一種毛蚶的含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種毛蚶蛋白多肽及多糖的含量測定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測樣品中是毛蚶，再測定毛蚶多肽和多糖的含量。毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范圍內(nèi)效果更好。使毛蚶制劑在生產(chǎn)和使用中有效的保證產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而保證藥品療效。
【專利說明】一種毛蚶的含量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥品檢測方法，具體涉及一種毛蚶的含量測定方法，屬藥品【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]毛蚶肉含豐富的蛋白質(zhì)、維生素及人體所必需的氨基酸，自古就有著食用、藥用價(jià)值，《醫(yī)林纂要》注“蚶肉補(bǔ)心血、散瘀血、除煩醒酒、破結(jié)消痰”，《日華子本草》注“蚶肉益血色”。近年來，研究報(bào)道顯示毛蚶有抗腫瘤作用，具有清除體內(nèi)自由基、提高機(jī)體免疫力的功效。毛蚶肉制劑對肺癌、腎癌、胃癌、肝癌等多種癌癥具有較好的治療作用，且安全性良好。
[0003]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道毛蚶多肽和多糖是毛蚶的主要生物活性成分，具有保肝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的功效。暨南大學(xué)博士生導(dǎo)師于榮敏教授2011年I月5日報(bào)道，新鮮毛蚶去殼，經(jīng)勻漿、離心、透析、凍干后制得毛蚶多肽提取物，法測定對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響及對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響；對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響；小鼠脾淋巴細(xì)胞周期的變化；對主要細(xì)胞因子IFN-Y和IL-4分泌水平的影響。結(jié)果毛蚶多肽提取物能夠顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅活性和小鼠NK細(xì)胞殺傷活性；促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞G0/G1期向DNA合成期(s期)轉(zhuǎn)化；協(xié)同Con A作用，能夠增加IFN-Y的分泌，并且能夠抑制IL-4的分泌。中國藥科大學(xué)竇昌貴等報(bào)道，用毛蚶肉水解液小鼠灌胃，結(jié)果:對四氯化碳、硫代乙胺和強(qiáng)的松龍引起的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高均有明顯的降低作用，表明毛蚶水解液對實(shí)驗(yàn)性肝損傷有顯著的保護(hù)作用。
[0004]我們試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛蚶多肽可明顯抑制乙肝表面抗原和E抗原的表達(dá)，并對乙肝DNA有抑制作用。
[0005]蛋白質(zhì)和多糖是生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，所有動(dòng)植物生命體都含有這兩種基本物質(zhì)，在無法確定來源的情況下，就不能保證藥品的有效性，不能準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)和多糖的含量，就無法在生產(chǎn)和使用中保證產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而藥品療效得不到保證。
[0006]現(xiàn)有文獻(xiàn)還沒有毛蚶多肽和多糖專屬性和含量測定的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種毛蚶多肽和多糖的含量測定方法，使毛蚶制劑在生產(chǎn)和使用中有效的保證產(chǎn)品質(zhì)量。
[0008]一種毛蚶的含量測定方法，其特征在于先通過凝膠色譜柱高效液相色譜法鑒別樣品中的多肽和多糖，如果兩項(xiàng)專屬性都滿足，則確定是毛蚶，再測定毛蚶中多肽和多糖的含量，具體步驟如下:
(I)毛蚶多肽鑒別:
色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相；檢測波長為280 nm ;柱溫:25°C;流速0.4ml/min ;檢測波長280nm ；理論板數(shù)按蛋白質(zhì)分子量100000計(jì)算不低于5000 ；
稱取樣品IOg,加12倍水超聲提取30 min,離心10 min,取上層液,濾過,濾液按體積分?jǐn)?shù)60% (w/v)加入硫酸銨，O?4°C放置過夜，離心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氫銨溶液為透析液，用截留分子量為3500的透析膜，O?4°C條件下充分透析，將透析膜內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50ml量瓶內(nèi)，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液；
取毛蚶多肽溶液IOy 1，注入液相色譜儀，測定，記錄圖譜；圖譜中如果在保留時(shí)間15.6min±5%之內(nèi)有毛蚶多肽的特征峰，其分子量為88070，滿足毛蚶多肽專屬性，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無則判為偽品；
(2)毛酣多糖鑒別:
