一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法，包括步驟為：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測(cè)液滴加于包括有內(nèi)參線、至少一條的檢測(cè)線和過量抗原檢測(cè)線的免疫層析試紙條上并檢測(cè)，讀取可反映抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)度的檢測(cè)信號(hào)，得到讀取結(jié)果；根據(jù)讀取結(jié)果，至少一條的檢測(cè)線中有n-1條檢測(cè)線檢測(cè)信號(hào)超過閾值時(shí)，將第n條檢測(cè)線的讀取結(jié)果利用第n條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，演算得到待測(cè)液的濃度。通過上述方式，本發(fā)明采用的方法能夠解決低濃度測(cè)量以及高濃度測(cè)量同時(shí)進(jìn)行的問題，增加試紙條的線性檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的精確定量檢測(cè)，可以用于血清標(biāo)志物、微生物抗原、病毒顆粒、違禁藥品等生物大分子或小分子的定量檢測(cè)。
【專利說明】一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法。【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析技術(shù)是使用硝酸纖維素膜等作為反應(yīng)物支撐的載體，利用膜的孔隙效應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)。該技術(shù)可分為縱向擴(kuò)散和橫向擴(kuò)散兩種。早期誕生的是縱向擴(kuò)散的斑點(diǎn)金雜交法，但終因其操作復(fù)雜未能成為主流試劑推廣使用。隨著膜技術(shù)的發(fā)展，側(cè)向流橫向擴(kuò)散試紙條顯示出良好的優(yōu)勢(shì)，并得到極大的推廣。側(cè)向流免疫層析技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的膠體金快速診斷試紙用于早早孕(HCG)的檢測(cè)中，由于其方便、快捷、特異性高，特別適合即時(shí)診斷，因此其應(yīng)用十分廣泛，成為側(cè)向流免疫層析技術(shù)中的代表性產(chǎn)品。
[0003]目前，市場(chǎng)上的膠體金、量子點(diǎn)、乳膠、熒光等多種免疫層析試紙條，大多只能完成定性檢測(cè)或者半定量檢測(cè)，定量檢測(cè)非常困難。主要原因是在側(cè)向流免疫層析過程中，所測(cè)量的目標(biāo)信號(hào)是一個(gè)逐漸增加的過程，是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化。傳統(tǒng)的終點(diǎn)法僅能用于定性或半定量，無法實(shí)現(xiàn)精確定量；其次，當(dāng)面對(duì)待檢物質(zhì)的含量變化范圍極大時(shí)(比如三個(gè)數(shù)量級(jí)以上)，市售試紙條往往無能為力，尤其是當(dāng)樣本濃度較高時(shí)，甚至常常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。即使能夠檢測(cè)到較高的濃度，在高濃度區(qū)域準(zhǔn)確度也極差。
[0004]因此，如何增加試紙條檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)增加試紙條的線性檢測(cè)范圍一直是困擾試紙條發(fā)展的瓶頸。試紙條生產(chǎn)廠家往往追求較高的靈敏度，但忽視了高靈敏度區(qū)域試紙條線性檢測(cè)范圍變窄這一現(xiàn)狀。當(dāng)面對(duì)目標(biāo)物濃度較高的待測(cè)樣本時(shí)，必須經(jīng)過稀釋才能進(jìn)行測(cè)量，否則將大量出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而在臨床應(yīng)用時(shí)，操作人員也不得不進(jìn)行手動(dòng)稀釋，增加了臨床檢驗(yàn)工作人員的勞動(dòng)復(fù)雜度。因此，在不影響試紙條檢測(cè)限的同時(shí)，如何增加其線性檢測(cè)范圍是試紙條性能的重要體現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法，能夠同時(shí)進(jìn)行低濃度測(cè)量和高濃度測(cè)量，增加試紙條的線性檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的精確定量檢測(cè)。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法，包括步驟為:
(1)配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液并用包括有內(nèi)參線、至少一條的檢測(cè)線和過量抗原檢測(cè)線的免疫層析試紙條檢測(cè)，獲取能夠測(cè)量的所述免疫層析試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱的檢測(cè)信號(hào)，得到讀取結(jié)果；
(2)根據(jù)步驟(I)中所述讀取結(jié)果，所述至少一條檢測(cè)線中有η-1條檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)達(dá)到閾值，用第η條檢測(cè)線的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，獲得η條以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以所述免疫層析試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中η為大于I的自然數(shù)； (3)將待測(cè)液滴加于免疫層析試紙條上并檢測(cè)，獲取能測(cè)量的所述免疫層析試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱的檢測(cè)信號(hào)，得到讀取結(jié)果；
(4)根據(jù)步驟(3)中所述讀取結(jié)果，所述至少一條的檢測(cè)線中有η-1條檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)達(dá)到閾值，將第η條檢測(cè)線的讀取結(jié)果利用所述的第η條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，演算得到所述待測(cè)液的濃度。
[0007]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟(2)中所述檢測(cè)信號(hào)為吸收光信號(hào)、反射光信號(hào)、突光信號(hào)、磁場(chǎng)強(qiáng)度信號(hào)、聲場(chǎng)強(qiáng)度信號(hào)或電場(chǎng)強(qiáng)度信號(hào)。
[0008]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述讀取結(jié)果為所述第η條檢測(cè)線與所述內(nèi)參線的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度面積比。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述讀取結(jié)果為所述第η條檢測(cè)線與所述內(nèi)參線的最大檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度比。
