與癌癥相關(guān)的新抗原的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了可用于治療和診斷癌癥的新的與癌癥相關(guān)的抗原。本發(fā)明進一步提供了該新抗原結(jié)合蛋白質(zhì)，和免疫偶聯(lián)物的氨基酸和核酸序列。本發(fā)明還涉及診斷和治療的方法以及試劑盒。
【專利說明】與癌癥相關(guān)的新抗原
[0001]本申請是申請日為2006年12月21日、發(fā)明名稱為“與癌癥相關(guān)的新抗原”的中國專利申請?zhí)?00680053091.9的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及與癌癥相關(guān)的新抗原以及用于治療和檢測癌癥的方法和組合物。

【背景技術(shù)】
[0003]在2000年，全世界大約有2200萬人患癌癥，并有620萬人死于這類疾病。每年有超過1000萬的新病例，且這一估計值將在未來15年內(nèi)增加50% (WHO,世界癌癥報告(World Cancer Report)Bernard ff.Stewart and Paul Kleihues, eds.1ARCPress, Lyon, 2003)。目前的癌癥治療局限于侵入式手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，所有的這些方法或是會帶來潛在的嚴重副作用，非特異性毒性和/或?qū)ι眢w意象和/或生活質(zhì)量帶來損傷性改變。癌癥可對化學(xué)療法產(chǎn)生抗性，這減少了進一步的選擇和成功治愈的可能性。一些癌癥的預(yù)后比起其他的而言更糟，而一些癌癥幾乎是致命的。此外，一些有相對高治愈率的癌癥，由于它們的高發(fā)病率而成為主要的殺傷疾病。
[0004]導(dǎo)致目前癌癥治療中的不充分的原因之一是這些治療缺少對受侵襲組織和細胞的選擇性。外科切除術(shù)一般均會切除那些看起來正常的組織以作為“安全邊緣”，而這可增加發(fā)病率和并發(fā)癥的危險。并且，這也可能除去一些可能散布在腫瘤細胞中的健康組織，這些組織可能能夠維持或恢復(fù)受侵襲器官或組織的功能。由于放射和化學(xué)療法的非特異性作用模式，因而將殺死或損傷許多正常細胞。這可導(dǎo)致嚴重的副作用，例如嚴重的惡心、體重減輕和精力減退、脫發(fā)等，并且會增加在以后出現(xiàn)第二種癌癥的危險。對癌細胞具有更高選擇性的治療將不對正常細胞造成損害，從而將改善治療結(jié)果、副作用和生活質(zhì)量。
[0005]對癌癥治療的選擇性可通過靶向作用對癌細胞有特異性但未在正常細胞中發(fā)現(xiàn)的分子而得到改善。然后，這些分子可用作基于抗體的診斷或治療的靶點，或作為能改變它們功能的藥物。
[0006]關(guān)于野生型Scratch蛋白質(zhì)知道的很少，其是在對所得的假設(shè)蛋白質(zhì)序列的概念性翻譯和分析的基礎(chǔ)上獲得的。已發(fā)現(xiàn)哺乳動物的Scratch (Mammalian Scratch) (Scrt)mRNA的表達局限于大腦，脊髓和重新分化的有絲分裂期后的神經(jīng)元中，這意味著其在神經(jīng)元分化中可能扮演的角色。人的哺乳動物的Scratch基因已被定位到q24.3 (染色體8)上(Nakakura 等人，2001a, PNAS vol98p4010-4015 和 Nakakura 等人，2001.Mol.Brain.Res.Vol95pl62-166)。
[0007] 哺乳動物的Scratch與其他鋅指蛋白共享SNAG區(qū)域，如SNAI1，SNAI2, SNAI3, GFII和 GFIIB。盡管少數(shù)研究 SNAG 域(Batlle E 等人，2000.Nat.Cell B1l1Vol.2:84-89 ；Kataoka H 等人，2000.Nucleic Acids Res.Vol.28:626-633 ；Grimes HL 等人，1996.Mol.Cell.B1l.Vol.16:6263-6272 ；Hemavathy K 等人，2000.Mol.Cell.B1l.Vol:20:5087-5095)和蝸牛運動功能的實驗室已發(fā)現(xiàn)了 Scrt基因的過度表達，但蛋白質(zhì)本身的存在到目前為止還未顯示出來。根據(jù)假設(shè)的蛋白質(zhì)序列，Scratch蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)有5個鋅指蛋白區(qū)和SNAG區(qū)對轉(zhuǎn)錄抑制中的功能負責(zé)。該序列表明所得蛋白質(zhì)是核內(nèi)蛋白質(zhì)，且事實上已發(fā)現(xiàn)重組哺乳動物的Scratch的表達局限于轉(zhuǎn)染細胞的核中(Nakakura等人，2001a, PNAS vol98p4010-4015)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本
