判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于涉及生物研究的基礎領域，具體涉及一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法。本發(fā)明方法選用水稻吐出的水滴來作為韌皮部汁液的替代品進行Bt殺蟲蛋白的測定。將經(jīng)過常規(guī)浸種、催芽處理的水稻種子平鋪到塑料托盤中，加入適量的營養(yǎng)液，放置于人工氣候箱內(nèi)，待種子出苗5天后，每天早晨使用移液槍收集水稻尖部的水珠，然后存放于離心管中，最后用蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定Bt殺蟲蛋白的含量。本發(fā)明的有益效果有：本發(fā)明的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中殺蟲蛋白含量的新方法適用于多種主要作物，操作簡單，極易掌握，并且整個取樣過程中植株個體未受到損傷，完全避免了污染的可能，保證了結果的準確性。
【專利說明】判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于涉及生物研究的基礎領域，具體涉及一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法。
【背景技術】
[0002]隨著DNA重組技術的不斷發(fā)展，利用基因工程技術培育的抗蟲品種已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛種植，這些品種表達來自蘇云金桿菌(Bt)的Cry毒素，現(xiàn)已成為害蟲防治的一種有效手段。然而，轉基因作物的生態(tài)風險特別是對環(huán)境和非靶標有機體的影響一直是人們關注的焦點。轉基因抗蟲作物對非靶標生物的影響主要是指對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中非靶標的害蟲、有益生物以及對作物不產(chǎn)生危害的昆蟲類等的影響。由于不同類型的Bt殺蟲蛋白具有不同的殺蟲譜，因此轉基因植物中不同的Bt基因表達必然會對非靶標昆蟲產(chǎn)生直接或者間接的影響，這種影響與昆蟲對Bt殺蟲蛋白的敏感程度以及轉基因植株中Bt殺蟲蛋白的表達濃度有關。轉基因作物會通過食物鏈和食物網(wǎng)影響更高營養(yǎng)級昆蟲的生長發(fā)育及繁殖，影響以植食類昆蟲為食的捕食或者寄生性天敵，進而影響整個營養(yǎng)層級的節(jié)肢動物種類組成和種群動態(tài)，引起農(nóng)田群落結構的變化。
[0003]刺吸式害蟲，特別是蚜蟲是大多數(shù)農(nóng)田中廣泛存在的一種食草動物，由于其是許多常見的捕食性和寄生性天敵昆蟲(比如草蛉、食蚜蠅和瓢蟲等)的主要甚至是專一的食物，因此蚜蟲經(jīng)常被作為指示性生物來用于轉基因作物的環(huán)境風險評價。根據(jù)蚜蟲專性取食植物韌皮部汁液的特性，在轉基因作物的韌皮部汁液中是否存在殺蟲蛋白便成為殺蟲蛋白能否通過食物鏈和食物網(wǎng)影響更高營養(yǎng)級昆蟲的關鍵。
[0004]目前，國內(nèi)外的研究中，常用的提取植物汁液的方法有兩種，一種是使用微型毛血管，另一種是使用乙二胺四乙酸緩沖液直接從割破的葉片傷口處提取汁液。但是，第二種方法被證實在葉片被割破后，來自破損細胞的汁液會污染樣品從而導致結果的不準確性，第一種方法雖然能避免污染的發(fā)生，但是操作過程比較繁瑣，而且對技術的熟練度也要求較聞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法。
[0006]為解決技術問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0007]提供一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，具體包括如下步驟:
[0008](I)將經(jīng)過浸種、催芽處理的轉基因水稻種子平鋪到塑料托盤中，加入清水使其沒過上述水稻種子，然后將塑料托盤放置于人工氣候箱；所述放置條件是:溫度28°C、濕度75 %、先光照14小時(6:00-20:00)、后黑暗10小時(20:00-6:00)，且光照照度為22000LX,當水位低于水稻根系位置時從塑料托盤邊緣加入清水進行補充，以保證水位沒過水稻根系；待到水稻芽變綠，加入以沒過水稻根系用量的營養(yǎng)液；
