一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多糖是毛蚶多糖，再用分光光度法測(cè)定含量。制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多肽不得少于24mg，含量越高，療效更好。這種方法可用于毛蚶提取物各種制劑的含量測(cè)定，使毛蚶制劑在生產(chǎn)和使用中有效的保證產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而保證藥品療效。
【專利說(shuō)明】一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥品檢測(cè)方法，具體涉及一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，屬藥品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]毛蚶肉含豐富的蛋白質(zhì)、維生素及蛋白質(zhì)、多糖，自古就有著食用、藥用價(jià)值，《醫(yī)林纂要》注“蚶肉補(bǔ)心血、散瘀血、除煩醒酒、破結(jié)消痰”，《日華子本草》注“蚶肉益血色”。近年來(lái)，研究報(bào)道顯示毛蚶有抗腫瘤作用，具有清除體內(nèi)自由基、提高機(jī)體免疫力的功效，且安全性良好。
[0003]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道毛蚶多糖是毛蚶的主要生物活性成分之一，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的功效。中國(guó)藥科大學(xué)博士生導(dǎo)師沈于龍教授報(bào)道，從毛蚶體內(nèi)分離純化得到毛蚶多糖精品，能夠顯著的促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有顯著的體外免疫活性。
[0004]多糖是生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，所有動(dòng)植物生命體都含有多糖，在無(wú)法確定多糖來(lái)源的情況下，就不能保證藥品的有效性，不能準(zhǔn)確測(cè)定多糖的含量，就無(wú)法在生產(chǎn)和使用中保證產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)而藥品療效得不到保證。
[0005]現(xiàn)有文獻(xiàn)還沒(méi)有毛蚶多糖專屬性和含量測(cè)定的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，使毛蚶制劑在生產(chǎn)和使用中有效的保證產(chǎn)品質(zhì)量。
[0007]—種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多糖是毛蚶多糖，再用分光光度法測(cè)定含量，具體步驟如下:
(1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.lmol/L的硫酸鈉溶液為流動(dòng)相；示差折光檢測(cè)器；柱溫:40°C ;流速:0.5ml /min ;理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于5000 ；
(2)稱取含毛蚶提取物約2g的樣品，加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保溫3hr，超聲提取30min，脫脂棉過(guò)濾，取濾渣，揮干；加去離子水20ml，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5?8，80°C水浴3hr，時(shí)時(shí)攪拌，過(guò)濾，濾液另器保存，濾渣加去離子水20ml，繼續(xù)水浴2hr，時(shí)時(shí)攪拌，過(guò)濾，濾液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心，沉淀加去離子水20ml，80°C水浴2hr，離心，取上清液；加1/4體積的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，劇烈振搖，離心，取上層液體，重復(fù)操作多次，至液面中間蛋白層完全消失，取上層液體，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心離心，取沉淀，80°C以下減壓干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流動(dòng)相使溶解，制成每Iml含IOmg的溶液，即得；
(3)取毛蚶多糖供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定記錄圖譜；圖譜中如果以圖譜中的S峰為參照，呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，且以S峰為1，2個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間在峰I為0.56± 10%、峰2為0.68± 10%，其重均分子量(Mw)在6.88?9.47X105之間，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無(wú)則判為偽品；
(4)稱取含毛蚶提取物約l_4g樣品，精密稱定，置圓底燒瓶中，加30-50倍水，加熱回流1-3小時(shí)，用脫脂棉濾過(guò)，濾液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加5-10倍乙醇，攪拌，離心5-20分鐘，沉淀加水溶解，置20-50ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加1/2體積的4%苯酚溶液，混勻，迅速加入硫酸5_10ml，搖勻，于30_50°C水浴中保溫20-60分鐘，取出，置冰水浴中2-10分鐘，取出，即得毛蚶多糖供試品。取毛蚶多糖供試品溶液以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算含量。我們經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖(C6H1206)計(jì)，不得少于24mg，含量越高，療效更好。
毛蚶提取物經(jīng)真空干燥后的樣品多糖含量為13%，在毛蚶制劑化學(xué)成分研究中，我們發(fā)現(xiàn)，多糖的活性與去相對(duì)分子量質(zhì)量有關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量越大，則分子體積越大，不利于多糖發(fā)揮生物活性，小分子量的多糖為主要活性成分。而大分子量的魁蚶、泥蚶、花蛤、扇貝提取物，其所含的多糖分子量不同于毛蚶多糖，用凝膠色譜柱高效液相色譜法測(cè)定，在相對(duì)保留時(shí)間0.56± 10%和0.68± 10%無(wú)毛蚶多糖特征峰，因此用本發(fā)明的方法測(cè)定毛蚶多糖的含量專屬性強(qiáng)，能夠保證用毛蚶制備的藥品有效和質(zhì)量可控。
[0008]為了便于理解本發(fā)明，特通過(guò)下面試驗(yàn)例進(jìn)一步說(shuō)明:
一、兩批毛蚶提取物
(1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.lmol/L的硫酸鈉溶液為流動(dòng)相；示差折光檢測(cè)器；柱溫:40°C ;流速:0.5ml /min ;理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于5000 ；
