一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條，其包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述金標(biāo)墊上噴射有金標(biāo)CSFV反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)PRRSV反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬PRV反應(yīng)原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設(shè)有三條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述三條檢測(cè)線上分別固定有CSFV反應(yīng)原性多肽、PRRSV反應(yīng)原性多肽、PRV反應(yīng)原性多肽，所述質(zhì)檢線上固定有CSFV抗體、PRRSV抗體和PRV抗體。本發(fā)明的試紙條具有多聯(lián)、特異、敏感，使用簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，可為我國(guó)生豬養(yǎng)殖基層提供高效、實(shí)用的抗體檢測(cè)技術(shù)與產(chǎn)品，為生豬疫病的防疫監(jiān)督提供有效的技術(shù)支撐。
【專利說(shuō)明】一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用多肽抗原制備的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病有豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟和偽狂犬病、口蹄疫和圓環(huán)等，其中藍(lán)耳病危害最為嚴(yán)重。美國(guó)、歐洲養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家普遍采用疫病凈化戰(zhàn)略，針對(duì)一些重要疫病如豬口蹄疫、豬瘟、偽狂犬等已停止使用疫苗，嚴(yán)格檢疫、監(jiān)測(cè)和凈化的措施予以防控。我國(guó)因?yàn)楝F(xiàn)有基礎(chǔ)條件和疫病形勢(shì)的原因，目前尚不能完全照搬國(guó)外疫病凈化的策略，疫苗免疫與疫病監(jiān)控依然是我國(guó)生豬疫病防控最為有效的措施之一。
[0003]由于國(guó)內(nèi)疫苗種類繁多，質(zhì)量參差不齊，免疫流程與技術(shù)人員操作各不相同，因此，疫苗免疫后抗體效價(jià)與免疫效果的監(jiān)測(cè)就顯得極為重要，各類抗體水平的監(jiān)測(cè)急需免疫檢測(cè)技術(shù)與產(chǎn)品的支持。我國(guó)目前常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法有ELISA技術(shù)與乳膠凝集技術(shù)，然而ELISA技術(shù)需耗時(shí)2-3個(gè)小時(shí)，對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求，不太適應(yīng)我國(guó)基層推廣。乳膠凝集則敏感性較低。免疫膠體金層析技術(shù)因兼有ELISA與乳膠凝集技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，既比ELISA快速(僅需5-10分鐘)，又比乳膠凝集敏感(接近ELISA，可達(dá)ng/mL水平)，成為國(guó)內(nèi)外動(dòng)物疫病及抗體水平監(jiān)測(cè)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。
[0004]豬瘟，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸的病毒性傳染病，該病以流行廣、發(fā)病率和死亡率高為特征,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)慘重?fù)p失。該病被國(guó)際動(dòng)物法規(guī)列入A類16種傳染病之一，被我國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生法規(guī)列為一類傳染病。
[0005]豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種繁殖障礙與呼吸系統(tǒng)傳染病。豬是此病的唯一天然宿主。該病以接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率，慢性和高死亡率為特征。病豬生長(zhǎng)十分緩慢，甚至停滯生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，因此對(duì)該病及時(shí)做出診斷有利于降低經(jīng)濟(jì)損失。
[0006]偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起的多種家畜、野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎為主的急性傳染病。豬是本病的主要宿主和帶毒者。通常引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和弱仔；初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，感染率和病死率可達(dá)100%。偽狂犬病(PR) —旦傳入豬群，將導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且很難根除。
[0007]目前，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在上述幾種病的診斷中已得到普遍應(yīng)用，ELISA雖然靈敏度比較高，甚至可以區(qū)分野毒感染和疫苗免疫接種產(chǎn)生的抗體，但操作需要專門的技術(shù)人員和分析儀器，不適合基層的使用，因此，適用于現(xiàn)場(chǎng)使用的快速診斷與檢測(cè)試劑如膠體金試紙條、核酸分子檢測(cè)技術(shù)如實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以及對(duì)一些多病原檢測(cè)的試劑如核酸檢測(cè)生物芯片等的研制與開發(fā)也很受關(guān)注。膠體金試紙卡應(yīng)用簡(jiǎn)單、快速、直觀，不需要配備專門的儀器以及技術(shù)人員，適于基本養(yǎng)殖場(chǎng)的檢測(cè)需求，節(jié)省人力、物力成本。而目前豬病抗體的檢測(cè)模式多是養(yǎng)殖場(chǎng)采集血清樣本然后送到專門的檢測(cè)單位通過(guò)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，從樣本送檢到報(bào)告結(jié)果一般需要3-4天有時(shí)甚至更多的時(shí)間，不利于降低檢測(cè)成本及提高檢測(cè)速度。