[0009](2)當步驟(I)中的水稻種子出苗5天后，每天早晨使用移液槍收集水稻苗葉尖部吐出的水珠，然后存放于離心管中，每份樣品標記好時間、樣品名稱，并放置于_20°C冰箱內(nèi)儲存，所述每個水稻品系至少收集3毫升的樣品；
[0010](3)待樣品收集完畢，將冋一水稻品系每天收集到的樣品混合在一起，振湯均勻，然后每個水稻品系設定三個重復，每個重復取I毫升樣品加入500微升PBS/0.55%Tween-20并且振蕩均勻；
[0011](4)將 Bt (CrylAb)純蛋白用所述 PBS/0.55 % Tween-20 分別稀釋到 0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、l.6ppb、3.2ppb和6.4ppb的濃度用作標準曲線的取樣點；
[0012](5)根據(jù)蛋白酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒的說明書的要求，先加50微升CrylAb酶結合物到酶標板的每個孔中，緊接著快速加入50微升的PBS/0.55% Tween-20到第一個孔作為空白對照，加入50微升的CrylAb陽性對照到第二個孔，根據(jù)待測樣品數(shù)量在酶標板剩下的孔中依次加入50微升的樣品；
[0013](6)將酶標板放在桌面上小心的以畫圈的方式搖勻20?30秒鐘，然后放入搖床以200rpm、室溫條件放置90分鐘；
[0014](7)取出上述酶標板，迅速將其翻轉把孔里的液體倒進水槽中，然后加入PBS/0.05% Tween-20，再將其翻轉清空，隨后在毛巾或紙巾上拍打酶標板，以確保液體清除干凈，重復此過程三次；
[0015](8)然后在所述酶標板的每個孔中加入100微升基質(zhì)；
[0016](9)同步驟(6)在搖床中放置30分鐘；
[0017](10)在所述酶標板的每個孔中加入100微升終止液，然后搖勻；
[0018](11)將酶標板放入MQX200酶標儀中以450nm條件讀板，記錄數(shù)據(jù)；
[0019](12)根據(jù)步驟(4)所稀釋的不同濃度的樣品的讀板數(shù)據(jù)制作標準曲線，然后將水稻樣品的讀板數(shù)據(jù)帶入標準曲線方程，從而得到水稻樣品中Bt(CrylAb)殺蟲蛋白的含量。
[0020]本發(fā)明中，所述步驟(2)中選用水稻苗葉尖部吐出的水珠為韌皮部汁液的替代品，用以判斷韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白。因為當土壤水分充足，空氣潮濕，無風且溫度較低的天氣，未受傷的植物的根系從土壤中吸收水分后，通過根壓作用化，水分沿著植物體的導管上升，從葉尖、葉緣部位的水孔向外溢出液滴，即出現(xiàn)吐水現(xiàn)象。禾本科植物的吐水多產(chǎn)生在葉尖或葉邊緣，而容易混淆的露水卻是蓋在葉子表面上的一些微小的水滴。所以根據(jù)植物的這種生理現(xiàn)象，我們選用水稻苗葉尖吐出的水滴來作為韌皮部汁液的替代品進行判斷韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白。
[0021]本發(fā)明中，所述營養(yǎng)液的具體配方是:①將91.6g NH4NOjP 88.6g CaCl2溶解于IL蒸餾水中作為儲備液I ;②將40.3g NaH2PO4.2H20和71.4g K2SO4溶解于IL蒸餾水中作為儲備液2 ;③將324g MgSO4.7Η20溶解于IL蒸餾水中作為儲備液3 ;④將1.5gMnCl2.4Η20、0.934g H3B03、0.031g CuSO4.5Η20、0.074g (NH4) 6Mo7024.4Η20、0.035g ZnSO4.7Η20、7.7gFeCl3.6H20和11.9g檸檬酸一水合物溶解在800ml蒸餾水中，然后加入50ml濃硫酸，再加蒸餾水至IL作為微量元素儲備液；⑤取儲備液1、儲備液2、儲備液3各5ml和微量元素儲備液4ml混合，并加蒸餾水至4L，然后用INNaOH調(diào)PH，使PH值為4.5-5.0。
