一種基于DNA-銀納米簇（DNA-Ag NCs）適體傳感器，及其制備方法，用途以及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag?NCs)適體傳感器，及其制備方法，用途以及檢測方法，以DNA為模板，利用化學(xué)還原法制得了具有熒光性質(zhì)的DNA-Ag?NCs，此DNA-Ag?NCs具有光穩(wěn)定性佳，光強(qiáng)高，無細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，因此將此傳感器應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測具有很好的潛在應(yīng)用價值。通過PDGF-BB及其適配體之間的特異性結(jié)合打開雜交的雙鏈DNA，利用富G堿基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在時形成的DNA模擬酶(DNAzyme)使得熒光DNA-Ag?NCs發(fā)生猝滅，制備了基于DNA-Ag?NCs的適體傳感器，此傳感器實(shí)現(xiàn)了對PDGF-BB高靈敏、高選擇性的檢測。
【專利說明】—種基于DNA-銀納米族(DNA-Ag NCs)適體傳感器，及其制備方法，用途以及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種DNA-Ag NCs適體傳感器的制備方法及對PDGF-BB的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，應(yīng)用于臨床診斷相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)越來越重要，因此發(fā)展生物傳感器用于檢測與癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì)十分有必要。血小板源生長因子-BB(TOGF-BB)與多種疾病密切相關(guān)，如動脈硬化、纖維病，并且作為腫瘤血管發(fā)生指示劑在人類惡性腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)。因此開發(fā)高選擇性、高靈敏性、低耗及無標(biāo)記的生物傳感器用于檢測TOGF-BB至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器，及其制備方法，用途以及檢測方法，應(yīng)用于TOGF-BB蛋白質(zhì)的檢測。本發(fā)明以DNA為模板，利用化學(xué)還原法制得了具有熒光性質(zhì)的DNA-Ag NCs，通過TOGF-BB及其適配體之間的特異性結(jié)合打開雜交的雙鏈DNA，利用富G堿基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在時形成的DNA模擬酶(DNAzyme)使得熒光DNA-Ag NCs發(fā)生猝滅，制備了基于DNA-Ag NCs的適體傳感器，此傳感器實(shí)現(xiàn)了對I3DGF-BB高靈敏、高選擇性的檢測。
[0004]具體技術(shù)方案如下:
[0005]一種基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)DNA探針加熱一定時間后自然冷卻并培養(yǎng)一段時間；
[0007](2) DNA溶液加入AgNO3后振蕩；
[0008](3)黑暗中放置一段時間；
[0009](4)溶液中加入NaBH4,振蕩，黑暗中放置；
[0010](5)得到具有熒光性的DNA-Ag NCs0
[0011]進(jìn)一步地，步驟(I)中，10 μ M DNA探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50分鐘。
[0012]進(jìn)一步地，步驟(2)中DNA溶液加入AgNO3后劇烈振蕩30秒，步驟(3)中黑暗中放置20分鐘。
[0013]進(jìn)一步地，步驟⑷中溶液中加入NaBH4,劇烈振蕩30秒，黑暗中至少放置1-2小時。
[0014]一種基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器，采用上述的方法制備得到。
[0015]上述基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器的用途，用于無標(biāo)記檢測血小板源生長因子-BB (PDGF-BB)。
[0016]上述基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器無標(biāo)記檢測I3DGF-BB的方法，包括如下步驟:
[0017]a、Apt_G4探針加熱數(shù)分鐘后自然冷卻培養(yǎng)一段時間；
[0018]b、步驟a得到溶液加入一定濃度AgNO3并振蕩；
[0019]C、步驟b得到溶液黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并振蕩；
[0020]d、步驟c中溶液加入不同濃度的H)GF-BB，血晶素(hemin)及K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
[0021]步驟a中，10 μ M Apt_G4探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間；步驟b中，加入一定濃度AgNO3并劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并劇烈振蕩。
[0022]步驟d中，溶液黑暗中放置一段時間后加入不同濃度的TOGF-BB，1.ΟμΜ血晶素(hemin)及5OmM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
[0023]進(jìn)一步地，步驟a中，ΙΟμΜ Apt_G4探針于88°C加熱IOmin后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50min ;和/或，步驟b中，溶液加入20 μ L170 μ M AgNO3并劇烈振蕩30s,黑暗中放置20min后加入20 μ L170 μ M NaBH4并劇烈振蕩30s ;和/或，步驟d中，溶液黑暗中放置50min后加入不同濃度的PDGF-BB，1.ΟμΜ hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)2.0h。
[0024]與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備DNA-Ag NCs方法與已有技術(shù)相比，具有重現(xiàn)性高，耗能低，制備時間短且易控制等優(yōu)點(diǎn)。以此無標(biāo)記的適體傳感器檢測TOGF-BB，線性范圍寬，檢測限低，且本傳感器選擇性佳，靈敏度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為基于DNA-Ag NCs適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB示意圖；