【發(fā)明者】們已確認出與癌癥相關(guān)的新的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了可用于治療和診斷癌癥的新的與癌癥相關(guān)的抗原。特別的，該抗原與惡性膠質(zhì)瘤、黑素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃癌和/或前列腺癌相關(guān)。
[0009]該新抗原是哺乳動物的Scratch的一種變異體。該變異體具有不存在于野生型Scratch的跨膜區(qū)，因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在細胞表面上探測到。因此，本發(fā)明包括一種分離的蛋白質(zhì)，其包含一種在癌細胞表面表達的與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體。在本發(fā)明的一種實施方式中，該與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體包含由SEQID NO:1定義的氨基酸序列或其變異體，或由SEQ ID NO: 2定義的氨基酸序列或其變異體。
[0010]本發(fā)明的另一方面是分離的蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其變異體或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其變異體。
[0011 ] 本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明所述的分離的蛋白質(zhì)的分離的核酸序列、包含本發(fā)明的核酸序列的重組表達載體和包含本發(fā)明的重組表達載體的宿主細胞。
[0012]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明包括一種檢測或監(jiān)控患有或疑似患有癌癥的研究對象的癌癥的方法，其包括在樣品中的細胞上檢測本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)，其中當(dāng)在細胞上檢測出分離的蛋白質(zhì)時 ，表明存在癌癥。
[0013]此外，本發(fā)明還包括檢測或監(jiān)控患有或疑似患有癌癥的研究對象的癌癥的方法，其包括在樣品中的細胞中檢測與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體的表達，其中當(dāng)在細胞中檢測出與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體的表達時，表明存在癌癥。
[0014]本發(fā)明的進一方面是一種通過調(diào)節(jié)癌細胞中哺乳動物的Scratch的功能或表達來治療或預(yù)防研究對象中癌癥的方法。
[0015]本發(fā)明還包括藥物組合物，其含有有效量的本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的分離的核酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體。
[0016]本發(fā)明的進一方面是本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的分離的核酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體在引起研究對象免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的分離的核酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體在治療或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。
[0018]此外，本發(fā)明包括在研究對象中治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括向研究對象或來自研究對象的細胞施用有效量的本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的分離的核酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體。
