中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥材分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開一種中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括羅仙子藥材的水解、衍生化、高效液相色譜條件的選擇及測定，成功構(gòu)建了中藥羅仙子指紋圖譜，確定了保留時間0~35min共有24個共有特征峰，適用于日后對中藥羅仙子藥材真?zhèn)魏推焚|(zhì)的進一步鑒別和分類。此外，本發(fā)明公開的中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法步驟簡單，成本低廉，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，操作性強，精密度高。
【專利說明】中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥材分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥羅仙子(ifesca俗稱蛆,又名五谷蟲、谷蟲、水仙子等,廣東習(xí)稱為羅仙子。載于《本草綱目》蟲部第四十卷，該蟲性寒、無毒，入脾、胃經(jīng)，能治療臁瘡、唇疔和癰疽等感染性外科疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，羅仙子中富含凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白等活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等活性。
[0003]中藥指紋圖譜是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一，已經(jīng)成為公認的評價中藥質(zhì)量和鑒別中藥品種的有效手段之一，屬于國內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評價模式?，F(xiàn)階段，指紋譜圖的研究和應(yīng)用已逐漸拓展至生物、食品、化工等領(lǐng)域，成為控制產(chǎn)品質(zhì)量的有效工具。迄今為止尙未有關(guān)于中 藥羅仙子的指紋圖譜報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，本發(fā)明選取了十個不同生產(chǎn)批次的羅仙子抗動脈粥樣硬化活性部位提取物樣品，利用2，4_ 二硝基氟苯為柱前衍生劑，建立了羅仙子抗動脈粥樣硬化有效部位水解氨基酸的高效液相指紋圖譜。
[0005]本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
51.羅仙子有效部位提取物的制備:新鮮羅仙子勻漿、過濾、超聲粉碎、過濾取濾液、加熱、冷卻、離心取上清液、超濾、凍干制得羅仙子有效部位提取物；
52.供試品溶液的制備:將羅仙子有效部位提取物與鹽酸混合水解，過濾取濾液，濾液干燥后的殘渣再用50%乙醇溶解得供試品前處理液；供試品前處理液加入二硝基氟苯DNFB衍生化制得供試品溶液；
53.高效液相色譜分析:色譜分離柱為WelchUltimate XB-C8柱,250 mmX4.6 mm,5 μ m ;流動相為乙腈、水、0.05mol/L乙酸鈉緩沖液;流速:1.0ml/min ;檢測波長:360nm ;柱溫:44°C ;進樣量:10 μ L ;采用梯度洗脫的方式，洗脫程序如下:
時間Omin 70%乙酸鈉緩沖液、15%乙腈、15%水；
時間13min 38%乙酸鈉緩沖液、31%乙腈、31%水；
時間21min 32%乙酸鈉緩沖液、34%乙腈、34%水；
時間23min 50%乙腈、50%水；
時間25min 50%乙腈、50%水；
時間26min 70%乙酸鈉緩沖液、15%乙腈、15%水；
時間35min 70%乙酸鈉緩沖液、15%乙腈、15%水。
[0006]優(yōu)選地，步驟S3中所述0.05mol/L乙酸鈉緩沖液中還含有10ml/L N, N- 二甲基甲酰胺，有利于檢測樣品中不同有效成分的洗脫分離。
[0007]本發(fā)明所述羅仙子有效部位提取物的水解采用常規(guī)技術(shù)，加入鹽酸混合水解即可，作為一種實施方案，水解的具體步驟為將羅仙子有效部位提取物與6mol/L鹽酸混合在10(Tl20°C條件下水解20~30h。
[0008]優(yōu)選地，步驟S2中所述羅仙子有效部位提取物與鹽酸混合的質(zhì)量體積比為Img:
0.8^1.2mL，更有利于促進羅仙子的水解。
[0009]優(yōu)選地，步驟S2中所述50%乙醇的用量為濾液體積的0.3^0.8，利于后續(xù)衍生化處理。
[0010]本發(fā)明所述供試品前處理液加入二硝基氟苯DNFB衍生化實質(zhì)是采用DNFB將供試品前處理液中的氨基酸衍生化，便于后續(xù)高效液相色譜檢測，作為一種實施方案，所述衍生化的具體步驟為:先配制濃度為35~45 mg/mL的碳酸氫鈉溶液及濃度為擴llmL/L的DNFB乙腈溶液，將供試品前處理液與碳酸氫鈉溶液、DNFB乙腈溶液按體積比1:0.8^1.2:0.8^1.2混合，避光衍生化反應(yīng)，冷卻后加入6~8倍供試品前處理液體積的0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液混合均勻、離心、過濾。
[0011]優(yōu)選地，所述避光衍生化反應(yīng)的衍生溫度為55飛5°C，衍生時間為5(T70min，樣品可達到穩(wěn)態(tài)，衍生化完全，且節(jié)約原料和能源，降低成本。 [0012]本發(fā)明步驟SI屬于本領(lǐng)域常規(guī)步驟，作為一種實施方案，具體步驟為:
(1)稱取新鮮羅仙子放入高速組織勻漿機中按重量體積比為1:3的比例加入單蒸水，充分勻漿，勻漿液用200目的紗網(wǎng)過濾，得濾液；
(2)將濾液超聲粉碎30s，反復(fù)6次，強度14kHz，800W；
(3)將超聲處理后的樣品4°C,12000rpm/min離心25min,取上清液,用6層紗布過濾去除最上層的凝固脂肪；
(4)將濾液在80°C水浴中攪拌加熱lOmin，在冰浴中冷卻后，4°C，12000rpm/min離心25min,取上清液；
(5)將上清液用IOOkD分子截留量的超濾膜過濾后，用30kD分子截留量的超濾膜過
濾；
(6)將超濾液冷凍干燥，得到分子量為30kD以下的小分子蛋白凍干粉即為羅仙子有效部位提取物。
[0013]本發(fā)明采用標(biāo)樣法，通過氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢測來歸屬供試品高效液相色譜圖中的色譜峰。本發(fā)明對10批羅仙子供試品進行檢測，通過定性和定量分析測得樣品羅仙子樣品中各類氨基酸的種類和含量:谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸平均質(zhì)量分數(shù)分別為7.62%、1.19%,5.46%、1.32%、1.40%、
3.69%、1.68%,3.30%,2.47%,4.48%、1.02%。
[0014]本發(fā)明對檢測結(jié)果的精密度也進行了考察，具體實驗如下:
精密度實驗:取同一供試液，連續(xù)進樣5次，各共有特征峰相對保留時間RSD < 0.13%，相對峰面積RSD〈1.00%，表明儀器精密度良好。
[0015]重復(fù)性實驗:取同一樣品5份，按1.6項方法平行制備供試液，進樣檢測，各共有特征峰相對保留時間RSD〈1.10% ;相對峰面積RSD〈1.14%，表明重復(fù)性良好。
[0016]穩(wěn)定性實驗:取同一樣品，分別于制備后0、2、4、8、12、24h進樣測定，各共有特征峰相對保留時間RSD〈1.56% ;相對峰面積RSD〈1.93%，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0017]根據(jù)本發(fā)明所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，對10批羅仙子供試品進行高效液相色譜檢測，結(jié)果導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度軟件2004A，對保留時間0-35 min的色譜峰進行自動匹配，確定了 24個共有特征峰，保留時間分別為3.321 min,3.647 min,5.439min、5.871 min、6.483 min、6.601 min、6.937 min、7.071 min、7.785 min、8.147 min>10.387min、ll.984 min> 12.289 min> 13.227 min> 14.291 min> 15.175 min> 15.663 min> 16.174 min、16.600 min、19.493 min,22.380 min,22.982 min,26.676 min,26.872 min，這些共有特征峰構(gòu)成了中藥羅仙子藥材的指紋特征，作為羅仙子藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