[0008]就膠體金試紙條研發(fā)方面而言，目前文獻(xiàn)報(bào)道的多是針對(duì)病原檢測(cè)的單聯(lián)、多聯(lián)試紙卡以及各豬病抗體檢測(cè)的單聯(lián)試紙卡，尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)CSFV、PRRSV, PRV三種疾病抗體的膠體金檢測(cè)試紙卡，且已有的檢測(cè)用金標(biāo)抗原多是利用表達(dá)蛋白或是全病毒抗原，利用多肽作為金標(biāo)抗原的也尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述金標(biāo)墊上噴射有金標(biāo)豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設(shè)有三條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述三條檢測(cè)線上分別固定有豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽，所述質(zhì)檢線上固定有豬瘟病毒抗體、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體和豬偽狂犬病毒抗體。
[0011]作為優(yōu)選的，所述豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽選自以下任一條:
【權(quán)利要求】
1.一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條，包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，其特征在于:所述金標(biāo)墊上噴射有金標(biāo)豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設(shè)有三條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述三條檢測(cè)線上分別固定有豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽，所述質(zhì)檢線上固定有豬瘟病毒抗體、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體和豬偽狂犬病毒抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.1:c-HKVRNEVMVHWFDDE ；
SEQ ID N0.2:GLSTAENALLVALFGYV ；
SEQ ID N0.3:CTAVSPTTLRTE ；
SEQ ID N0.4:KYNTTLLNGSA-c。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.5:c-GFMVPPGLSSEGHLT ；
SEQ ID N0.6:KTKSVKSLPGNKPVP-c。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.7:VALALLLLALAAA ；
SEQ ID N0.8 =YYKNVIVTTYffSGSTYA ；
SEQ ID N0.9:LAIGLLYLAGLYAAFLAYR ；
SEQ ID N0.10:LLAALLAALYARTTL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙條，其特征線在于，金標(biāo)墊上噴涂的金標(biāo)豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、金標(biāo)豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽分別為豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復(fù)合物、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復(fù)合物、偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，硝酸纖維素膜檢測(cè)線上固定的豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽先與非蛋白多聚體偶聯(lián)，得到多聚體偶聯(lián)反應(yīng)原性多肽，再進(jìn)一步將多聚體偶聯(lián)反應(yīng)原性多肽固定到檢測(cè)線上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述多聚體偶聯(lián)反應(yīng)原性多肽的制備方法如下: 1)選取反應(yīng)原性多肽溶解，得到反應(yīng)原性多肽溶液； 2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液； 3)在反應(yīng)原性多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯(lián)劑，混合均勻； 4)將反應(yīng)原性多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應(yīng)，使反應(yīng)原性多肽偶聯(lián)到非蛋白多聚體上；5)用透析袋去除未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑及游離多肽，純化，凍干，得到多聚體偶聯(lián)反應(yīng)原性多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述非蛋白多聚體為聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚苯乙烯磺酸鈉、殼聚糖、葡聚糖硫酸鈉、海藻糖中的任一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述偶聯(lián)劑為EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、乙烯基三乙氧基硅烷、I，5-戊二醛中的任一種。
10.一種豬瘟、豬藍(lán)耳、偽狂犬病毒抗體三聯(lián)金標(biāo)檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步 驟: 1)合成豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽； 2)包被膜制備:將硝酸纖維素膜粘到PVC板上，用劃膜噴金機(jī)將CSFV、PRRSV、PRV抗體的混合溶液噴涂到硝酸纖維素膜上，形成質(zhì)檢線；將與非蛋白多聚體偶聯(lián)的豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽分別噴涂到硝酸纖維素膜上，形成三條檢測(cè)線，干燥后保存?zhèn)溆茫? 3)金標(biāo)墊制備:用膠體金顆粒標(biāo)記鏈霉親和素，然后與生物素化的豬瘟病毒反應(yīng)原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應(yīng)原性多肽、豬偽狂犬病毒反應(yīng)原性多肽結(jié)合形成金標(biāo)結(jié)合物，用金子稀釋液稀釋濃縮的金標(biāo)結(jié)合物到10%~20%，再用劃膜噴金機(jī)定量噴涂到玻璃纖維膜上，干燥保存?zhèn)溆茫? 4)樣品墊制備:用樣品處理液均勻處理玻璃纖維膜，干燥保存?zhèn)溆茫? 5)組裝:金標(biāo)墊與吸水紙分別緊密連接于硝酸纖維素膜的兩端，然后將樣品墊緊密連接于金標(biāo)結(jié)合墊上組裝成大板，再進(jìn)一步切割成試紙條。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103954772SQ201410182377
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】林禮錕, 李其昌, 陳善真, 王志花, 劉博奇, 陳克宏, 王貴平 申請(qǐng)人:廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司