[0019]本發(fā)明還包括在研究對象中弓丨起對本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，其包括向研究對象或來自研究對象的細胞施用有效量的本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的分離的核酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體。
[0020]本發(fā)明的另一方面是一種檢測或監(jiān)控研究對象中癌癥的方法，其包括以下步驟:
[0021](I)將取自所述研究對象的測試樣品與特異性結(jié)合到癌細胞抗原的結(jié)合蛋白接觸，以產(chǎn)生結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物；
[0022](2)測量測試樣品中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的量；以及
[0023](3)比較測試樣品和對照中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的量。
[0024]從下面詳細的描述中可以看出本發(fā)明的其它特性以及優(yōu)點。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，由于本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)這里的詳細描述在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)做出各種變化和改變，因此本發(fā)明給出的詳細描述和具體實施例僅是出于示例的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]現(xiàn)對本發(fā)明相關(guān)的附圖進行描述，其中
[0026]圖1示出了 VB3-011結(jié)合到本發(fā)明蛋白質(zhì)上涉及的聚糖聚糖結(jié)構(gòu)。硫酸軟骨素A，也稱作軟骨素-4-硫酸鹽(由于在4位存在硫酸鹽分子)，是一種重復(fù)D-半乳糖胺和葡糖醛酸(A)的線性分子。當(dāng)兩個這樣的CSA分子通過2-6 α鍵交叉相連時，則聚糖單元就代表了一個可由血凝素(HA)⑶識別的聚糖單元。
[0027]圖2是表示HA試劑固定的示意圖。在第一階段，HA的特異性通過阻斷抗-HA/蛋白質(zhì)-G-瓊脂糖表位增強。在第二階段，用蛋白質(zhì)-G-瓊脂糖對其進行固定，同時阻滯任何由抗-1gG偶合步驟產(chǎn)生的非特異性。在第三階段，與乙醇胺反應(yīng)，確保離開HA表位，所有其他的活性胺基團均被阻滯，從而提升對HA的特異性。
[0028]圖3示出了通過VB3-011檢測到的本發(fā)明蛋白質(zhì)的凝集素基純化的結(jié)果。Con-A和WGA外源凝集素下拉非特異性蛋白質(zhì)，而HA僅下拉一種存在于陽性細胞系而在陰性細胞系中缺少的蛋白質(zhì)(圖3Α)。當(dāng)用HA純化后，U87MG、U118MG和Α375顯示出單帶，而Panc-1和Daudi未顯示出可探測的帶(圖3B)。
[0029]圖4示出了由于室溫下降解導(dǎo)致的聚糖的消失。在進行SDS-PAGE分離前，當(dāng)放置于室溫下I小時會在含有HA試劑的IP上觀察到50kDa的帶，導(dǎo)致聚糖殘基的降解從而在36kDa位置上顯示出缺少抗原的聚糖部分的蛋白質(zhì)帶。
[0030]圖5示出了在純化的抗原復(fù)合物中在36kDa分子量(Mw - 36kDa)和等電點(pi)是9.7處出現(xiàn)的一個單一蛋白質(zhì)點。這代表了在VB3-011抗原純化中獲得的2D-PAGE的蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)圖。從凝膠獲得相應(yīng)的點被用作ID目的。
[0031]圖6和SEQ ID NO: 3示出了獲得的多肽的完全定位以及野生型哺乳動物的Scratch分子(登錄號#gi 113775236)的序列覆蓋。
[0032]圖7和SEQ ID NO:4示出了由MDA-MB-435S獲得的gi 115928387的序列覆蓋和用于435S-衍生的序列和Scrt的BLAST序列比對。MDA-MD-435S表現(xiàn)出Scratch的截斷版本即17.823kDa蛋白質(zhì)gi 115928387的存在，其與野牛型的哺乳動物的Scratch分子的序列185-366具有100%的同源性。
