一種用于纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物的檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測方法，該方法可同時檢測生物樣品中纖維蛋白、纖維蛋白原和纖維蛋白或纖維蛋白原的降解中間體X、Y片段和降解最終產(chǎn)物D片段、D-dimer的含量。該方法形成的試劑盒可用于常見癌癥的檢測。
【專利說明】一種用于纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物的檢測方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及利用纖維蛋白(原)及其降解產(chǎn)物的含量來檢測人體內(nèi)腫瘤標(biāo)志物DR-70含量的一種方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥(惡性腫瘤)是威脅我國國民健康的頭號殺手，一直是我國醫(yī)療衛(wèi)生防治的重點領(lǐng)域之一。對于癌癥防治的主要方法就是進行全民體檢，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷和及時治療的目的，提高治愈率。腫瘤標(biāo)志物是常見的癌癥篩查方法，在我國具有非常廣泛的應(yīng)用，但目前常見的腫瘤標(biāo)志物篩查癌癥的準(zhǔn)確僅為30-40%，甚至更低。因此，需要開發(fā)新的腫瘤標(biāo)志物和相關(guān)的檢測/診斷試劑。為了滿足腫瘤人群的需求，公司對DR-70 (FDP)進行了進一步研究，重新確定了其中與腫瘤密切相關(guān)的蛋白片段并建立了相應(yīng)的檢測體系。
[0003]美國Donald Ronald醫(yī)生于1970年在腫瘤病人血液中發(fā)現(xiàn)一種環(huán)形結(jié)構(gòu)的大分子蛋白，為紀(jì)念他的這一發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)用他的姓名首字母及發(fā)現(xiàn)年號命名為DR-70。美國AMDL公司于1991年研究證實DR-70是一組與惡性腫瘤密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，是腫瘤細(xì)胞分泌的一類蛋白水解酶。1992年Justice等人首先證明它為一種腫瘤標(biāo)志物,并證實DR-70比其它腫瘤標(biāo)志物如CEA和CA15-3等更加敏感。當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生時,人體血液內(nèi)的DR-70含量就會升高，并異常激活纖溶系統(tǒng)，從而導(dǎo)致纖維蛋白(原)溶解。DR-70免疫測定法可定量檢測體內(nèi)纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)從而確定體內(nèi)是否存在癌細(xì)胞。
[0004]目前，檢測人血清中FDP的含量開發(fā)的癌癥篩查和預(yù)后監(jiān)控的產(chǎn)品已經(jīng)在美國得到FDA批準(zhǔn)，進入臨床使用。但是我國尚未大規(guī)模開展這個腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用研究。
[0005]國際上的研究認(rèn)為D、Dimer、E、Y和IPDP等纖維蛋白(原)降解片段是DR-70的直接反應(yīng)，并開發(fā)出針對這些片段的多克隆抗體，用ELISA方法來定量檢測血液中FDP的含量，進行癌癥篩查。但由于多克隆抗體本身的特性和FDP各降解產(chǎn)物的高級結(jié)構(gòu)等原因，定量檢測的結(jié)果有一定偏差。
[0006]國內(nèi)針對FDP的定量檢測主要是檢測D/Dimer降解產(chǎn)物，用膠乳免疫比濁法檢測D/Dimer來進行血栓或凝血的檢測，未見用于癌癥篩查的報道。國外的研究顯示，如果只檢測D/Dimer進行腫瘤的篩查，會造成臨床上50%以上的錯誤率。
[0007]因此，需要建立更加完善的DFP檢測技術(shù)體系/方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本文公開了一種檢測纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物的方法和應(yīng)用，其包括對纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白(原)降解中間體X片段、纖維蛋白(原)降解中間體Y片段、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物D片段和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物D- 二聚體，總計六種纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解混合物的同步檢測。方法包括用特異性多克隆抗體和單克隆抗體對上述六種混合物進行同時檢測，其中所述的多克隆抗體和單克隆抗體均是特異性的。[0009]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案包括以下步驟。