色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.lmol/L的硫酸鈉溶液為流動(dòng)相；示差折光檢測器；柱溫:40°C ;流速:0.5ml /min ;理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。
[0009]稱取含毛蚶提取物約2g的樣品，加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保溫3hr，超聲提取30min，脫脂棉過濾，取濾渣，揮干；加去離子水20ml，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5?8，80°C水浴3hr，時(shí)時(shí)攪拌，過濾，濾液另器保存，濾渣加去離子水20ml，繼續(xù)水浴2hr，時(shí)時(shí)攪拌，過濾，濾液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心,沉淀加去離子水20ml，80°C水浴2hr，離心，取上清液；加1/4體積的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，劇烈振搖，離心，取上層液體，重復(fù)操作多次，至液面中間蛋白層完全消失，取上層液體，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心離心，取沉淀，80°C以下減壓干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流動(dòng)相使溶解，制成每Iml含IOmg的溶液，即得。
[0010]取毛蚶多糖供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，測定記錄圖譜；圖譜中如果以圖譜中的S峰為參照，呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，且以S峰為1，2個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間在峰I為
0.56±10%、峰2為0.68±10%，其重均分子量(Mw)在6.88?9.47 X IO5之間，滿足毛蚶多糖專屬性。
[0011]同時(shí)滿足毛蚶多肽和多糖的專屬性，說明是毛蚶，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無則判為偽品；
(3)毛蚶多肽含量測定:稱取樣品0.5-2g，加20-40倍水，超聲使分散均勻，加10-20%三氯乙酸15-40ml，混勻，靜置20-50分鐘，過濾，取濾紙及濾渣干燥，照《中國藥典》2010年版一部附錄IX L第一法，氮測定法測定毛蚶多肽的含量；我們經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g。
(4)毛蚶多糖含量測定:稱取含毛蚶提取物約l_4g樣品，精密稱定，置圓底燒瓶中，力口30-50倍水，加熱回流1-3小時(shí)，用脫脂棉濾過，濾液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加5-10倍乙醇，攪拌，離心5-20分鐘，沉淀加水溶解，置20-50量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加1/2體積的4%苯酚溶液，混勻，迅速加入硫酸5-10ml，搖勻，于30-50°C水浴中保溫20-60分鐘，取出，置冰水浴中2_10分鐘，取出，即得毛蚶多糖供試品。取毛蚶多糖供試品溶液以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在488nm的波長處測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算含量。我們經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖(C6H1206)計(jì)，不得少于24mg。
毛蚶提取物經(jīng)真空干燥后的樣品蛋白質(zhì)和多糖含量分別為60%和13%，其中蛋白質(zhì)含量約是多糖含量的5倍，在毛蚶有效成分研究時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，小分子量的多肽和多糖為抗腫瘤的主要成分，而大分子量的蛋白生物活性低，藥理效果較差。在對毛蚶提取物的研究中，我們經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范圍內(nèi)效果更好。
[0012]本發(fā)明的方法測定毛蚶中多肽的含量不僅專屬性強(qiáng)，而且提供了毛蚶多肽和多糖的比例，能夠保證用毛蚶制備的藥品有效和質(zhì)量可控。
[0013]為了便于理解本發(fā)明，特通過下面試驗(yàn)例進(jìn)一步說明:
一、兩批毛蚶提取物片劑樣品含量測定
(I)毛蚶多肽鑒別:
色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相；檢測波長為280 nm ;柱溫:25°C;流速0.4ml/min ;檢測波長280nm ；理論板數(shù)按蛋白質(zhì)分子量100000計(jì)算不低于5000 ；
分別稱取樣品IOg,加12倍水超聲提取30 min,離心10 min,取上層液,濾過,濾液按體積分?jǐn)?shù)60% (w/v)加入硫酸銨，O?4°C放置過夜，離心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氫銨溶液為透析液，用截留分子量為3500的透析膜，O?4°C條件下充分透析，將透析膜內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50ml量瓶內(nèi)，用水定容，O?4°C保存，即得毛蚶多肽溶液；
分別取毛蚶多肽溶液10μ 1，注入液相色譜儀，測定，記錄圖譜;Α樣品特征圖譜中呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，以圖譜中的S峰為1，峰I相對保留時(shí)間為0.58、峰2相對保留時(shí)間為0.69，其分子量為688036，B樣品特征圖譜中呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，以圖譜中的S峰為1，峰I相對保留時(shí)間為0.55、峰2相對保留時(shí)間為0.63。其分子量為784503。結(jié)果顯示兩批毛蚶提取物片劑均滿足毛蚶多糖專屬性，繼續(xù)進(jìn)行以下操作。
