一得到的鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到裂解液B中次黃嘌呤的濃度、黃嘌呤的濃度、鳥(niǎo)嘌呤的濃度和腺嘌呤的濃度，最后通過(guò)裂解液B的體積分別計(jì)算出待檢測(cè)細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟一中所述的電化學(xué)檢測(cè)儀為三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)儀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二①中所述的PBS緩沖溶液是將17.9g的Na2HPO4.12H20和6.8g的KH2PO4溶解到250mL的雙蒸水中，混合均勻后得到的溶液，所述的PBS緩沖溶液pH值為7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二①中所述的第一次電化學(xué)檢測(cè)方法為循環(huán)伏安法或差示脈沖法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二②中所述的第二次電化學(xué)檢測(cè)方法為循環(huán)伏安法或差示脈沖法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二①中所述的電化學(xué)檢測(cè)儀為三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)儀。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二①中所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二②中所述的電化學(xué)檢測(cè)儀為三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)儀。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種基于酶催化的細(xì)胞內(nèi)嘌呤電化學(xué)檢測(cè)方法，其特征在于步驟二②中所述的三電極體系為離子液體/多壁碳修飾電極為工作電極、銀/氯化銀為參比電極和鉬絲為對(duì)極。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK103940870SQ201410155347
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】邱洪斌, 武冬梅, 王景濤, 高廣剛, 劉紅, 郭曉玲, 王倩, 那珂琪 申請(qǐng)人:佳木斯大學(xué)