[0022]本發(fā)明中，所述清水為常見的自來水。[0023]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0024](I)本發(fā)明的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法成本較低，操作簡單，極易掌握，一個實驗員或普通技術員無需經(jīng)過培訓即可完成相應的工作。最重要的一點是由于此種方法整個過程中植株個體未受到損傷，因此，完全避免了污染的可能，保證了結果的準確性。
[0025](2)本發(fā)明的判斷方法同樣適用于其他主要的作物比如小麥、玉米和油菜等(但要在環(huán)境條件方面根據(jù)作物的需要進行適當?shù)恼{(diào)整)，具有很強的實用性。
【具體實施方式】
[0026]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0027]本發(fā)明的實施例中所用的原料均為市售產(chǎn)品或公知技術產(chǎn)品，實施例中所用的操作手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028]作為本發(fā)明的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法的一個優(yōu)選實施例，具體操作如下:
[0029](I)將經(jīng)過浸種、催芽處理的轉基因水稻種子KMD1、KMD2 (由浙江大學和加拿大渥太華大學合作培育)和親本非轉基因水稻種子秀水11平鋪到塑料托盤中，加入清水使其沒過水稻種子，然后將塑料托盤放置于人工氣候箱；所述放置條件是:溫度28°c、濕度75%、先光照14小時(其時間段為6:00-20:00)、后黑暗10小時(其時間段為20:00-6:00)，且光照照度為22000LX，當水位低于水稻根系位置時從塑料托盤邊緣加入水進行補充，以保證水位沒過水稻根系；待到水稻芽變綠，加入以沒過水稻根系用量的營養(yǎng)液；
[0030](2)當步驟(I)中的水稻種子出苗5天后，每天早晨使用移液槍收集水稻苗葉尖部吐出的水珠，然后存放于離心管中，每份樣品標記好時間、樣品名稱，并放置于_20°C冰箱內(nèi)儲存，所述每個水稻品系至少收集3毫升的樣品；
[0031](3)待樣品收集完畢，將冋一水稻品系每天收集到的樣品混合在一起，振湯均勾，然后每個水稻品系設定三個重復，每個重復取I毫升樣品加入來自ELISA試劑盒的500微升PBS/0.55% Tween-20并且振蕩均勻；
[0032](4)將所購買 EnviroLogix Inc.的 Bt(CrylAb)純蛋白用所述 PBS/0.55 %Tween-20 分別稀釋到 0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、l.6ppb、3.2ppb和 6.4ppb 的濃度用作標準曲線的取樣點；
[0033](5)根據(jù)所購買的蛋白酶聯(lián)免疫檢測(即ELISA)試劑盒(EnviroLogix QuantiPIatcli Kit for CrylAb/CrylAc, Porland, ME, USA)的說明書的要求，先加來自ELISA試劑盒的50微升CrylAb酶結合物到酶標板(來自ELISA試劑盒)的每個孔中，緊接著快速加入50微升的PBS/0.55% Tween-20到第一個孔作為空白對照，加入50微升的CrylAb陽性對照(來自ELISA試劑盒)到第二個孔，根據(jù)樣品數(shù)量在剩下的15個孔中依次加入50微升的樣品；
[0034](6)將上述酶標板放在桌面上小心的以畫圈的方式搖勻20-30秒鐘，然后放入搖床(其型號為華利達HZ-2111KA)以200rpm、室溫條件放置90分鐘；
[0035](7)取出上述酶標板，迅速將其翻轉把孔里的液體倒進水槽中，然后加入來自ELISA試劑盒的PBS/0.05% Tween-20，再將其翻轉清空，隨后在毛巾或紙巾上拍打酶標板，以確保液體清除干凈，重復此過程三次；
[0036](8)上述酶標板每個孔加入來自ELISA試劑盒的100微升基質(zhì)；
[0037](9)同步驟(6)在搖床中放置30分鐘；
[0038](10)上述酶標板每個孔中加入來自ELISA試劑盒的100微升終止液，然后搖勻；
[0039](11)將酶標板放入 MQX200 酶標儀(Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)中以450nm條件讀板,記錄數(shù)據(jù)；
[0040](12)根據(jù)步驟(4)所稀釋的不同濃度的樣品的讀板數(shù)據(jù)得到標準曲線y =