[0010]制備和纖維蛋白(原)，纖維蛋白(原)降解中間體X、Y片段和降解產(chǎn)物D、D-dimer等蛋白/多肽片段結(jié)合的多克隆抗體和單克隆抗體:
(1)利用大腸桿菌表達纖維蛋白(原)及其降解產(chǎn)物D、D-dimer及中間體X、Y等蛋白或蛋白片段；
(2)利用層析柱、蛋白凝膠、反相柱等方法將表達的蛋白純化，凍干，形成凍干粉；
(3)將凍干粉作為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備并篩選多克隆抗體；
(4)將凍干粉作為抗原,免疫Balb/c小鼠,制備并篩選單克隆抗體。
[0011]建立ELISA檢測體系。
[0012]以[0010]中制備的多克隆抗體為包被抗體，用來包被酶標(biāo)板并與檢測樣本中的檢測目標(biāo)結(jié)合，將其固定在酶標(biāo)板上。以[0010]中制備的單克隆抗體為捕捉抗體，與固定在酶標(biāo)板上的檢測目標(biāo)結(jié)合，形成多克隆抗體-檢測目標(biāo)-單克隆抗體復(fù)合物，以購自HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L)作為酶標(biāo)抗體，檢測復(fù)合物中的單克隆抗體，建立ELISA檢測體系。
[0013]確定ELISA體系的線性范圍。
[0014]確定上述的單抗比例后，根據(jù)常見的ELISA檢測流程，確定本發(fā)明方法的現(xiàn)行檢測范圍:將標(biāo)準(zhǔn)品做成不同的檢測梯度(O、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、IOOng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml)。檢測結(jié)果顯不:該方法在 12.5ng/mL-400 ng/mL的含量范圍內(nèi)，該方法呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R>0.990。
[0015]根據(jù)建立的ELISA體系，優(yōu)化試劑盒中的各組分。
[0016]利用已知含量的由纖維蛋白(原)及其降解產(chǎn)物組成的標(biāo)準(zhǔn)品和建立的ELISA方法，選擇合適的酶標(biāo)抗體。
[0017]利用ELISA法和已知不同含量的由纖維蛋白(原)及其降解產(chǎn)物組成的標(biāo)準(zhǔn)品和空白值進行，選擇合適的酶標(biāo)板。
[0018]利用ELISA法和已知不同含量的由纖維蛋白(原)及其降解產(chǎn)物組成的標(biāo)準(zhǔn)品，對常見的緩沖液進行測試，選擇合適的緩沖液。
[0019]以抗體制劑為檢測目標(biāo)，摸索并確定稀釋液的組分。
[0020]驗證試劑盒的檢測人血清中纖維蛋白(原)及其降解產(chǎn)物的線性。
[0021]利用搜集常見癌癥病人及正常人的血樣，對形成的試劑盒進行驗證。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為纖維蛋白原的表達純化蛋白圖，由于纖維蛋白和纖維蛋白原的抗體可共用，因此，在本發(fā)明中未針對纖維蛋白的表達與純化。圖中從左至右分別為Y鏈(51ΚΒ)、β鏈(54ΚΒ)、α (91ΚΒ)，括號內(nèi)為蛋白的分子量大小。
[0023]圖2為纖維蛋白原的降解產(chǎn)物D片段的表達純化圖，D片段大小為80KD，D片段和D-dimer可共用同一個抗體，因此，本發(fā)明未針對D-dimer單獨進行表達純化。
[0024]圖3為纖維蛋白原的降解中間體X、Y的表達純化圖，其中X片段為220KD，Y片段為 150KD。
[0025]圖4為ELISA法檢測血清FDP的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。[0026]圖5為本發(fā)明建立的試劑盒檢測血清FDP的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0027]圖6為本發(fā)明建立的試劑盒法檢測血清FDP在肺癌病人中的ROC曲線圖，曲線下面積為90%，可初步說明利用本發(fā)明方法檢測肺癌的準(zhǔn)確率在90%左右。
[0028]圖7為本發(fā)明建立的試劑盒法檢測血清FDP在胃癌病人中的ROC曲線圖，曲線下面積為84%，可初步說明本發(fā)明檢測胃癌的準(zhǔn)確率約84%。