[0033] 圖8示出了由A-375細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描譜圖，用以檢測樣品中所有肽離子的存在。在1200-1400V下對靜電納米噴霧下進行100次100_1200amu范圍的掃描獲得了大量的肽回收，隨后對之進行分析獲得蛋白質(zhì)ID為哺乳動物的Scratch。圖8A示出了所有多電荷肽離子的TOF-MS掃描譜圖，圖SB示出了單電荷肽離子的退卷積(反褶積)譜圖。
[0034]圖9示出了由U87MG細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描譜圖，用以檢測樣品中所有肽離子的存在。在1200-1400V下在靜電納米噴霧下進行300次100_1200amu范圍的掃描獲得了大量的肽的回收，隨后對之進行分析獲得蛋白質(zhì)ID為哺乳動物的Scratch。圖9A示出了所有多電荷肽離子的TOF-MS掃描譜圖，圖9B示出了單電荷肽離子的退卷積(反褶積)譜圖。
[0035]圖1O示出了由U118MG細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描譜圖，用以檢測樣品中所有肽離子的存在。在1200-1400V下在靜電納米噴霧下進行27次100_1200amu范圍掃描，獲得了大量的肽的回收，隨后對之進行分析獲得蛋白質(zhì)ID為哺乳動物的Scratch。圖1OA示出了所有多電荷肽離子的TOF-MS掃描譜圖和圖1OB示出了單電荷肽離子的退卷積(反褶積)譜圖。
[0036]圖11和SEQ ID NO:1示出了在表2中所列的質(zhì)譜分析中回收的肽的序列覆蓋，從凝膠內(nèi)經(jīng)胰蛋白酶消化回收了共18個肽，獲得了 67%的蛋白質(zhì)覆蓋。劃下劃線的序列代表回收的肽序列。突出標(biāo)記的肽包括新的序列。具體地，以粗體表示的序列為新的序列，而以斜體表示的序列代表了與哺乳動物的Scratch的完全匹配。
[0037]圖12基于Mowse得分的概率，離子得分_10*Log (P)，其中P是在隨機事件中觀察到的配對概率。得分大于77的蛋白質(zhì)是顯著的(P〈0.05)。示出了從VB3-011Ag回收的肽的肽質(zhì)譜指紋區(qū)的結(jié)果。蛋白質(zhì)得分大于77時被認為是顯著的。觀察到的唯一顯著的蛋白質(zhì)ID指向了一種抗原，即已知的具有得分為149的哺乳動物的Scratch。
[0038]圖13示出了識別出的抗原哺乳動物的Scratch具有重大的得分149。由于數(shù)據(jù)庫服務(wù)器本身的性質(zhì)和相似性/同源性連接的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的所有異型均算作記擊中數(shù)。MS/MS斷裂和肽的同源性證實了該抗原是哺乳動物的Scratch。
[0039]圖14示出了作為三電荷的分子(802.00000, 3+)出現(xiàn)的中性肽Mr.2402.978172的MS/MS離子斷裂。這種肽序列與Scratch的肽完全匹配。中性肽2Mr的單一同位素質(zhì)量(計算):2400.1206 ;離子分數(shù):53 ;預(yù)期值:0.89 ;匹配(粗紅線):使用134個最強峰的72/287片段離子。
[0040]圖15示出了作為兩電荷的分子(1068.500000, 3+)出現(xiàn)的中性肽Mr.2134.985448的MS/MS離子斷裂?；厥盏碾牡倪厒?cè)區(qū)與Scratch的肽完全匹配；然而，序列的其余部分在序列信息中顯示出不超過40%的同源性。中性肽2Mr的單一同位素質(zhì)量(計算):2134.9614 ;離子分數(shù):90 ;預(yù)期值:0.0016 ;匹配(粗紅線):使用36個最強峰的32/220片段離子。
[0041 ] 圖16示出了對成神經(jīng)細胞瘤組織(A-C)和黑素瘤組織(D-F)的VB3-011免疫組織化學(xué)染色的代表性圖片。組織截面分別為:(A)早期的成神經(jīng)細胞瘤(I，II，III期非-N-myc擴增的)，3+ ; (B)非-N-myc擴增的IV期成神經(jīng)細胞瘤，2+ ； (C) N-myc擴增的IV期成神經(jīng)細胞瘤，3+。(D)早期的黑素瘤(1-1II期)，3+; (E) IV期黑素瘤，3+; (F)轉(zhuǎn)移性的疾病，3+。所有的圖片均以400倍放大顯示。
[0042]圖17和SEQ ID N0S:5和3示出了 Scratch-1的限制定位。