[0014](2)毛蚶多糖鑒別:
色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.lmol/L的硫酸鈉溶液為流動(dòng)相；示差折光檢測器；柱溫:40°C ;流速:0.5ml /min ;理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。
[0015]分別稱取含毛蚶提取物2g的樣品，加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保溫3hr，超聲提取30min，脫脂棉過濾，取濾渣，揮干；加去離子水20ml，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5?8，80°C水浴3hr，時(shí)時(shí)攪拌，過濾，濾液另器保存，濾渣加去離子水20ml，繼續(xù)水浴2hr，時(shí)時(shí)攪拌，過濾，濾液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心,沉淀加去離子水20ml，80°C水浴2hr，離心，取上清液；加1/4體積的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，劇烈振搖，離心，取上層液體，重復(fù)操作多次，至液面中間蛋白層完全消失，取上層液體，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心離心，取沉淀，80°C以下減壓干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流動(dòng)相使溶解，制成每Iml含IOmg的溶液，即得。
[0016]分別取毛蚶多糖供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，測定記錄圖譜；毛蚶提取物制劑片劑A樣品圖譜中在保留時(shí)間15.537min有一尖銳的特征峰，其分子量為88070 ;毛蚶提取物制劑片劑B樣品特征圖譜中在保留時(shí)間15.698min有一尖銳的特征峰，其分子量為88070。結(jié)果顯示兩批毛蚶提取物顆粒劑滿足毛蚶多肽專屬性。
[0017]同時(shí)滿足毛蚶多肽和多糖的專屬性，說明是毛蚶制得，繼續(xù)進(jìn)行含量測定；
(3)毛蚶多肽含量測定:分別稱取樣品各1.0g，精密稱定，加30倍水，超聲使分散均勻，加12%三氯乙酸30ml，混勻，靜置30分鐘，過濾，取濾紙及濾渣干燥，照《中國藥典》2010年版一部附錄IX L第一法，氮測定法測定毛蚶多肽的含量，計(jì)算得:制劑A樣品中每g毛蚶多肽0.45g ;制劑B樣品中每g毛紺多肽0.15g。
[0018](4)毛蚶多糖含量測定:分別稱取含毛蚶提取物2.5g樣品，精密稱定，置圓底燒瓶中，加40倍水，加熱回流2小時(shí)，用脫脂棉濾過，濾液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2ml，加9倍乙醇，攪拌，離心10分鐘，沉淀加水溶解，置50ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，加1/2體積的4%苯酚溶液，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，于40°C水浴中保溫30分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，即得毛蚶多糖供試品。取毛蚶多糖供試品溶液以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在488nm的波長處測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算得:制劑A樣品中每g毛蚶提取物含多糖53mg。制劑B樣品中每g毛蚶提取物含多糖28mg。
[0019]制劑A樣品中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的5倍，制劑B樣品中毛蚶多肽含量是毛蚶多糖含的10倍。
[0020]二、兩批毛蚶提取物片劑藥效比較
試驗(yàn)方法:選取健康小鼠10只，接種肺癌細(xì)胞株(2*105/只)，接種14d后，無菌條件下剝離腫瘤，用組織勻漿器制成細(xì)胞懸液。將健康小鼠30只，隨機(jī)分為3組，各組均尾靜脈接受上述制備的細(xì)胞懸液0.2ml (含細(xì)胞數(shù)1*105/只)。分別給予制劑A、B 0.25g/kg靜脈注射，空白對照組注射等量生理鹽水。各組均每日一次，連續(xù)10天。
[0021]觀察項(xiàng)目:停藥后觀察各組體重質(zhì)量變化，生存天數(shù)，按以下公式計(jì)算生存延長率LS=[(用藥組生存天數(shù)/對照組生存天數(shù))]-1*100%。處死動(dòng)物稱肺重，計(jì)算肺重指數(shù)。肺重指數(shù)=小鼠肺重(mg) /體重量(IOg)之比*100%。
[0022]結(jié)果見表:
【權(quán)利要求】