[0029]圖8為本發(fā)明建立的試劑盒檢測血清FDP在腸癌病人中的RCO曲線圖，曲線下面積為93%，可初步說明本發(fā)明建立腸癌的準(zhǔn)確率約93%。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合具體實施實例對上述方案做進一步說明。這些實例適用于說明本發(fā)明，但不限于本發(fā)明的范圍。實例中采用的實施條件可以根據(jù)具體的操作條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0031]纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體，分子量為430，000道爾頓。纖維蛋白原由α、β、Υ三對不同多肽鏈所組成，多肽鏈間以二硫鍵相連。在凝血酶作用下，α鏈與β鏈分別釋放出A肽與B肽，生成纖維蛋白單體。在癌癥病人體內(nèi)，癌細(xì)胞釋放出大量的蛋白水解酶DR-70，異常激活纖維蛋白原或纖維蛋白的降解體系，經(jīng)過降解中間體X、Y，將其降解為D或D-dimer，因此，血液中纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物和降解中間體的含量可直接反映DR-70含量的高低。
[0032]實施例1免疫抗原制備。
[0033]免疫抗原為纖維蛋白、纖維蛋白原，纖維蛋白(原)的降解中間體X、Y蛋白片段，纖維蛋白(原)的降解產(chǎn)物D、D-dimer片段。由于D-dimer為降解產(chǎn)物D片段的二聚體，纖維蛋白原為纖維蛋白的前體，抗體可以共用。因此，只需要制備4種抗原:纖維蛋白、降解產(chǎn)物D片段和降解中間體X、Y片段。
[0034]將要表達的蛋白/多肽序列轉(zhuǎn)化為DNA序列，進行原核表達的優(yōu)化，送至基因合成公司進行合成。將合成的基因序列連接到表達載體PET-32a，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌BL2KDE3)后，進行鋪板、挑選菌落，擴增培養(yǎng)，測序驗證，誘導(dǎo)表達，調(diào)整誘導(dǎo)條件，將蛋白表達至上清中；如果通過誘導(dǎo)條件仍然表達在包涵體的，通過更換表達載體和表達菌株的方式，將蛋白表達至上清中。
[0035]將表達的蛋白大規(guī)模培養(yǎng)，誘導(dǎo)，超聲破碎，將含有表達蛋白的清液，用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，進行初步純化，將初步純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳，并將含有純化蛋白的PAGE條帶割下，在Tris緩沖液中電泳過夜，得到二次純化的蛋白，二次純化蛋白上反相系統(tǒng)，進行三次純化，得到較純的纖維蛋白(原)及降解中間體和降解的最終產(chǎn)物，凍干，達到干粉。凍干粉即為制備的免疫抗原。
[0036]實施例2纖維蛋白原及降解中間體X、Y和最終產(chǎn)物D、D_dimer多克隆抗體制備。
[0037]以實施例1中制備的抗原，免疫新西蘭大白兔。具體步驟為:每只兔子接受由在
1.0-1.5ml的磷酸鹽緩沖液中的Img抗原和等體積的弗氏完全佐劑組成的乳液注射，注射部位在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿。在初次免疫后的三周，每一周進行加強免疫，加強免疫的乳液由1.0到1.5ml的磷酸鹽緩沖液中的Img抗原和等體積的弗氏不完全佐劑組成，注射部位與初次免疫相同。[0038]在第三次加強免疫后一周，兔子耳動脈取血于離心管中。37°C烘箱放置2h，轉(zhuǎn)移到4°C沉淀過夜,第二天早上離心，IOOOOrpm, 10分鐘,取上清的血清。在血清中加入NaN3至終濃度0.02%,分裝后_20°C保存。用環(huán)狀沉淀試驗測定抗體效價，如果達到1:5000以上(稀釋抗原)，則該抗原可用，如果未達到該數(shù)值，則重新制備多克隆抗體。
[0039]實施例3纖維蛋白原及降解中間體X、Y和最終產(chǎn)物D、D-dimer單克隆抗體制備。
[0040]以實施例1中制備的免疫抗原，按照實施例2中抗原的量和等體積的弗氏完全佐齊U，對6-8周齡雌性Balb/c小鼠，進行腹腔注射。以后每隔3周，加強免疫3次，免疫為靜脈注射，抗原量減半，佐劑為弗氏不完全佐劑。
[0041]在免疫小鼠的同時，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，制備完成后，將加強免疫后的小鼠，拉頸處死，制備脾淋巴細(xì)胞懸液；制備骨髓瘤細(xì)胞，將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按照1:5的比例混合，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并對雜交瘤細(xì)胞進行篩選。