[0043]圖18示出了在用抗原-陽性細胞MB-435S(空心圓圈)和抗原-陰性細胞Panc-1 (黑色圓圈)的進行的VB6-011的MTS分析中，VB6-011的體外細胞毒性。以每孔1000個細胞接種的細胞,與Fab-de-bouganin純化的蛋白質(zhì)溫育。溫育(培養(yǎng))5天后,測量細胞生存力和確定出IC5Q。

【具體實施方式】
[0044](A) ^JL
[0045]術(shù)語“細胞”包括一單一的細胞和復(fù)數(shù)個細胞或細胞全體。向細胞施用試劑(例如與癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì))包括活體外和活體內(nèi)施用。
[0046]這里使用的術(shù)語“全身給藥”是指免疫偶聯(lián)物和/或其他的癌癥治療劑可以方便的形式如注射(皮下、靜脈內(nèi)、肌肉等)、口服施用、吸入、經(jīng)過皮膚施用或局部涂敷(例如局部的霜劑或藥膏等)、栓劑涂敷或以植入的方式而被全身地給藥。植入物可以是多孔的、無孔的或凝膠材料，包括膜，例如硅橡膠膜或纖維。栓劑通常含有重量含量在0.5% -10%范圍內(nèi)的活性成分。
[0047]術(shù)語“氨基酸”包括所有的天然氨基酸和改性的氨基酸。
[0048]這里使用的術(shù)語“抗體”意在包括單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體?？贵w可來自重組源和/或在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)產(chǎn)生。這里使用的術(shù)語“抗體片段”意在包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚體、微抗體(minibody)、雙價抗體(diabody)和它們的多聚體以及雙特異性的抗體片段?？贵w可采用傳統(tǒng)技術(shù)被片段化。例如，？(&13’)2片段可通過用胃蛋白酶處理抗體而產(chǎn)生?？蓪λ玫腇(ab’)2片段進行處理還原二硫鍵，從而產(chǎn)生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可形成Fab片段。Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、dsFv、ds_scFv、二聚體、微型抗體、雙鏈抗體片段和其他片段也可通過重組技術(shù)合成。
[0049]“至少在中等嚴格雜交條件下”是指所選擇的條件促進了溶液中兩個互補核酸分子之間的選擇性雜交。雜交可發(fā)生在全部或部分的核酸序列分子上。雜交部分通常具有至少15(例如20，25，30，40或50)個核苷酸的長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到核酸雙鏈或雜種的穩(wěn)定性是由Tm決定，而在含鈉的緩沖液中，Tm是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(Tm =81.5。。- 16.6 (LoglO [Na+])+0.41(% (G+C) - 600/1)，或類似的等式)。因此，決定雜種的穩(wěn)定性的清洗條件下的參數(shù)為鈉離子濃度和溫度。為了確認與已知合適分子相似但不相同的分子，可假設(shè)I %的錯配導(dǎo)致Tm降低約1°C，例如如果尋求的核酸分子具有>95%的相同性，則最終的清洗溫度將降低約5°C?；谶@些考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇適當(dāng)?shù)碾s交條件。在優(yōu)選的實施方式中，選擇的是嚴格的雜交條件。例如，可采用以下條件來獲得嚴格雜交:在5倍氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)/5x DenhardtJ s溶液/1.0% SDS下根據(jù)上述等式在Tm-5°C下進行雜交，然后用0.2x SSC/0.1% SDS在60°C下清洗。中等嚴格的雜交條件包括在3x SSC中42°C下的洗滌步驟。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是使用其他可替代的緩沖液、鹽和溫度也可獲得等同的嚴格性。關(guān)于雜交條件的其他的指南可在以下文獻中找到:當(dāng)代分子生物學(xué)指導(dǎo)(Current Protocols in Molecular B1logy), John ffiley&Sons, N.Y.，2002,以及 Sambrook 等.，分子克隆:實驗指南(Molecular Cloning:a LaboratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001.