[0010]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，當(dāng)所述免疫層析試紙條上所述檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)全部達(dá)到閾值，且所述過量抗原檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)為O時(shí)，所述待測(cè)液的濃度超過所述免疫層析試紙條的線性檢測(cè)范圍。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法，該方法能夠解決低濃度測(cè)量以及高濃度測(cè)量同時(shí)進(jìn)行的問題，增加試紙條的線性檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的精確定量檢測(cè)，可以用于血清標(biāo)志物、微生物抗原、病毒顆粒、違禁藥品等生物大分子或小分子的定量檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中待測(cè)液中使用雙抗體夾心法當(dāng)抗原濃度低于最低檢測(cè)限時(shí)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度分布圖；
圖2是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中待測(cè)液中使用雙抗體夾心法當(dāng)抗原濃度在檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度分布圖；
圖3是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中待測(cè)液中使用雙抗體夾心法當(dāng)抗原濃度高于最高檢測(cè)限時(shí)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度分布圖；
圖4是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖5是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中待測(cè)液中使用雙抗體夾心法當(dāng)抗原濃度較低時(shí)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度分布圖；
圖6是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中待測(cè)液中使用雙抗體夾心法抗原濃度適量時(shí)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度分布圖；
圖7是本發(fā)明的定量檢測(cè)方法中待測(cè)液中使用雙抗體夾心法抗原濃度過高時(shí)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度分布圖；
附圖中各部件的標(biāo)記如下:1、外殼，2、樣品墊，3、內(nèi)參線，4、第一檢測(cè)線，5、第二檢測(cè)線，6、過量抗原檢測(cè)線，7、反應(yīng)膜，8、吸收墊?！揪唧w實(shí)施方式】
[0013]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0014] 本發(fā)明中定量檢測(cè)方法的原理為:
采用雙抗體夾心法，將待測(cè)液用試紙條進(jìn)行檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)三種情況:
(1)請(qǐng)參閱圖1，當(dāng)待測(cè)液中抗原濃度低于最低檢測(cè)限時(shí)，內(nèi)參線發(fā)生抗原抗體結(jié)合獲得一個(gè)可測(cè)量的檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)線不發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，或是待測(cè)抗原量過低，信號(hào)強(qiáng)度過低，可認(rèn)為濃度為零。
[0015](2)請(qǐng)參閱圖2，當(dāng)待測(cè)液中抗原濃度在檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，此時(shí)隨著抗原濃度的提升，檢測(cè)線處可測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大，可利用檢測(cè)線與內(nèi)參線之間相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算待測(cè)抗原濃度。
[0016](3)請(qǐng)參閱圖3，當(dāng)待測(cè)液中抗原濃度高于試紙條設(shè)計(jì)的最高檢測(cè)限時(shí)，此時(shí)檢測(cè)線固定了全部的抗體，沒有抗體與過量抗原檢測(cè)線的二抗結(jié)合，故此處沒有可測(cè)量的檢測(cè)信號(hào)。
[0017]在第二種情況下，當(dāng)待測(cè)液中抗原濃度在檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，請(qǐng)參閱圖4，免疫層析試紙條上可測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度分布可呈現(xiàn)以下幾種情況:
(I)請(qǐng)參閱圖5，當(dāng)待測(cè)物質(zhì)濃度比較低時(shí)，第一檢測(cè)線4即可完全捕獲抗原抗體形成的二元復(fù)合物，故此處可獲得一個(gè)小于測(cè)量閾值的檢測(cè)信號(hào)。而未被結(jié)合的抗體可被過量抗原檢測(cè)帶6捕獲，而出現(xiàn)較大的檢測(cè)信號(hào)。
[0018](2)請(qǐng)參閱圖6，當(dāng)待測(cè)物濃度進(jìn)一步增大，此時(shí)第一檢測(cè)線4的測(cè)量信號(hào)已經(jīng)超過閾值，多余的抗原抗體二元復(fù)合物被第二檢測(cè)線5捕獲，而未被結(jié)合的抗體可被過量抗原檢測(cè)線6捕獲，也出現(xiàn)一個(gè)信號(hào)，但相對(duì)第一種情形變小。
[0019](3)請(qǐng)參閱圖7，當(dāng)待測(cè)物濃度進(jìn)一步增大，此時(shí)第一檢測(cè)線4和第二檢測(cè)線5的熒光信號(hào)都已經(jīng)超過闕值，沒有多余的抗體可被過量抗原檢測(cè)線6捕獲。此時(shí)表明，待測(cè)物的濃度過高，已經(jīng)超出檢測(cè)范圍。
[0020]根據(jù)上述幾種情況，并參閱圖5-7，本發(fā)明中免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法的一種具體計(jì)算過程為:
A:標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程為:
(1)配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液并用免疫層析試紙條檢測(cè)，獲取能夠測(cè)量的所述試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱的檢測(cè)信號(hào)；
