一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接elisa試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒。該試劑盒由副豬嗜血桿菌細(xì)胞致死性膨脹毒素C(cytolethal?distending?toxin，CDT-C)蛋白作為包被抗原的ELISA包被板、待檢樣品稀釋板、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、20倍濃縮洗滌液、血清樣本稀釋液、酶標(biāo)抗體工作液、顯色液和終止液組裝而成。判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值<0.200，判為陰性；S/P值≥0.200，判為陽(yáng)性，S/P值=（待測(cè)樣本OD450nm均值-陰性對(duì)照OD450nm均值）/（陽(yáng)性樣本OD450nm均值-陰性對(duì)照OD450nm均值）。通過(guò)特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、符合率試驗(yàn)、與上市試劑盒比較試驗(yàn)、臨床應(yīng)用試驗(yàn)等，表明本試劑盒具有特異性好、敏感度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，與國(guó)外同類(lèi)上市產(chǎn)品具有較高符合率，可用于副豬嗜血桿菌抗體的臨床大規(guī)模檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)及動(dòng)物傳染病檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的涉及一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，屬于副豬嗜血桿菌病防控領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】
副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的一種傳染病。副豬嗜血桿菌0? parasuis)是一種NAD依賴(lài)型、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌,屬于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus)。該菌是豬上呼吸道的一種共棲菌，可在特定的條件下侵入機(jī)體而引起嚴(yán)重的全身性疾病一豬格拉氏病(Glasser’ s Disease)，臨床上主要表現(xiàn)為豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。易感染2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般為10%~15%，嚴(yán)重時(shí)患病豬死亡率可達(dá)50%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病在我國(guó)及世界上多個(gè)國(guó)家廣泛存在，成為世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性傳染病，并在我國(guó)流行日趨嚴(yán)重。
[0003]為了有效預(yù)防和控制HPS，在加強(qiáng)免疫預(yù)防的同時(shí)，使用特異、敏感、快速、便于操作的診斷和檢測(cè)方法，是有效預(yù)防和控制HPS發(fā)生的手段和重要的工具。但副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道中的一種常在菌，因此例如PCR方法、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、southern雜交、間接血凝試驗(yàn)等檢測(cè)HPS病原的一些檢測(cè)方法，對(duì)于診斷和防控的意義不大。檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的ELISA方法可以反映豬體內(nèi)的HPS的感染情況還可以顯示抗體水平，對(duì)于臨床免疫具有指導(dǎo)作用，同時(shí)操作簡(jiǎn)單便于臨床檢測(cè)和抗體監(jiān)測(cè)。
[0004]目前國(guó)外僅有荷蘭BioChek公司和加拿大Biovet公司兩家生產(chǎn)研制的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，但在國(guó)內(nèi)沒(méi)有批文批號(hào)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上尚無(wú)檢測(cè)該病抗體的國(guó)產(chǎn)商品化試劑盒。國(guó)內(nèi)學(xué)者建立的檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的ELISA方法采用的包被抗原主要有破碎的全菌、提取的莢膜多糖和脂多糖、表達(dá)的外膜蛋白P2和P5蛋白等。但副豬嗜血桿菌血清型眾多，抗原成分復(fù)雜，采用全菌包被有可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。莢膜多糖和脂多糖的提取受分泌條件和提取量小等因素制約不能適應(yīng)試劑盒大規(guī)模生產(chǎn)的需要，而且多糖成分比較復(fù)雜，容易造成檢測(cè)的假陽(yáng)性。因此利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)特異性蛋白作為抗原是解決以上問(wèn)題的理想途徑，其中表達(dá)的外膜蛋白P2和P5作為包被抗原的研究比較多。但趙倩(2010)等通過(guò)副豬嗜血桿菌15個(gè)血清型菌株的外膜蛋白P2和P5基因克隆測(cè)序分析顯示，外膜蛋白P5的基因序列在副豬嗜血桿菌15個(gè)血清型的細(xì)菌中同源性高，保守性好，而外膜蛋白P2同源性較低，且部分血清型基因序列出現(xiàn)成段堿基缺失和多個(gè)點(diǎn)突變，可能影響其作為包被蛋白的通用性。張斌(2013)等研究表明表達(dá)的外膜蛋白P5蛋白可以和副豬嗜血桿菌15個(gè)血清型參考菌株的陽(yáng)性血清發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，外膜蛋白P5蛋白的通用性良好，但間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)外膜蛋白P5蛋白包被酶標(biāo)板可以和巴氏桿菌、胸膜放線桿菌等細(xì)菌的陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，蛋白特異性差，可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。