[0050]這里使用的術(shù)語“結(jié)合蛋白質(zhì)”是指特異性結(jié)合到另一種物質(zhì)如本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的抗原上的蛋白質(zhì)。在一種實施方式中，結(jié)合蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段。
[0051]“適用于活體內(nèi)施用的生物相容形式”是指施用物質(zhì)的形式產(chǎn)生的治療效果超過任何的毒性效果。
[0052]這里使用的術(shù)語“與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體”、“本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的抗原”、“本發(fā)明的與腫瘤相關(guān)的抗原”或“本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)”是指在癌癥細胞表面表達的哺乳動物的Scratch的一種新變異體，或者是這種新變異體的也表達于癌癥細胞表面的變異體。在一種實施方式中，該新的與癌癥相關(guān)的抗原具有至少一個跨膜區(qū)。在具體的實施方式中，該與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的抗原是包含SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)或包含了 SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)。
[0053]術(shù)語“癌細胞”包括癌癥或腫瘤形成的細胞、轉(zhuǎn)化的細胞或易變?yōu)榘┌Y或腫瘤形成細胞的細胞。
[0054]這里使用的“保守的氨基酸取代”是其中的一個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基代替但不會失去蛋白質(zhì)期望的性能的氨基酸取代。
[0055]這里使用的術(shù)語“對照”是指從已知患有癌癥或未患有癌癥的研究對象或一組研究對象中獲取的樣品。
[0056]術(shù)語“可控制釋放系統(tǒng)”用于指免疫偶聯(lián)物和/或本發(fā)明的其他的癌癥治療劑可以可控的形式進行施用。例如，微動泵可將控制的計量直接輸送至腫瘤區(qū)域，從而精細地調(diào)節(jié)著藥物組合物施用的時間和濃度(參見如Goodson, 1984, in Medical Applicat1ns ofControlled Release, vol.2, pp.115-138)。
[0057]術(shù)語“肽的衍生物”是指具有一個或多個通過官能側(cè)基的反應(yīng)而化學(xué)衍生的殘基的肽。這類衍生的分子包括如那些自由氨基經(jīng)衍生形成了胺鹽酸鹽、對甲苯磺?；?、芐氧羰基、叔丁基氧羰基、氯乙?；蚣柞；姆肿?。自由的羧基可經(jīng)衍生形成鹽、甲基和乙基酯或其他類型的酯或酰肼。自由羥基可經(jīng)衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可經(jīng)衍生形成N-1m-芐基組氨酸。衍生物還包括那些含有20種標(biāo)準氨基酸中的一個或多個天然氨基酸衍生物的肽。例如:4_羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5_羥基賴氨酸可取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸；以及鳥氨酸可取代賴氨酸。
[0058]表達“檢測或監(jiān)控癌癥”是指確定研究對象是否患有癌癥、癌癥的范圍、癌癥的嚴重程度和/或癌癥的等級的方法或過程。
[0059]這里使用的術(shù)語“直接施用”是指癌癥治療劑可不加限制地在腫瘤內(nèi)、脈管內(nèi)和腫瘤周圍進行施用。例如，癌癥治療劑的施用可以是通過一次或多次直接注射至腫瘤內(nèi)、連續(xù)或不連續(xù)輸入腫瘤內(nèi)、引入癌癥治療劑的儲液器、向腫瘤內(nèi)引入慢速釋放裝置、向腫瘤內(nèi)引入慢速釋放制劑和/或在腫瘤上直接涂敷進行。施用“至腫瘤內(nèi)”的模式包括將癌癥治療劑引入至腫瘤區(qū)域，或至在很大程度上直接流入腫瘤區(qū)域內(nèi)的血管或淋巴管內(nèi)。
[0060]這里的表達“有效量”是指在劑量上和在一段時間內(nèi)獲得期望效果所需要的的有效劑量。治療劑的有效量可根據(jù)如動物的疾病階段、年齡、性別、體重這些因素而改變。給藥方案可經(jīng)調(diào)整而提供最佳的治療應(yīng)答。例如，可每日分開多次施用劑量或可根據(jù)治療情況中出現(xiàn)的緊急情況而按比例地減少劑量。
[0061] 這里使用的術(shù)語“誘發(fā)免疫應(yīng)答”或“導(dǎo)致免疫應(yīng)答”是指引起、觸發(fā)、導(dǎo)致、增強、改善或增加免疫系統(tǒng)的任何應(yīng)答，這種應(yīng)答例如可以是體液或細胞介導(dǎo)性質(zhì)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定方法來評定免疫應(yīng)答的誘發(fā)或增強，這些方法包括但不限于:抗體檢測(例如ELISA檢測)、抗原特異性細胞毒性檢測和細胞因子的產(chǎn)生(例如ELISP0T檢測)。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、核酸序列或重組的表達載體，以及本發(fā)明的方法觸發(fā)或增強了細胞的免疫應(yīng)答，更優(yōu)選的是T細胞的應(yīng)答。
[0062]這里使用的術(shù)語“VB3-011抗體”是指具有在W097/044461中揭露的抗體的可變區(qū)的抗體，其顯示出對各種癌細胞的特異性結(jié)合但不會與正常組織或細胞發(fā)生顯著結(jié)合。