0.2985X+0.04 (R2 = 0.979)，然后將水稻樣品的讀板數(shù)據(jù)帶入標準曲線方程，從而得到水稻樣品中Bt(CrylAb)殺蟲蛋白的含量(表1);
[0041]表1KMDl、KMD2和秀水11樣品中Bt(CrylAb)殺蟲蛋白的含量
[0042]
【權利要求】
1.一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，其特征在于，具體包括如下步驟: (1)將經(jīng)過浸種、催芽處理的轉基因水稻種子平鋪到塑料托盤中，加入清水使其沒過上述水稻種子，然后將塑料托盤放置于人工氣候箱；所述放置條件是:溫度28°C、濕度75%、先光照14小時后黑暗10小時，且所述光照的照度為22000LX，當水位低于水稻根系位置時從塑料托盤邊緣加入清水進行補充，以保證水位沒過水稻根系；待到水稻芽變綠，加入以沒過水稻根系用量的營養(yǎng)液； (2)當步驟(1)中的水稻種子出苗5天后，每天早晨使用移液槍收集水稻苗葉尖部吐出的水珠，然后存放于離心管中，每份樣品標記好時間、樣品名稱，并放置于_20°C冰箱內(nèi)儲存，所述每個水稻品系至少收集3毫升的樣品； (3)待樣品收集完畢，將冋一水稻品系每天收集到的樣品混合在一起，振湯均勾，然后每個水稻品系設定 三個重復，每個重復取I毫升樣品加入500微升PBS/0.55% Tween-20并且振蕩均勻；
(4)將Bt 純蛋白用 PBS/0.55% Tween-20 分別稀0.2pp0.4ppb、.0.8ppb、.l.6ppb、.3.2ppb和6.4ppb的濃度用作標準曲線的取樣點； (5)然后先加50微升CrylAb酶結合物到酶標板的每個孔中，接著加入50微升的PBS/0.55% Tween-20到第一個孔作為空白對照，加入50微升的CrylAb陽性對照到第二個孔，根據(jù)待測樣品數(shù)量在酶標板剩下的孔中依次加入50微升的樣品； (6)將酶標板放在桌面上并以畫圈的方式搖勻20~30秒鐘，然后放入搖床以200rpm、室溫條件放置90分鐘； (7)取出上述酶標板，將其翻轉把孔里的液體倒進水槽中，然后加入PBS/0.05%Tween-20，再將其翻轉清空，隨后在毛巾或紙巾上拍打酶標板，以確保液體清除干凈，重復此過程三次； (8)然后在所述酶標板的每個孔中加入100微升基質(zhì)； (9)接著同步驟(6)在搖床中放置30分鐘； (10)所述酶標板的每個孔中加入100微升終止液，然后搖勻； (11)將所述酶標板放入MQX200酶標儀中以450nm條件讀板,記錄數(shù)據(jù)； (12)根據(jù)步驟(4)所稀釋的不同濃度的樣品的讀板數(shù)據(jù)制作標準曲線，然后將水稻樣品的讀板數(shù)據(jù)帶入標準曲線方程，從而得到水稻樣品中Bt殺蟲蛋白的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，其特征在于，所述步驟(2)中選用水稻苗葉尖部吐出的水珠為韌皮部汁液的替代品。
3.根據(jù)權利要求1所述的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，其特征在于，所述營養(yǎng)液的配方如下: ①將91.6g NH4NO3和88.6g CaCl2溶解于IL蒸餾水中作為儲備液I ;②將.40.3gNaH2P04.2Η20和71.4g K2SO4溶解于IL蒸餾水中作為儲備液2 ;③將324gMgS04.7Η20溶解于IL蒸餾水中作為儲備液3 ;④將1.5g MnCl2.4Η20、0.934g Η3Β03、0.031gCuSO4.5Η20、0.074g (NH4) 6Μο7024.4Η20、0.035g ZnSO4.7Η20、7.7gFeCl3.6Η20 和 11.9g 檸檬酸一水合物溶解在800ml蒸餾水中，然后加入50ml濃硫酸，再加蒸餾水至IL作為微量元素儲備液；⑤取儲備液1、儲備液2、儲備液3各5ml和微量元素儲備液4ml混合，并加蒸餾水至4L，然后用I NNaOH調(diào)PH,使PH值為4.5-5.0。
【文檔編號】G01N33/68GK103983786SQ201410208521
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權日:2014年5月16日
【發(fā)明者】陳學新, 任少鵬, 時敏, 楊帆 申請人:浙江大學