(2)將內(nèi)參線3獲得一個(gè)可測(cè)量信號(hào)，記為A。，檢測(cè)線信號(hào)可存在多個(gè)記為An、At2……Ατη，過量抗原檢測(cè)線信號(hào)記為Am ；
(3)若試紙條上存在A。、An、Am三個(gè)信號(hào)。此時(shí)的利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，An/Ac值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線S1 ；
(4)若試紙條上存在A。、AT1、At2…ATn、Am四個(gè)或多個(gè)檢測(cè)信號(hào),其中An信號(hào)超過閾值。此時(shí)的利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，At2 /Α。值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線S2 ;依次類推可獲得η條標(biāo)準(zhǔn)曲線s^-sN。
[0021]B:樣品定量計(jì)算具體流程為:
(1)將待測(cè)樣品用免疫層析試紙條檢測(cè)，獲取能夠測(cè)量的所述試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱的檢測(cè)信號(hào)；
(2)將內(nèi)參線3獲得一個(gè)可測(cè)量信號(hào)，記為A。，檢測(cè)線信號(hào)可存在多個(gè)記為An、At2……Ατη，過量抗原檢測(cè)線信號(hào)記為Am ；
(3)若試紙條上存在Ae、AT1、AM三個(gè)信號(hào)。此時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線S1，使用An/A。值進(jìn)行線性回歸，獲得待測(cè)物濃度；
(4)若試紙條上存在Ac、AT1、AT2*“ATn、AM四個(gè)或多個(gè)檢測(cè)信號(hào),其中ATlri信號(hào)超過閾值，而Ατη信號(hào)未超過閾值。此時(shí) 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線Sn，使用Ατη/Α。值進(jìn)行線性回歸，獲得待測(cè)物濃度；
(5)若試紙條上AC、AT1、AT2...ΑΤη信號(hào)均超過閾值,而未出現(xiàn)Am信號(hào),則提不待測(cè)樣品濃度超過檢測(cè)范圍。
[0022]實(shí)施例一:
提供一種對(duì)C反應(yīng)蛋白的定量檢測(cè)方法，包括步驟為:
1、免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
試紙條的反應(yīng)膜上固定有四條蛋白條帶，分別為一條固定有0.2yg兔IgG的內(nèi)參線、固定有0.4yg CRP單克隆抗體a的第一條檢測(cè)線、固定有0.4yg CRP單克隆抗體a的第二條檢測(cè)線、一條固定有0.5 μ g羊抗鼠IgG的過量抗原檢測(cè)線。
[0023]2、檢測(cè)緩沖液設(shè)計(jì)
檢測(cè)緩沖液中含有0.2 μ g的cy5熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG、I μ g的cy5標(biāo)記的鼠CRP單克隆抗體。
[0024]3、試紙條的定量檢測(cè)算法
取10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度血清樣本，加入檢測(cè)緩沖液中，滴加到試紙條上反應(yīng)一段時(shí)間后，配合專用的熒光讀取儀可獲得如下的檢測(cè)信號(hào):
【權(quán)利要求】
1.一種免疫層析試紙條的定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟為: (1)配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液并用包括有內(nèi)參線、至少一條檢測(cè)線和過量抗原檢測(cè)線的免疫層析試紙條檢測(cè)，獲取能夠測(cè)量的所述免疫層析試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱的檢測(cè)信號(hào)，得到讀取結(jié)果； (2)根據(jù)步驟(I)中所述讀取結(jié)果，所述至少一條檢測(cè)線中有η-1條檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)達(dá)到閾值，用第η條檢測(cè)線的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，獲得η條以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以所述免疫層析試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中η為大于I的自然數(shù)； (3)將待測(cè)液滴加于免疫層析試紙條上并檢測(cè)，獲取能測(cè)量的所述免疫層析試紙條上抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)弱的檢測(cè)信號(hào)，得到讀取結(jié)果； (4)根據(jù)步驟(3)中所述讀取結(jié)果，所述至少一條的檢測(cè)線中有η-1條檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)達(dá)到閾值，將第η條檢測(cè)線的讀取結(jié)果利用所述的第η條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，演算得到所述待測(cè)液的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中所述檢測(cè)信號(hào)為吸收光信號(hào)、反射光信號(hào)、突光信號(hào)、磁場(chǎng)強(qiáng)度信號(hào)、聲場(chǎng)強(qiáng)度信號(hào)或電場(chǎng)強(qiáng)度信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述讀取結(jié)果為所述第η條檢測(cè)線與所述內(nèi)參線的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度面積比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述讀取結(jié)果為所述第η條檢測(cè)線與所述內(nèi)參線的最大檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度比。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于，當(dāng)所述免疫層析試紙條上所述檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)全部達(dá)到閾值，且所述過量抗原檢測(cè)線的檢測(cè)信號(hào)為O時(shí)，所述待測(cè)液的濃度超過所述免疫層析試紙條的線性檢測(cè)范圍。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103954753SQ201410196384
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】尹煥才 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所