[0063]這里使用的術(shù)語“分離的核酸序列”是指當(dāng)由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基的核酸，或指當(dāng)通過化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物的核酸。并且，分離的核酸也是基本上不含有天然位于衍生該核酸的核酸兩側(cè)的序列(即位于核酸5’和3’端的序列)。術(shù)語“核酸”意在包括DNA和RNA，且可以是雙鏈的或單鏈的。
[0064]這里使用的術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”是指當(dāng)由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)，或指當(dāng)通過化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物的核酸。它包括本發(fā)明的新的與癌癥相關(guān)的抗原。
[0065]“哺乳動物的 Scratch”(gi 113775236:gi I 46397014:gi 113129535)是由定位于人類染色體8的q24.3上的基因編碼的蛋白質(zhì)。通過對基于概念式轉(zhuǎn)錄的假定蛋白質(zhì)序列的分析可知，哺乳動物的Scratch具有5個鋅指區(qū)域和I個SNAG區(qū)域。它被認為是一種細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)。該假定蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID N0:3中。
[0066]這里使用的術(shù)語“核酸序列”是指由天然堿基、糖和糖間(骨架)連接構(gòu)成的核苷或核苷酸單體的序列。該術(shù)語還包括由非天然單體或其部分構(gòu)成的改性的或取代的序列。本發(fā)明的核酸序列可以是脫氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，且可包括天然堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。該序列還可含有改性的堿基。這種改性的堿基的例子包括氮雜和脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黃嘌呤和次黃嘌呤。
[0067]這里使用的術(shù)語“樣品”是指任何來自可用于癌癥測定的研究對象的流體、細胞或組織樣品。
[0068]這里使用的術(shù)語“序列同一性”是指兩個多肽序列之間的相同序列的百分比。為了確定兩個多肽序列之間的相同序列的百分比，將這兩個序列的氨基酸序列進行比對，優(yōu)選使用的是 Clustal W algorithm (Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994, NucleicAcids Res.22(22):4673-4680)和 BL0SUM62 評分矩陣(Henikoff S.和 HenikoffJ.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 - 10919)以及空位開放罰分為 10 和空位延伸罰分為0.1，這樣當(dāng)一個序列總長度的至少50%包含在比對中時，在兩序列之間獲得的為最高級的匹配?？捎糜诒葘π蛄械钠渌椒镹eedleman和Wunsch的比對法(J.Mol.B1l., 1970, 48:443),該法由 Smith 和 Waterman (Adv.App1.Math., 1981, 2:482)加以改進，從而在兩序列之間獲得了最高級的匹配，且確定出了兩序列之間的相同氨基酸的數(shù)目。現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他的計算兩氨基酸序列之間的同一性百分比的方法包括如那些由 Carillo 和 Lipton 描述的方法(SIAM J.Applied Math.，1988，48:1073)和在Computat1nal Molecular B1logy, Lesk, e.d.0xford University Press, New York, 1988, B1computing:1nformatics and Genomics Projects 中描述的方法。一般來說，將應(yīng)用到計算機程序來進行這樣的計算?？捎迷谶@里的計算機程序包括但不限于GCG(DeVereUx等人，Nucleic Acids Res., 1984, 12:387) BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul 等人，J.Molec.B1l.，1990:215:403)。
[0069]這里使用的術(shù)語“研究對象”是指動物界內(nèi)任何的動物成員，優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人類。在一種優(yōu)選的實施方式中，研究對象疑似患有癌癥或患有癌癥。
[0070]這里使用的表達“治療或預(yù)防癌癥”是指抑制癌細胞復(fù)制、預(yù)防細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y形成細胞、抑制癌癥擴散(轉(zhuǎn)移)、抑制腫瘤生長、減少癌細胞數(shù)目或腫瘤生長、降低癌癥的惡性程度(例如分化增加)或緩解與癌癥相關(guān)的癥狀。
[0071]這里使用的術(shù)語“變異體”包括本發(fā)明的氨基酸和核苷酸序列的變異體或化學(xué)等同物，其以與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸分子基本相同的方式履行著基本相同的功能。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的變異體包括但不限于保守的氨基酸取代。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的變異體還包括對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的插入或缺失。此外，變異的肽和變異的核苷酸序列包括類似物和其衍生物。本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的抗原的變異體是指在之細胞上表達而不在正常細胞上表達的蛋白質(zhì)序列。
