一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種檢測α-1,3Gal抗原的試劑盒。本發(fā)明采用Gal1,3Gal-BSA抗原預先制備固相抗原包被板，組合α-1,3Gal抗原的特異性抗體M86，制備成抗體競爭性ELISA抑制法檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可用于各種生物材料的α-Gal抗原的定性和定量檢測；尤其適用于動物源性生物材料的殘留α-Gal檢測。本發(fā)明試劑盒的特異性達100％，靈敏度為可以檢測3.9x104個/ml的兔血細胞、6.25μg/ml的Gal抗原陽性參考品中的Gal抗原。
【專利說明】—種檢測a-1,3Gal抗原的試劑盒及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種檢測a -1, 3Gal抗原的試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]由哺乳動物細胞外基質(zhì)構(gòu)成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被廣泛用于外科的創(chuàng)傷修復、組織重建和組織工程的支架材料等。異種器官也早已成為解決器官移植中供器官嚴重缺乏的潛在途徑之一。然而，動物源性生物材料或異種器官組織應用于人體所帶來的免疫學問題直接影響著這類材料使用的安全性和有效性。異種器官移植的最大障礙是供器官異種抗原與受者體內(nèi)天然抗體結(jié)合后激活補體系統(tǒng)，攻擊供器官而產(chǎn)生的超急性免疫排斥反應(Hyperacute rejection,HAR),其發(fā)生時間在異種移植后的幾分鐘至數(shù)小時，供器官在短時間內(nèi)發(fā)生功能衰竭使移植失敗。動物源性生物材料雖經(jīng)各種去除抗原的處理，卻難以徹底去除所有的異種抗原，殘留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反應和免疫毒性而影響損傷愈合的重要因素。
[0003]已有研究顯示異種抗原α -半乳糖基抗原(a -1, 3-galactosyle, a -Gal)是動物源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚乳糖胺核心末端殘基的細胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，廣泛存在于豬和其它低等動物體內(nèi)。由于人體及類人猿、舊世紀猴的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因有2個堿基錯位變異而不表達Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗體(占總血清球蛋白的1% )，因此當人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時會導致超急性免疫排斥反應及慢性的免疫毒性反應。動物源性生物材料或異種器官移植中Gal抗原的去除成為降低免疫排斥和慢性免疫毒性反應的關(guān)鍵。目前，如何評價Gal抗原的去除和殘留Gal抗原誘導的免疫毒性尚存在著瓶頸。由于野生型低等動物都表達a-Gal抗原，因此無法利用野生型低等動物去評價a -Gal抗原相關(guān)的免疫毒性反應，只能用狒狒作為受體來考察a -Gal抗原陽性或者異體器官的免疫毒性反應，而這種動物稀少很難普及使用。因此，如何評價動物源性生物材料或異種器官組織的免疫毒性成為困惑檢測與監(jiān)管機構(gòu)因沒有方法和標準可依據(jù)而無法進行有效的安全性和質(zhì)量監(jiān)控，同時也限制了該類產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
[0004]為了填補檢測a -Gal抗原試劑盒的空白，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種檢測a -1, 3Gal抗原的試劑盒。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為:
[0007]本發(fā)明涉及一種檢測a-l，3Gal抗原的試劑盒，所述的試劑盒中含有:固相a -1, 3Gal抗原包被的孔板、封閉液、鼠Μ86抗體、二次抗體酶結(jié)合物、TMB顯色液、顯色終止液、組織裂解液、濃縮洗液、樣品稀釋液、陽性參考品和陰性參考品。
[0008]本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為:固相a -1, 3Gal抗原包被的孔板預先采用a -Gal抗原進行包被，包被緩沖液為PH9.5,0.2M的碳酸鹽緩沖液，包被量優(yōu)選為50?100 μ I ;抗原濃度為10?100ng/ml,優(yōu)選為50?100ng/ml。
[0009]本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為:所述的封閉液為人血清白蛋白；所述的樣品稀釋液為PBS ;所述的顯色終止液為濃硫酸；所述的濃縮洗液為吐溫-20 ;所述的二次抗體酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgM酶結(jié)合物。
[0010]本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為:所述的陽性參考品為動物組織的凍干品，即為豬肝臟組織的凍干粉；陰性參考品為人源組織的凍干品，即為人胎盤組織的凍干粉。所述的陽性參考品和陰性參考品的制備方法為首先將新鮮組織經(jīng)O?4°C生理鹽水漂洗后去除多余水分，再在O?4°C條件下進行勻漿；最后將勻漿組織進行凍干，分裝保存在_20°C。
[0011]本發(fā)明還涉及該檢測a -1, 3Gal抗原的試劑盒的制備方法:配制50ng?200ng/ml 的 Gall, 3Gal_BSA 溶液，緩沖液為 0.2Μ、ρΗ9.5 碳酸鹽緩沖液；取 100 μ L Gall, 3Gal_BSA溶液加入到孔板，4°C孵育過夜；次日用1%的人血清白蛋白進行封閉，封閉的條件優(yōu)選4°C、I?2小時，然后用0.05 %的吐溫-20/PBS洗液進行洗板三次，加洗液250 μ I/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥,密封包裝，4°C保存。
[0012]本發(fā)明還涉及該檢測a -1, 3Gal抗原的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0013](I)試驗樣品制備:將待測試驗樣品放進裂解液中進行低溫勻漿；a -Gal抗原陽性參考品和a-Gal抗原陰性參考品各加入裂解液中進行組織裂解；離心，取上清液備用；
[0014](2)標準曲線對照品制備:取兔血1.25Χ106個/mL細胞數(shù)或者SP2/0細胞2.5 X IO6個/mL，進行倍比稀釋，共5?7個濃度梯度；
[0015](3)樣品抗原-抗體反應:取試驗樣品的上清液和對照樣品的稀釋液各100 μ I放入離心管中，分別加入稀釋后的Μ86抗體溶液(稀釋比例為1:50?1:100) 100 μ I,混勻后4°C孵育過夜，或者37°C孵育I?3小時伴隨輕度搖動；離心后取上清備用；
[0016](4)競爭性剩余抗體-固相抗原反應:取上述反應上清液各100 μ I加入到a -Gal抗原包被酶標板內(nèi)，使反應上清液中的剩余Μ86抗體與孔板內(nèi)的固相抗原充分反應，4°C孵育過夜，或者37°C孵育I?3小時；用洗液洗板3次；
[0017](5) 二次抗體反應和顯色:每孔加入1:1000稀釋的酶標抗體ΙΟΟμ 1，置37°C孵育
0.5?2小時；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物顯色劑TMB，避光顯色后加入終止液，利用酶標儀在450nm測定光吸收值A(chǔ)450nm ；
[0018](6)判定實驗結(jié)果。
[0019]本發(fā)明還涉及該檢測a-1，3Gal抗原的試劑盒在動物源性生物材料中a-Gal抗原的定性或定量檢測中的應用，所述的動物源性生物材料包括動物來源的組織、器官、細胞及其動物組織或器官的衍生物、純化物。所述的應用為在動物源性生物材料的殘留a-Gal的定性或定量檢測。
[0020]下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的解釋和說明。
[0021]本發(fā)明的目的為提供一種直接檢測和評價動物源性生物材料或異種器官組織及其衍生物中alpha-Gal抗原的定量檢測試劑盒。本發(fā)明采用Gall，3Gal_BSA抗原預先制備固相抗原包被板，進而組合a -1, 3Gal抗原的特異性抗體M86，制備成抗體競爭性ELISA抑制法檢測試劑盒。