(2)稱取含毛蚶提取物各2g，分別加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保溫3hr,超聲提取30min,脫脂棉過(guò)濾,取濾洛,揮干；加去離子水20ml ,用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5?8，80°C水浴3hr，時(shí)時(shí)攪拌，過(guò)濾，濾液另器保存，濾渣加去離子水20ml，繼續(xù)水浴2hr，時(shí)時(shí)攪拌，過(guò)濾，濾液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心,沉淀加去離子水20ml，80°C水浴2hr，離心，取上清液；加1/4體積的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，劇烈振搖，離心，取上層液體，重復(fù)操作多次，至液面中間蛋白層完全消失，取上層液體，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心離心，取沉淀，80°C以下減壓干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流動(dòng)相使溶解，制成每Iml含IOmg的溶液，即得；
(3)取毛蚶多糖供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定記錄圖譜;Α樣品特征圖譜中呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，以圖譜中的S峰為1，峰I相對(duì)保留時(shí)間為0.58、峰2相對(duì)保留時(shí)間為0.69，其分子量為688036，Β樣品特征圖譜中呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，以圖譜中的S峰為1，峰I相對(duì)保留時(shí)間為0.55、峰2相對(duì)保留時(shí)間為0.63。其分子量為784503，結(jié)果顯示兩批毛蚶提取物顆粒劑均是用毛蚶制得。繼續(xù)進(jìn)行含量測(cè)定；
(4)分別稱取含毛蚶提取物2.5g樣品，精密稱定，置圓底燒瓶中，加40倍水，加熱回流2小時(shí)，用脫脂棉濾過(guò)，濾液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2ml，加9倍乙醇，攪拌，離心10分鐘，沉淀加水溶解，置50ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，加1/2體積的4%苯酚溶液，混勻，迅速加入硫酸7ml，搖勻，于40°C水浴中保溫30分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，即得毛蚶多糖供試品。取毛蚶多糖供試品溶液以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算含量。
[0009]制劑A樣品中每g毛酣提取物含多糖53mg。制劑B樣品中每g毛酣提取物含多糖28mg。
[0010]二、兩種制劑藥效比較:毛蚶提取物制劑免疫調(diào)節(jié)作用試驗(yàn)
試驗(yàn)方法:選取健康小鼠30只，隨機(jī)分為3組，各組均給予制劑A、B 0.25g/kg靜脈注射，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。各組均每日一次，連續(xù)15天。
[0011]觀察項(xiàng)目:最后一次給藥后，頸椎脫白處死小鼠，稱重，取出小鼠脾臟、胸腺稱重，并計(jì)算臟器指數(shù)。
[0012]結(jié)果見(jiàn)表:
【權(quán)利要求】
1.一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，其特征在于先用凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多糖是毛蚶多糖，再用分光光度法測(cè)定含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的凝膠色譜柱高效液相色譜法確定被測(cè)樣品中的多糖是毛蚶多糖，其特征在于具體步驟如下: (1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性:用親水球形高聚物為填充劑的凝膠色譜柱；以0.lmol/L的硫酸鈉溶液為流動(dòng)相；示差折光檢測(cè)器；柱溫:40°C ;流速:0.5ml /min ;理論板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于5000 ； (2)稱取含毛蚶提取物約2g的樣品，加15倍的石油醚:乙醇=1:1的溶液，于40°C水浴保溫3hr，超聲提取30min，脫脂棉過(guò)濾，取濾渣，揮干；加去離子水20ml，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5?8，80°C水浴3hr，時(shí)時(shí)攪拌，過(guò)濾，濾液另器保存，濾渣加去離子水20ml，繼續(xù)水浴2hr，時(shí)時(shí)攪拌，過(guò)濾，濾液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心，沉淀加去離子水20ml，80°C水浴2hr，離心，取上清液；加1/4體積的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，劇烈振搖，離心，取上層液體，重復(fù)操作多次，至液面中間蛋白層完全消失，取上層液體，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，棄上清液，下層液離心離心，取沉淀，80°C以下減壓干燥，制得毛蚶多糖；取毛蚶多糖，加流動(dòng)相使溶解，制成每Iml含IOmg的溶液； (3)取毛蚶多糖供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定記錄圖譜；圖譜中如果以圖譜中的S峰為參照，呈現(xiàn)2個(gè)特征峰，且以S峰為1，2個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間在峰I為0.56±10%、峰2為0.68±10%，其重均分子量(Mw)在6.88?9.47X105之間，則繼續(xù)進(jìn)行以下操作，如無(wú)則判為偽品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，其特征在于稱取含毛蚶提取物約l_4g樣品，精密稱定，置圓底燒瓶中，加30-50倍水，加熱回流1-3小時(shí)，用脫脂棉濾過(guò)，濾液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加5_10倍乙醇，攪拌，離心5_20分鐘，沉淀加水溶解，置20-50ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取l_5ml，加1/2體積的4%苯酚溶液，混勻，迅速加入硫酸5-10ml，搖勻，于30-50°C水浴中保溫20-60分鐘，取出，置冰水浴中2-10分鐘，取出，即得毛蚶多糖供試品；取毛蚶多糖供試品溶液以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)力要求3的一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，其特征在于制劑中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖不得少于24mg，含量越高，療效更好。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2或權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的一種毛蚶多糖的含量測(cè)定方法，其特征在于可用于毛蚶提取物各種制劑的含量測(cè)定。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103969384SQ201410187644
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】盧寧, 張為勝, 蘇靜, 劉金磊, 石紅艷 申請(qǐng)人:濟(jì)南康眾醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司