(I)本發(fā)明成功構(gòu)建了中藥羅仙子指紋圖譜，確定了保留時間0-35 min共有24個共有特征峰，適用于日后對中藥羅仙子藥材真?zhèn)魏推焚|(zhì)的進一步鑒別和分類。
[0019](2)本發(fā)明公開的中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法步驟簡單，成本低廉，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，操作性強，精密度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為中藥羅仙子的指紋圖譜；
圖2為10批次羅仙子 的高效液相色譜相似度分析圖譜。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0022]實施例1、儀器和試劑:
使用Waters高效液相色譜儀；中藥羅仙子藥材共10批次，由廣東藥學(xué)院生物活性物質(zhì)研究所養(yǎng)殖(10個批次的樣品采集日期分別為2012-11-20、2012-12-16、2012-12-31、2013-01-18、2013-01-25、2013-03-27、2013-04-19、2013-05-10、2013-06-19、2013-07-08的中藥羅仙子)；其它試劑為色譜純或分析純，直接商業(yè)購買。
[0023]常規(guī)溶液配制:
(1)0.05mol/L乙酸鈉緩沖液(含10ml/L N，N-二甲基甲酰胺):稱取4.1g乙酸鈉，加700ml純凈水溶解，用乙酸調(diào)pH至6.5，加水至1L，加IOml N, N- 二甲基甲酰胺，0.45 μ m濾膜過濾；
(2)IOml/L DNFB (2，4 二硝基氟苯)溶液:取1.0ml DNFB，加乙腈定容至100mL ；
(3)0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液:稱取1.36g磷酸二氫鉀，加700ml純凈水溶解，用磷酸調(diào)PH7.0，定容至IL ；
(4)碳酸氫鈉溶液:稱取40.2g碳酸氫鈉，加純凈水定容至1L。
[0024]2、羅仙子有效部位提取物的制備:
(1)稱取各批次新鮮冷凍的羅仙子，在室溫下解凍，放入高速組織勻漿機中按1:3(m:V)的比例加入單蒸水，充分勻漿，勻漿液用200目的紗網(wǎng)過濾，得濾液；
(2)將濾液超聲粉碎30s，反復(fù)6次，強度14kHz，800W；(3)將超聲處理后的樣品4°C離心25min(12000rpm/min),取上清,用6層紗布過濾去除最上層的凝固脂肪；
(4)將濾液在80°C水浴中攪拌加熱lOmin，在冰浴中冷卻后，4°C離心25min(12000rpm/min),取上清；
(5)將上清液用IOOkD分子截留量的超濾膜過濾后，用30kD分子截留量的超濾膜過
濾；
(6)將超濾液在_80°C冰凍2h后，進行冷凍干燥，得到分子量為30kD以下的小分子蛋白凍干粉即為羅仙子有效部位提取物。
[0025]2、供試品溶液的制備:
稱取羅仙子有效部位提取物5.0mg,精密稱定，置于IOml安瓿瓶中，準(zhǔn)確加入6mol/L鹽酸5ml，酒精噴燈加熱封口，置于110°C烘箱中，水解24h，取出，放冷，將水解液過濾，取3ml續(xù)濾液至蒸發(fā)皿中，加熱揮干，殘渣以1.5ml 50%乙醇溶解制得供試品前處理液。
[0026]精密量取1.0 mL供試品前處理液置IOml棕色量瓶中，加入1.0ml碳酸氫鈉溶液、1.0ml IOml/L DNFB乙腈溶液，搖勻，置于60°C烘箱中避光反應(yīng)60min，取出，冷卻至室溫，用
0.01mol/L磷酸氫二鉀稀釋至刻度,搖勻,8000 rpm/min離心5min,取上清,0.45 μ m微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
[0027]3、高效液相色譜分析條件:
色譜柱:Welch Ultimate XB-C8 柱(250 mmX 4.6 mm, 5 μ m);流動相:乙臆、水、0.05mol/L乙酸鈉緩沖液(含10ml/L N, N-二甲基甲酰胺)，梯度洗脫，程序見表1 ;流速:1.0ml/min ；檢測波長:360nm ;柱溫:44 V ;進樣量:10 μ L。
[0028]表1梯度洗脫程序
【權(quán)利要求】