[0022]本發(fā)明的試劑盒提供了 一種直接檢測和評價動物源性生物材料或異種器官組織及其衍生物中Gal抗原的定量檢測方法。本發(fā)明使用a_l，3Gal抗原的特異性M86抗體，檢測動物源性生物材料中a -1, 3Gal抗原。本試劑盒包括:固相a -Gal抗原包被的孔板(優(yōu)選96-孔板)、封閉液、鼠Μ86抗體、二次抗體酶結(jié)合物、TMB顯色液、顯色終止液、濃縮洗液、樣品稀釋液、組織裂解液、陽性參考品和陰性參考品。其中，酶標板預先包被Gall, 3Gal-BSA,包被緩沖液為ρΗ9.5碳酸鹽緩沖液(0.2Μ)，包被量為100 μ I (50ng/ml抗原濃度);封閉液為質(zhì)量濃度1%的人血清白蛋白；樣品稀釋液為PBS ;顯色液為TMB ;顯色終止液為10倍稀釋(lmol/L)的濃硫酸(H2S04);濃縮洗液為5%的吐溫-20 (使用時稀釋100倍)；二次抗體酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗鼠IgM酶結(jié)合物；組織裂解液；陽性參考品和陰性參考品放置在盒內(nèi)。
[0023]本發(fā)明的試劑盒可以定量性地檢測樣品中的抗原數(shù)，可以檢測待測樣品中微量的殘留a-Gal抗原，具有很高的靈敏度和特異性。本發(fā)明的試劑盒中還組合了其他樣品制備及后續(xù)ELISA檢測的所有試劑，從而可使反應系統(tǒng)化和一體化。
[0024]同時，本試劑盒包含了陽性參考品和陰性參考品，可直接確認試驗體系是否成立，能夠判斷與排除假陽性和假陰性，確保檢測的可靠性。
[0025]本試劑盒可用于各種生物材料、動物器官、組織、細胞及其衍生物、純化物，對其進行a -Gal抗原的定性和定量檢測；尤其適用于動物源性生物材料的殘留a -Gal抗原的檢測。本發(fā)明試劑盒的特異性達100% ;靈敏度為可以檢測3.9x104個/ml的兔血細胞、6.25 μ g/ml的Gal抗原陽性參考品中的Gal抗原。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明試劑盒的工藝流程圖；
[0027]圖2為以兔血為對照品制備的標準曲線圖；
[0028]圖3為陽性參考品的M86結(jié)合抑制率曲線。
[0029]本發(fā)明的【具體實施方式】僅限于進一步解釋和說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
【具體實施方式】
[0030]實施例1: α -1，3Gal抗原檢測試劑盒[0031 ]本發(fā)明的試劑盒包含有:
[0032]L固相a -Gal抗原包被的96-孔板:包被Gall, 3Gal_BSA抗原(DextraLaboratories, UK)，包被緩沖液為(λ 2Μ、ρΗ9.5碳酸鹽緩沖液，包被量為100 μ I (50ng/ml)；
[0033]2.封閉液:質(zhì)量濃度I %的人血清白蛋白；
[0034]3.鼠 M86 抗體:市售產(chǎn)品(Enzo, ALX-801-090-1，a -Gal Epitope, mAb)
[0035]4.二次抗體酶結(jié)合物:辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgM抗體；
[0036]5.TMB 顯色液:I % TMB
[0037]6.顯色終止液:lmol/L濃硫酸(使用時稀釋10倍)；
[0038]7.組織裂解液:直接使用市售產(chǎn)品，碧云天“P0013B RIPA裂解液(強)”；
[0039]8.濃縮洗液:5%的吐溫_20(使用時稀釋100倍)；
[0040]9.樣品稀釋液:PBS ；[0041]10.陽性參考品:豬肝臟組織的凍干粉；
[0042]11.陰性參考品:人胎盤組織的凍干粉。
[0043]實施例2試劑盒的制備
[0044]1.a -Gal抗原包被酶標板的制備:配制Gal 1，3Gal_BSA (DextraLaboratories, UK)溶液，50ng/ml,緩沖液為pH9.5碳酸鹽緩沖液(0.2M);取100 μ I加入到96-孔板(Nunc.Rochester，NY)，4°C孵育過夜；用I %的人血清白蛋白進行封閉(4°C、2小時)，之后用0.05%的吐溫-20/PBS洗液進行洗板三次，加洗液250 μ I/孔，浸泡30s，用微孔板振蕩器震搖清洗三次，第一次5min，后兩次3min ;去除洗液后將包被板放置在生物安全柜內(nèi)通風暴露2分鐘使其風干，與干燥劑一起密封包裝，4°C保存(一周內(nèi)使用)。