1.一種毛蚶的含量測定方法，其特征在于先通過凝膠色譜柱高效液相色譜法鑒別樣品中的多肽和多糖，如果兩項(xiàng)專屬性都滿足，則確定是毛蚶，再測定毛蚶中多肽和多糖的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種毛蚶多肽的鑒別方法，其特征其特征在于使用凝膠色譜柱高效液相色譜法，具體步驟如下: 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相；檢測波長為280 nm ;柱溫:25°C;流速0.4ml/min ;檢測波長280nm ；理論板數(shù)按蛋白質(zhì)分子量100000計(jì)算不低于5000 ； 稱取樣品IOg,加12倍水超聲提取30 min,離心10 min,取上層液,濾過,濾液按體積分?jǐn)?shù)60% (w/v)加入硫酸銨，O~4°C放置過夜，離心，取沉淀，加水IOml溶解，以1%的碳酸氫銨溶液為透析液，用截留分子量為3500的透析膜，O~4°C條件下充分透析，將透析膜內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50ml量瓶內(nèi)，用水定容，O~4°C保存，即得毛蚶多肽溶液； 取毛蚶多肽溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，記錄圖譜；圖譜中如果在保留時(shí)間15.6min±5%之內(nèi)有毛蚶多肽的特征峰，其分子量為88070，滿足毛蚶多肽專屬性，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無則 判為偽品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種毛蚶多糖的鑒別方法，其特征在于使用凝膠色譜柱高效液相色譜法，具體步驟如下: 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.lmol/L的硫酸鈉溶液為流動(dòng)相；示差折光檢測器；柱溫:40°C ;流速:0.5ml /min ;理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于5000 ； 稱取含毛蚶提取物約2g的樣品，加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保溫3hr,超聲提取30min,脫脂棉過濾,取濾洛,揮干；加去離子水20ml ,用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5~8，80°C水浴3hr，時(shí)時(shí)攪拌，過濾，濾液另器保存，濾渣加去離子水20ml，繼續(xù)水浴2hr，時(shí)時(shí)攪拌，過濾，濾液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心,沉淀加去離子水20ml，80°C水浴2hr，離心，取上清液；加1/4體積的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，劇烈振搖，離心，取上層液體，重復(fù)操作多次，至液面中間蛋白層完全消失，取上層液體，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心離心，取沉淀，80°C以下減壓干燥，制得毛蚶多糖；取毛蚶多糖，加流動(dòng)相使溶解，制成每1ml含IOmg的溶液，即得； 取毛蚶多糖供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，測定記錄圖譜；圖譜中如果以圖譜中的S峰為參照，呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，且以S峰為1，2個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間在峰I為0.56±10%、峰2為0.68±10%，其重均分子量(Mw)在6.88~9.47X105之間，滿足毛蚶多糖專屬性； 同時(shí)滿足毛蚶多肽和多糖的專屬性，說明是毛蚶，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無則判為偽品O
4.根據(jù)權(quán)利要求1的一種毛蚶多糖的含量測定方法，其特征在于使用定氮法測定含量，具體步驟如下: 稱取樣品0.5-2g，加20-40倍水，超聲使分散均勻，加10-20%三氯乙酸15_40ml，混勻，靜置20-50分鐘，過濾，取濾紙及濾渣干燥，照《中國藥典》2010年版一部附錄IX L第一法，氮測定法測定毛蚶多肽的含量；我們經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中每g毛蚶提取物含多肽不得少于0.12g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的一種毛蚶多肽的含量測定方法，其特征在于使用分光光度法測定含量，具體步驟如下: 稱取含毛蚶提取物約l_4g樣品，精密稱定，置圓底燒瓶中，加30-50倍水，加熱回流1-3小時(shí)，用脫脂棉濾過，濾液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加5-10倍乙醇，攪拌，離心5-20分鐘，沉淀加水溶解，置20-50量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加1/2體積的4%苯酚溶液，混勻，迅速加入硫酸5_10ml，搖勻，于30_50°C水浴中保溫20-60分鐘，取出，置冰水浴中2-10分鐘，取出，即得毛蚶多糖供試品；取毛蚶多糖供試品溶液以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在488nm的波長處測定吸光度；從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算含量；制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖(C6H1206)計(jì)，不得少于24mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的毛蚶多肽和多糖的含量測定，其特征在于毛蚶多肽的含量是毛蚶多糖含量的5-7倍范圍內(nèi)效果更好。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的一種毛蚶蛋白質(zhì)多肽的含量測定方法，其特征在于可用 于毛蚶提取物各種制劑的含量測定。
【文檔編號】G01N30/02GK103969366SQ201410187549
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】劉圣梅, 王麗, 趙穎, 石紅艷, 劉金磊 申請人:濟(jì)南康眾醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司