1.一種中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.羅仙子有效部位提取物的制備:新鮮羅仙子勻漿、過濾、超聲粉碎、過濾取濾液、加熱、冷卻、離心取上清液、超濾、干燥制得羅仙子有效部位提取物； 52.供試品溶液的制備:將羅仙子有效部位提取物與鹽酸混合水解，過濾取濾液，濾液干燥后的殘渣再用50%乙醇溶解得供試品前處理液；供試品前處理液加入二硝基氟苯DNFB衍生化制得供試品溶液； 53.高效液相色譜分析:色譜分離柱為WelchUltimate XB-C8柱,250 mmX4.6 mm,5 μ m ;流動相為乙腈、水、0.05mol/L乙酸鈉緩沖液;流速:1.0ml/min ;檢測波長:360nm ;柱溫:44°C ;進樣量:10 μ L ;采用梯度洗脫的方式，洗脫程序如下: 時間Omin 70%乙酸鈉緩沖液、15%乙腈、15%水； 時間13min 38%乙酸鈉緩沖液、31%乙腈、31%水； 時間21min 32%乙酸鈉緩沖液、34%乙腈、34%水； 時間23min 50%乙腈、50%水；
時間25min 50%乙腈、50%水； 時間26min 70%乙酸鈉緩沖液、15%乙腈、15%水； 時間35min 70%乙酸鈉緩沖液、15%乙腈、15%水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中所述0.05mol/L乙酸鈉緩沖液中還含有10ml/L N, N- 二甲基甲酰胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中所述水解的具體步驟為將羅仙子有效部位提取物與6mol/L鹽酸混合在10(Tl20°C條件下水解2(T30h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述羅仙子有效部位提取物與鹽酸混合的質(zhì)量體積比為Img:0.8^1.2mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中所述50%乙醇的用量為濾液體積的0.3^0.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述衍生化的具體步驟為:先配制濃度為35~45 mg/mL的碳酸氫鈉溶液及濃度為擴llmL/L的DNFB乙腈溶液，將供試品前處理液與碳酸氫鈉溶液、DNFB乙腈溶液按體積比1:0.8^1.2:0.8^1.2混合，避光衍生化反應(yīng)，冷卻后加入6~8倍供試品前處理液體積的0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液混合均勻、離心、過濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述避光衍生化反應(yīng)的衍生溫度為55飛5°C，衍生時間為5(T70min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟SI的具體步驟為: (1)稱取新鮮羅仙子放入高速組織勻漿機中按重量體積比為1:3的比例加入單蒸水，充分勻漿，勻漿液用200目的紗網(wǎng)過濾； (2)將濾液超聲粉碎30s，反復(fù)6次，強度14kHz，800W； (3)將超聲處理后的樣品4°C,12000rpm/min離心25min,取上清液,用6層紗布過濾； (4)將濾液在80°C水浴中攪拌加熱lOmin，在冰浴中冷卻后，4°C，12000rpm/min離心.25min,取上清液； (5)將上清液用IOOkD分子截留量的超濾膜過濾后，用30kD分子截留量的超濾膜過濾； (6)將超濾液冷凍干燥，制得羅仙子有效部位提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述中藥羅仙子指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述指紋圖譜確定了 24個共有特征峰，保留時間分別為3.321 min、3.647 min、5.439 min、.5.871 min、6.483 min、6.601 min、6.937 min、7.071 min、7.785 min、8.147 min、10.387 min、.11.984 min、12.289 min、13.227 min、14.291 min、15.175 min、15.663 min、16.174 min、.16.600 min、19. 493 min、22.380 min、22.982 min、26.676 min、26.872 min。
【文檔編號】G01N30/88GK104007215SQ201410190089
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】朱家勇, 褚夫江, 金小寶, 李小波, 梅寒芳, 吳玉萍 申請人:廣東藥學(xué)院