[0005]因此為了滿(mǎn)足我國(guó)副豬嗜血桿菌診斷和控制的需要，為防治副豬嗜血桿菌病提供有力技術(shù)支撐，針對(duì)國(guó)內(nèi)無(wú)副豬嗜血桿菌抗體檢測(cè)試劑產(chǎn)品的現(xiàn)狀研制一種快速、特異、敏感的副豬嗜血桿菌ELISA抗體檢測(cè)試劑盒是十分迫切的。[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，針對(duì)目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有商品化的檢測(cè)試劑盒，提供一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒,該試劑盒快速、特異、敏感、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(I)一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，是用副豬嗜血桿菌CDT-C蛋白作為包被抗原。
[0008](2)副豬嗜血桿菌⑶T-C蛋白的基因序列經(jīng)克隆測(cè)序分析顯示，在副豬嗜血桿菌15個(gè)血清型的細(xì)菌中同源性高，保守性好。
[0009](3)副豬嗜血桿菌CDT-C蛋白的氨基酸序列如下:MLKRFTLLMTLGLCQFSLAET PPMPPAPRPTPSTYPDVVEIKPPIISLRSLNTGEPVSNRSYDRNDPREVQWRLVDAIVKNRRFVQFKVVDKEERCLVGDGGTLPCEQKDTLFRLVPTDTGAFILTEPNTGKCLTSENYGSYGFQNCLRTSSAEPSNIPLKHLWIIAPPFGPSRLLo
[0010](4)副豬嗜血桿菌⑶T-C蛋白通過(guò)基因工程克隆表達(dá)得到，具體如下:
a.將如下所示的副豬嗜血桿菌CDT-C蛋白的核苷酸序列克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pcold-sumo中，得到pcold_sumo+Q)TC質(zhì)粒。副豬嗜血桿菌Q)T_C蛋白的核苷酸序列:ATG
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:該試劑盒是將副豬嗜血桿菌的細(xì)胞致死性膨脹毒素(Cytolethal distending toxin,CDT) C蛋白作為包被抗原；判斷標(biāo)準(zhǔn)為:S/P值=(待測(cè)樣本0D450nm均值-陰性對(duì)照0D450nm均值)/ (陽(yáng)性樣本0D450nm均值-陰性對(duì)照0D450nm均值)〈0.200，判為陰性，≥0.200，判為陽(yáng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特點(diǎn)在于:包被抗原副豬嗜血桿菌⑶T-C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特點(diǎn)在于:包被抗原副豬嗜血桿菌⑶T-C蛋白是通過(guò)基因工程方法表達(dá)得到，具體如下: 將核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的副豬嗜血桿菌CDT-C蛋白核苷酸序列克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pcold-sumo中，得到pcold_sumo+Q)TC質(zhì)粒。
4.根據(jù)表達(dá)載體pcold-sumo的操作說(shuō)明，將pcold-sumo+⑶TC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)PlysS感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行表達(dá)、鑒定、純化，得到副豬嗜血桿菌⑶T-C蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特點(diǎn)在于:所述的步驟(2)為:將攜帶pcold-sumo+CDTC質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)PlysS接種于含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，待菌液的0D_吸光值達(dá)到0.6是加入0.5mM的IPTG，在搖床中16°C誘導(dǎo)24h進(jìn)行表達(dá)，收集菌體反復(fù)凍融3次后超聲破碎300W，工作5s，間隔10s，70次，破碎菌液用HIS標(biāo)簽的純化柱進(jìn)行純化，純化后通過(guò)尿素進(jìn)行透析復(fù)性，獲得副豬嗜血桿菌CDT-C蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特點(diǎn)在于:所述試劑盒中副豬嗜血桿菌⑶T-C蛋白的最佳包被濃度為5 μ g/mL。
7.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，包含待檢樣品稀釋板、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、濃縮洗滌液、血清樣本稀釋液、酶標(biāo)抗體工作液、顯色液和終止液，其特征在于:所用的包被抗原為副豬嗜血桿囷⑶T-C蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103941020SQ201410174030
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】岳華, 湯承, 張斌, 王遠(yuǎn)微, 張煥容 申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)