[0042]雜交瘤細(xì)胞的第一次篩選是在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。第一次篩選是將雜交成功的細(xì)胞篩選出來。第二次篩選是篩選能夠產(chǎn)生足夠抗體和的細(xì)胞。其方法為在超凈工作臺中，將雜交瘤細(xì)胞多被稀釋，接種在多空的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每孔的細(xì)胞不超過一個，培養(yǎng)，增殖，利用常規(guī)的ELISA法檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體(HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L)作為酶標(biāo)抗體)。具體方法為:將10μ g的免疫原固定在96孔微量滴定板的孔中；用？83封閉；然后與各孔的上清液進行反應(yīng)，洗滌；用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗-鼠抗體檢測，洗滌，用3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液溫育；在0D450nm下讀數(shù)。通過讀數(shù)和稀釋倍數(shù)，篩選分泌抗體效價高的細(xì)胞株繼續(xù)培養(yǎng)。將二次篩選實施3-4次。將篩選后的細(xì)胞，克隆化，_20°C保存，取出部分細(xì)胞株，進行規(guī)?；囵B(yǎng)，生產(chǎn)單克隆抗體，生產(chǎn)出的單克隆抗體，按照二次篩選步驟進行驗證。
[0043]實施例4抗體純化。
[0044]采用中科晨宇(北京)生物科技有限公司的抗體純化試劑盒，將制備的多克隆抗體和單克隆抗體進行純化，SDS-PAGE進行純化驗證。
[0045]實施例5建立ELISA檢測體系。
[0046]用純化后的多克隆抗體包被酶標(biāo)板，其作用為與檢測樣本中的檢測目標(biāo)結(jié)合，將其固定在酶標(biāo)板上。其包被過程為:用包被液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)將多克隆抗體稀釋為I μ g/ml，取200μ I加入到酶標(biāo)板孔中，4°C過夜，洗板；酶標(biāo)板穩(wěn)定劑(湖州英創(chuàng)生物科技有限公司)37°C封閉2h，甩干，37°C烘干半小時；將已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品(FDP)加入封閉好的酶標(biāo)板中，37°C作用lh，洗板；將制備的單克隆抗體加入酶標(biāo)板中，37 °C作用lh，洗板；使用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L)酶標(biāo)抗體，37 °C作用lh，洗板；顯色液TMB作用15min ;2M濃硫酸終止反應(yīng)，450nm讀值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法可以進行纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物和降解中間體的檢測。
[0047]實施例6本發(fā)明方法中各檢測單克隆抗體的比例確定。
[0048]由于該方法的檢測的蛋白/多肽片段有很高的重疊性，各個抗體之間也有相互的干擾，因此，本發(fā)明對捕獲抗體的各個比例進行摸索。摸索方法同建立的檢測體系，各捕獲抗體之間的比例不同。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)纖維素蛋白(原)單抗:降解產(chǎn)物D片段和D 二聚體抗體:降解中間體X片段單抗:降解中間體Y片段單抗=1:5:2:3時，檢測結(jié)果和真實值最為接近。
[0049]實施例7本發(fā)明方法的線性范圍確定。
[0050]將制備的FDP多克隆抗體(lug/ml)包被ELISA反應(yīng)板，4°C過夜，洗板；酶標(biāo)板穩(wěn)定劑(湖州英創(chuàng)生物科技有限公司)37°C封閉2h，甩干，37°C烘干半小時；將已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品(O、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml)及 1:100 稀釋的血清樣品加入封閉好的酶標(biāo)板中，37°C作用lh，洗板；將制備的捕捉抗體抗FDP單克隆抗體加入酶標(biāo)板中，37°C作用lh，洗板；使用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)酶標(biāo)抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)，37°C作用lh，洗板；顯色液TMB作用15min ;2M濃硫酸終止反應(yīng)，450nm讀值。結(jié)果顯示，該方法在12.5ng/mL-400 ng/mL的FDP含量范圍內(nèi)，該方法呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R>0.990。