[0026]圖2為合成的DNA-Ag NCs的SEM圖；
[0027]圖3 (A)中，aDNA-Ag NCs紫外吸收光譜；b存在PDGF-BB及hemin時紫外吸收光
-1'Tfe1曰；
[0028]圖3⑶DNA-Ag NCs激發(fā)a及發(fā)射光譜b_e ；
[0029]圖3 (C)中a為DNA-Ag NCs熒光壽命；b為存在TOGF-BB及hemin時熒光壽命；
[0030]圖3 (D) DNA-Ag NCs在PDGF-BB及hemin存在時的循環(huán)伏安圖；
[0031 ]圖4 (A)不同濃度TOGF-BB對應(yīng)熒光光譜；
[0032]圖4⑶熒光強(qiáng)度與不同TOGF-BB濃度對數(shù)間線性關(guān)系；
[0033]圖5為基于DNA-Ag NCs適體傳感器的選擇性考察；
[0034]圖6為基于DNA-Ag NCs適體傳感器的重復(fù)性考察。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面根據(jù)附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本發(fā)明多種實(shí)施方式中的一種優(yōu)選實(shí)施例。
[0036]針對現(xiàn)有技術(shù)以檢測TOGF-BB的不足(需標(biāo)記信號分子、特異性不足)，本實(shí)施例提供一種無標(biāo)記的DNA-Ag NCs生物傳感器的制備及其應(yīng)用于TOGF-BB蛋白質(zhì)的檢測。本發(fā)明以DNA為模板，利用化學(xué)還原法制得了具有熒光性質(zhì)的DNA-Ag NCs，得到的DNA-Ag NCs可用于適體傳感器的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)對I3DGF-BB高選擇性，高靈敏性的檢測。[0037]實(shí)施例一:
[0038]一種基于DNA-Ag NCs適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB，步驟如下:
[0039]a、10 μ M Apt_G4探針于88°C加熱IOmin后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50min。
[0040]b、(a)中溶液加入20 μ L170 μ M AgNO3并劇烈振蕩30s，黑暗中放置20min后加入20 μ L170 μ M NaBH4 并劇烈振蕩 30s。
[0041]c、(b)中溶液黑暗中放置50min后加入不同濃度的PDGF-BB，1.ΟμΜ hemin及50mMK+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)2.0h。
[0042]DNA-Ag NCs的制備:10 μ M DNA探針于88°C加熱10分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50分鐘。然后此DNA溶液加入AgNO3后劇烈振蕩30秒，黑暗中放置20分鐘。隨后在此溶液中加入NaBH4,劇烈振蕩30秒，黑暗中至少放置I小時，得到具有熒光的DNA-Ag NCs0
[0043]實(shí)施例二:
[0044]基于DNA-Ag NCs適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB步驟如下:
[0045]a、10 μ M Apt_G4探針于88°C加熱10分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50分鐘。
[0046]b、(a)中溶液加入20 μ L170 μ M AgNO3并劇烈振蕩30秒，黑暗中放置20分鐘后加Λ 20 μ L170 μ M NaBH4并劇烈振蕩30秒。
[0047]c、(b)中溶液黑暗中放置50分鐘后加入不同濃度的roGF-ΒΒ,Ι.ΟμΜ血晶素(hemin)及50mM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)2.0小時。
[0048]實(shí)施例三:
[0049]一種熒光性DNA-Ag NCs的制備方法，步驟包括:10 μ M DNA探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。然后于此DNA溶液加入八8顯3后劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間。隨后在此溶液中加入NaBH4，劇烈振蕩，黑暗中至少放置1-2小時，得到具有熒光性的DNA-Ag NCs0
[0050]基于DNA-Ag NCs適體傳感器無標(biāo)記檢測F1DGF-BB步驟如下:
[0051]a、10 μ M Apt_G4探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。
[0052]b、(a)中溶液加入一定濃度AgNO3并劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并劇烈振蕩。
[0053]c、(b)中溶液黑暗中放置一段時間后加入不同濃度的I3DGF-BB, 1.ΟμΜ血晶素(hemin)及50mMK+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
[0054]實(shí)施例四:
[0055]以DNA為模板，利用化學(xué)還原法制得了具有熒光性質(zhì)的DNA-Ag NCs,此DNA-AgNCs具有光穩(wěn)定性佳，光強(qiáng)高，無細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，因此將此傳感器應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測具有很好的潛在應(yīng)用價值。通過I3DGF-BB及其適配體之間的特異性結(jié)合打開雜交的雙鏈DNA，利用富G堿基的DNA在血晶素(hemin)和K+存在時形成的DNA模擬酶(DNAzyme)使得熒光DNA-Ag NCs發(fā)生猝滅，制備了基于DNA-Ag NCs的適體傳感器，此傳感器實(shí)現(xiàn)了對TOGF-BB聞靈敏、聞選擇性的檢測。
[0056]一種熒光性DNA-Ag NCs的制備方法，步驟包括:
[0057]ΙΟμΜ DNA探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。然后于此DNA溶液加入AgNO3后劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間。隨后在此溶液中加入NaBH4，劇烈振蕩，黑暗中至少放置1-2小時，得到具有熒光性的DNA-Ag NCs0[0058]基于DNA-Ag NCs適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB步驟如下:
[0059]a、10 μ M Apt_G4探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。
[0060]b、(a)中溶液加入一定濃度AgNO3并劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并劇烈振蕩。
[0061]c、(b)中溶液黑暗中放置一段時間后加入不同濃度的I3DGF-BB, 1.ΟμΜ血晶素(hemin)及5OmM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
[0062]實(shí)施例五:
[0063]一種熒光性DNA-Ag NCs,以DNA為模板，利用化學(xué)還原法制得。一種熒光性DNA-AgNCs的制備方法，步驟包括:10 μ M DNA探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。然后于此DNA溶液加入AgNO3后劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間。隨后在此溶液中加入NaBH4,劇烈振蕩，黑暗中至少放置1-2小時，得到具有熒光性的DNA-AgNCs。
[0064]基于DNA-Ag NCs適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB步驟如下:
[0065]a、10 μ M Apt_G4探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。
[0066]b、(a)中溶液加入一定濃度AgNO3并劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并劇烈振蕩。
[0067]c、(b)中溶液黑暗中放置一段時間后加入不同濃度的I3DGF-BB, 1.ΟμΜ血晶素(hemin)及5OmM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
[0068]所制得的DNA-Ag NCs的形貌如圖2所示，Ag納米粒子均勻，分散。
[0069]取200yL DNA-Ag NCs溶液于石英比色皿中，檢測波長段450nm-750nm間吸收峰，所得吸收光譜如圖3A所示。取200yL DNA-Ag NCs溶液于熒光比色皿中，檢測其580nm激發(fā)處的發(fā)射光譜，所得光譜如圖3B所示。取500 μ L DNA-Ag NCs溶液于熒光比色皿中，檢測其熒光壽命，所得熒光壽命圖如圖3C所示，從圖中可以看出，存在I3DGF-BB及hemin時，DNA-Ag NCs的熒光壽命減小，發(fā)生了電子的轉(zhuǎn)移。取50mM磷酸鹽緩沖溶液作為電解質(zhì)溶液放入電解槽中，將制備的DNA-Ag NCs滴于工作電極上，檢測其循環(huán)伏安曲線，從得到的CV圖(圖3D)可以看出，存在TOGF-BB及hemin時，DNA-Ag NCs發(fā)生了電子的轉(zhuǎn)移。
[0070]上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)DNA探針加熱一定時間后自然冷卻并培養(yǎng)一段時間； ⑵DNA溶液加入AgNO3后振蕩； (3)黑暗中放置一段時間； (4)溶液中加入NaBH4,振蕩，黑暗中放置； (5)得到具有熒光性的DNA-AgNCs0
2.如權(quán)利要求1所述的基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，10 μ M DNA探針于80-90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50分鐘。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中DNA溶液加入AgNO3后劇烈振蕩30秒，步驟(3)中黑暗中放置20分鐘。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(4)中溶液中加入NaBH4，劇烈振蕩30秒，黑暗中至少放置1_2小時。
5.一種基于DNA-銀納米簇(DNA-Ag NCs)適體傳感器，其特征在于，采用如權(quán)利要求1-4所述的方法制備得到。
6.權(quán)利要求5所述基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器的用途，其特征在于，用于無標(biāo)記檢測血小板源生長因子-BB(TOGF-BB)。
7.權(quán)利要求6所述基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器無標(biāo)記檢測I3DGF-BB的方法，其特征在于，包括如下步驟: a、Apt-G4探針加熱數(shù)分鐘后自然冷卻培養(yǎng)一段時間； b、步驟a得到溶液加入一定濃度AgNO3并振蕩； C、步驟b得到溶液黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并振蕩； d、步驟c中溶液加入不同濃度的TOGF-BB，血晶素(hemin)及K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
8.如權(quán)利要求7所述基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB的方法，其特征在于，步驟a中，10 μ M Apt_G4探針于80_90°C加熱數(shù)分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間；步驟b中，加入一定濃度AgNO3并劇烈振蕩一段時間，黑暗中放置一段時間后加入一定濃度NaBH4并劇烈振蕩。
9.如權(quán)利要求7或8所述基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器無標(biāo)記檢測TOGF-BB的方法，其特征在于，步驟d中，溶液黑暗中放置一段時間后加入不同濃度的roGF-ΒΒ,Ι.ΟμΜ血晶素(hemin)及5OmM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項所述基于DNA-銀納米簇(DNA-AgNCs)適體傳感器無標(biāo)記檢測PDGF-BB的方法，其特征在于，步驟a中，10 μ M Apt_G4探針于88°C加熱IOmin后自然冷卻到室溫培養(yǎng)50min ;和/或，步驟b中，溶液加入20 μ L170 μ M AgNO3并劇烈振蕩30s，黑暗中放置20min后加入20μυ70μΜ NaBH4并劇烈振蕩30s ;和/或，步驟d中，溶液黑暗中放置50min后加入不同濃度的PDGF-ΒΒ,Ι.ΟμΜ hemin及50mM K+，此混合溶液于黑暗中繼續(xù)培 養(yǎng)2.0h。
【文檔編號】G01N33/68GK103913443SQ201410166731
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】王廣鳳, 朱艷紅, 陳玲 申請人:安徽師范大學(xué)