[0045]2、其他溶液配制:
[0046]2.1樣品稀釋液:pH7.2~7.5的磷酸鹽緩沖液；
[0047]2.2濃縮洗液:用PBS配制5%的吐溫-20濃縮洗液(使用時稀釋100倍);
[0048]2.3封閉液:用PBS配制I %的人血清白蛋白；
[0049]2.4顯色液TMB的配制:精確稱取TMBlOOmg,加入IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后得到100倍的TMB濃縮液；
[0050]2.5顯色終止液:取54.3ml濃度為95%的濃硫酸，加蒸餾水至1000ml即可得到IOmoI/L的濃硫酸；使用時再稀釋10倍使用；
[0051]2.6配制組織裂解液:可直接使用市售品，碧云天“P0013B RIPA裂解液(強)”；
[0052]2.7M86抗體:用PBS稀釋，稀釋比例為:1:50 ;
[0053]2.8 二次抗體酶結(jié)合物:用PBS稀釋，稀釋比例為:1:1000 ；
[0054]2.9其他試劑配備:a -Gal抗原陽性動物源性生物材料參考品和a -Gal抗原陰性生物材料參考品的制備:首先將新鮮組織經(jīng)4°C生理鹽水漂洗后去除多余水分，再4°C進行勻漿；最后將勻漿組織進行凍干，分裝保存在_20°C。
[0055]采用上述方法制備得到實施例1中公開的試劑盒。
[0056]實施例3:試劑盒質(zhì)量檢測
[0057]1、檢查包被效果:將M86抗體(1: 100作為初始濃度)進行梯度稀釋，與固相抗原包被板固相抗原反應后檢測0D，作圖獲得回歸曲線方程，分析包被效果。推薦合格判定標準為=R2≥ 0.95。
[0058]2.特異性檢測:用實施例1的試劑盒分別檢測a -Gal抗原陽性和a -Gal抗原陰性參考品
[0059]2.1 a -Gal抗原陽性參考品和a -Gal抗原陰性參考品(凍干粉)各2mg加入1ml裂解液中進行組織裂解5~IOmin ；14000rpm, 4°C，離心30min，陽性參考品取上清液進行系列倍比稀釋5個濃度備用；陰性參考品取上清液直接使用。
[0060]2.2、標準曲線對照品準備:取兔血1.25 X IO6個/mL細胞數(shù)或者SP2/0細胞
2.5 X IO6個/mL，進行倍比稀釋，共5~7個濃度梯度；
[0061]2.3、樣品抗原-抗體反應:取陽性參考品及陰性參考品的上清液各100 μ L分別放入1.5ml離心管中，分別加入100 μ I稀釋比例為1:50的Μ86抗體溶液(終濃度為1:100倍稀釋)，混勻后4°C孵育過夜，HOOOrpm離心5分鐘后取上清備用；
[0062] 2.4、競爭性剩余抗體-固相抗原反應:取上述反應上清液各100 μ I加入到a -Gal抗原包被酶標板內(nèi)，使反應上清液中的剩余Μ86抗體與包被酶標板內(nèi)的固相抗原充分反應，37°C伴隨輕輕搖動，反應I~2小時；洗液洗板3次，甩干；
[0063]2.5、二次抗體反應和顯色:每孔加酶標抗體100 μ 1，稀釋比例為1:1000，置371:孵育I小時；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物顯色劑ΤΜΒ，每孔100 μ 1，避光顯色5~lOmin，加入終止液，每孔50 μ I。利用酶標儀在450nm測定光吸收值A(chǔ)450nm。
[0064]實驗結(jié)果如表1、圖2和圖3所示，其中圖2為兔血細胞標準曲線圖，圖3為陽性參考品M86結(jié)合抑制率曲線圖。
[0065]表1.陰性參考品的M86結(jié)合抑制率
【權(quán)利要求】
1.一種檢測a-l，3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有:固相a -1, 3Gal抗原包被的孔板、封閉液、鼠M86抗體、二次抗體酶結(jié)合物、TMB顯色液、顯色終止液、組織裂解液、濃縮洗液、樣品稀釋液、陽性參考品和陰性參考品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測a-l，3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，固相α-1，3Gal抗原包被的孔板預先采用a -Gal抗原進行包被，包被緩沖液為pH9.5,0.2Μ的碳酸鹽緩沖液，包被量為10~100 μ 1，優(yōu)選為50~100 μ I ;抗原濃度為10~100ng/ml，優(yōu)選為50~100ng/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測a_l，3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的封閉液為人血清白蛋白；所述的樣品稀釋液為PBS ;所述的顯色終止液為濃硫酸；所述的濃縮洗液為吐溫-20 ;所述的二次抗體酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgM酶結(jié)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測a_l，3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的陽性參考品為動物組織的凍干品，優(yōu)選豬肝臟組織的凍干粉；陰性參考品為人源組織的凍干品，優(yōu)選人胎盤組織的凍干粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測a_l，3Gal抗原的試劑盒，其特征在于，所述的陽性參考品和陰性參考品的制備方法為:首先將新鮮組織經(jīng)O~4°C生理鹽水漂洗后去除多余水分，再在O~4°C條件下進行勻漿；最后將勻漿組織進行凍干，分裝保存在_20°C。
6.一種如權(quán)利要求1所述的檢測a_l，3Gal抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的ct -Gal抗原包被孔板的制備方法為:配制50ng~200ng/ml的Gall, 3Gal_BSA溶液,緩沖液為0.2M、pH9.5碳酸鹽緩沖液；取100 μ L Gall, 3Gal_BSA溶液加入到孔板，4°C孵育過夜；次日用1%的人血清白蛋白進行封閉，封閉的條件優(yōu)選4°C、1~2小時，然后用0.05%的吐溫-20/PBS洗液進行 洗板三次，加洗液250 μ L/孔，浸泡30s，清洗三次；去除洗液后干燥，密封包裝，4 °C保存。
7.—種如權(quán)利要求1所述的檢測a_l，3Gal抗原的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)試驗樣品制備:將待測試驗樣品放進裂解液中進行低溫勻漿；a-Gal抗原陽性參考品和a -Gal抗原陰性參考品各加入裂解液中進行組織裂解；離心，取上清液備用； (2)標準曲線對照品制備:取兔血1.25 X IO6個/mL細胞數(shù)或者SP2/0細胞2.5 X IO6個/mL，進行倍比稀釋，共5~7個濃度梯度； (3)樣品抗原-抗體反應:取試驗樣品的上清液和對照樣品的稀釋液各100μ I放入離心管中，分別加入稀釋后的Μ86抗體溶液100 μ 1，稀釋比例為1:50~1:100 ;混勻后4°C孵育過夜，或者37°C孵育I~3小時伴隨輕度搖動；離心后取上清備用； (4)競爭性剩余抗體-固相抗原反應:取上述反應上清液各100μ I加入到a -Gal抗原包被酶標板內(nèi)，使反應上清液中的剩余Μ86抗體與孔板內(nèi)的固相抗原充分反應，4°C孵育過夜，或者37°C孵育I~3小時；用洗液洗板3次； (5)二次抗體反應和顯色:每孔加1:1000稀釋的酶標抗體100 μ 1，置37 °C孵育0.5~2小時；洗液洗板3次，甩干；加入酶底物顯色劑TMB，避光顯色后加入終止液，利用酶標儀在450nm測定光吸收值A(chǔ)450nm ； (6)判定實驗結(jié)果。
8.—種如權(quán)利要求1所述的檢測a -1, 3Gal抗原的試劑盒在動物源性生物材料中a -Gal抗原的定性或定量檢測中的應用，所述的動物源性生物材料包括動物來源的組織、器官、細胞及其動物組織或器官的衍生物、純化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，所述的應用為在動物源性生物材料的殘留α-Gal的定性或定量檢測。
【文檔編號】G01N33/53GK103983767SQ201410187336
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】徐麗明, 邵安良, 柯林楠, 單永強, 陸艷, 楊昭鵬 申請人:中國食品藥品檢定研究院