[0051]實施例8試劑盒酶標(biāo)抗體選擇。
[0052]對市面上可以購買的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)作為選擇對象，以常見的ELISA法為選擇工具，已知含量的FDP標(biāo)準(zhǔn)品驗證。驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，購自購自碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)為酶標(biāo)抗體檢測的結(jié)果最貼近真實值。
[0053]實施例9試劑盒酶標(biāo)板選擇。
[0054]對國內(nèi)生產(chǎn)的酶標(biāo)板和國外進口 corning公司和thermo生產(chǎn)的酶標(biāo)板進行選擇，同樣以ELISA法和已知不同含量的FDP標(biāo)準(zhǔn)品和空白值進行驗證。驗證結(jié)果顯示，thermo公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板具有教高的信噪比，能夠明顯區(qū)分空白值、陽性值和陰性值，適用于本發(fā)明的試劑盒。
[0055]實施例10緩沖液的選擇。
[0056]以ELISA法和已知含量的FDP標(biāo)準(zhǔn)品和空白值對磷酸鹽緩沖液(PH7.5)、碳酸鹽緩沖液(PH9.6)和tris緩沖液(PH11.0)進行選擇。結(jié)果顯示，用碳酸鹽緩沖液(PH9.6)作為緩沖液進行檢測能更接近真實值，也能有效區(qū)分陰性值和空白值。
[0057]實施例11稀釋液的選擇與確定。
[0058]以制備的多克隆抗體和單克隆抗體(制備過程不贅述)為檢測目標(biāo)，對目前市面上商品化的稀釋劑和自己配制的稀釋劑進行選擇。將上述兩種抗體用各種稀釋劑進行稀釋后，置于室溫，在第3天、7天、14天、28天進行抗體效價和溶液內(nèi)蛋白含量檢測，同樣在4°C和-20°C條件下放置，同樣對抗體效價和溶液內(nèi)蛋白含量進行檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):湖州英創(chuàng)生物科技有限公司提供的封閉液和稀釋液為建立反應(yīng)體系所需的試劑組分3mMEDTA、
0.5%BSA、1XPBS、0.05%Tween_20、0.02% 硫柳汞(PH6.2)。
[0059]試劑盒其他的試劑按照現(xiàn)行常見的試劑進行即可。
[0060]實施例12驗證試劑盒檢測血清FDP的線性。
[0061]將形成的試劑盒檢測對不同含量的標(biāo)準(zhǔn)品(0、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml)進行檢測。結(jié)果顯示,在 12.5ng/mL_400 ng/mL 范圍內(nèi)，試劑盒呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R>0.990。
[0062]實施例13正常人和癌癥病人區(qū)分值的確定。
[0063]隨機選擇200例健康人和127例癌癥病人，利用形成的試劑盒對這些樣本進行檢測，經(jīng)過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血液中纖維蛋白、纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物的總含量低于l.0ug/ml時候，人的患癌風(fēng)險較低；當(dāng)其總含量高于該值時，預(yù)示人體內(nèi)可能發(fā)現(xiàn)癌變，患癌的風(fēng)險比較低。
[0064]實施例14試劑盒在肺癌病人中的初步檢測。
[0065]用本發(fā)明形成的試劑盒，對收集的治療前肺癌病人血清樣本150例，血站收集的正常人血清樣本300例，檢測其中的纖維蛋白(原)及降解產(chǎn)物濃度，RCO曲線統(tǒng)計，曲線下面積為0.9，即診斷準(zhǔn)確性為90%。
[0066]實施例15試劑盒在胃癌病人中的初步檢測。
[0067]用本發(fā)明形成的試劑盒，對收集的胃癌病人血清樣本300例，正常人血清樣本290例，檢測其中的纖維蛋白(原)及降解產(chǎn)物濃度，RCO曲線統(tǒng)計，曲線下面積為0.84，診斷準(zhǔn)確性為84%。其中對于早期胃癌的檢出率超過75%。
【權(quán)利要求】
1.一種纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物的檢測方法，其所述方法包括以下步驟: 從受檢者獲得生物樣品； 利用固定在酶標(biāo)板上的多克隆抗體與生物樣品反應(yīng)，形成“多克隆抗體-檢測目標(biāo)”的復(fù)合物； 利用單克隆抗體捕獲固定在酶標(biāo)板上的“多克隆抗體-檢測目標(biāo)”復(fù)合物，形成“多克隆抗體-檢測目標(biāo)-單克隆抗體”的“夾心式”復(fù)合物； 檢測目標(biāo)“夾心式”復(fù)合物的含量； 評估受檢者的患癌風(fēng)險。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的固定在酶標(biāo)板上的多克隆抗體不僅能夠與纖維蛋白和纖維蛋白原的降解產(chǎn)物D片段和D—dimer結(jié)合，還能與未降解的纖維蛋白和纖維蛋白(原)及其降解的中間體X、Y片結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的用于捕獲“多克隆抗體-檢測目標(biāo)”復(fù)合物的單克隆抗體能夠與纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解中間體X、Y片段和降解產(chǎn)物D、D-dimer
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的捕獲“多克隆抗體-檢測目標(biāo)”復(fù)合物的單克隆抗體的各組分比例為維素蛋白(原)單克隆抗體:降解產(chǎn)物D片段和D 二聚體單克隆抗體:降解中間體X片段單抗 :降解中間體Y片段單克隆抗體=1:5:2:3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的方法包括酶聯(lián)免疫吸附檢驗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中如果受檢者體內(nèi)的纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解中間體和降解產(chǎn)物的含量高于平均水準(zhǔn)，說明受檢者的有較高的患癌風(fēng)險，并且又很大可能已經(jīng)形成癌癥；如果其含量低于平均水準(zhǔn)，說明受檢者的患癌風(fēng)險較低。
7.用于檢測纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物的試劑盒，其所述的試劑盒包括: 能夠與纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解中間體X、Y片段和降解產(chǎn)物D、D— dimer結(jié)合的多克隆抗體； 能夠與纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解中間體X、Y片段和降解產(chǎn)物D、D— dimer結(jié)合的單克隆抗體； 檢測體系； 用于測量所述的纖維蛋白(原)及其降解中間體和降解產(chǎn)物的存在與癌癥相關(guān)的指導(dǎo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述的檢測體系包括能夠特異性針對纖維蛋白和纖維蛋白原及其降解中間體X、Y片段和降解產(chǎn)物D、D-dimer等6種抗原的檢測抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述的多克隆抗體各組分比例為維素蛋白(原)單克隆抗體:降解產(chǎn)物D片段和D 二聚體單克隆抗體:降解中間體X片段單抗:降解中間體Y片段單克隆抗體=1:5:2:3。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述的抗體和所述的檢測體系包括酶聯(lián)免疫檢驗。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述的酶聯(lián)免疫檢驗用到的試劑包括: HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L)； corning或thermo公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板； 碳酸鹽緩沖液； 組分為 3mMEDTA、0.5%BSA、I XPBS、0.05%Tween_20、0.02% 硫柳汞(PH6.2)的稀釋液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑，其中所述的磷酸鹽緩沖液為PH=9.6的磷酸鹽緩沖液。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法和試劑盒，可用于肺癌的初步檢測。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法和試劑盒，可用于胃癌的初步檢測。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-12的方法和試劑盒，可用于腸癌的初步檢測。
【文檔編號】G01N33/541GK103954758SQ201410204344
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】王弢 申請人:海南世濟醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司