[0072](B)與癌癥相關(guān)的新抗原
[0073]本發(fā)明提供了一種與癌癥相關(guān)的新抗原，其在癌細胞表面表達但不在正常細胞表面有顯著表達。這種新的與癌癥相關(guān)的抗原是哺乳動物的Scratch的一種變異體。其具有哺乳動物的Scratch中不存在的跨膜區(qū)域。該跨膜區(qū)域的序列示于SEQ ID N0:2。與癌癥相關(guān)的變異體的序列示于SEQ ID NO:1。
[0074]在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)，其含有由SEQ ID N0:1或其變異體定義的序列的氨基酸。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)，其含有由SEQ ID NO:2或其變異體定義的序列的氨基酸。
[0075]這種與癌癥相關(guān)的新抗原是在在癌細胞表面表達的哺乳動物的Scratch。因此，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)，其包含一種與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體，其中該與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體在癌細胞表面表達。在一種實施方式中，與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體包含由SEQ ID NO:1定義的氨基酸序列。在另一種實施方式中，與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體包含由SEQ ID N0:2定義的氨基酸序列。
[0076]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠認識到本發(fā)明包括了氨基酸序列SEQ ID N0S:1_2的變異體，其他該變異體也是與癌癥相關(guān)的抗原。變異體包括本發(fā)明揭露的序列的化學(xué)等同物。這樣等同物包括在這里公開的具體蛋白質(zhì)基本具有相同的方式履行著基本相同的功能。例如，等同物包括但不限于保守的氨基酸取代。
[0077]在一種實施方式中，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的變異的氨基酸序列具有至少50%，優(yōu)選為至少60%，更優(yōu)選為至少70%，最優(yōu)選為至少80%，以及進一步更優(yōu)選為至少90%的與SEQ ID N0S:1或2的序列同一性。
[0078]本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的分離的核酸序列。在一種實施方式中，該分離的核酸序列具有示于SEQ ID N0:6中的序列。此外，本發(fā)明還包括了編碼本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)的分離核酸序列的變異體。例如，該變異體包括在至少在中等嚴格雜交條件下，雜交到編碼本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)的核酸序列上的核苷酸序列。該變異的核酸序列編碼與癌癥相關(guān)的抗原蛋白質(zhì)。
[0079] 本發(fā)明包括分離的蛋白質(zhì)或與癌癥相關(guān)的抗原以及相應(yīng)的核酸序列的應(yīng)用。例如，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合蛋白質(zhì)和免疫偶聯(lián)物的應(yīng)用，而它們又可用作治療或預(yù)防癌癥或可用于檢測或監(jiān)控研究對象中的癌癥。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)和核酸序列在治療或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用以及在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防癌癥或用于診斷癌癥的藥物中的應(yīng)用。
[0080](C)與癌癥相關(guān)的新抗原的藥物組合物、方法和應(yīng)用
[0081]本發(fā)明提供了一種在癌細胞表面表達但在正常細胞表面沒有顯著表達的新的與癌癥相關(guān)的抗原。因此，該新的與癌癥相關(guān)的抗原可用于治療和預(yù)防癌癥的療法中，這包括使用本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)來在活體內(nèi)引起免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明還包括癌癥的診斷方法，其包括對新的與癌癥相關(guān)的抗原的檢測。
[0082]癌癥可以是任何在其細胞表面表達本發(fā)明的與癌癥相關(guān)的抗原的癌癥。在本發(fā)明的一種實施方式中，癌癥包括但不限于:胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、頭和頸癌、鱗狀細胞癌、胃腸癌、乳癌(例如癌瘤、導(dǎo)管的、小葉的和乳頭的)、肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、腦癌、成神經(jīng)細胞瘤、肉瘤、直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、漿細胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在一種優(yōu)選的實施方式中，癌癥包括但不限于:成膠質(zhì)細胞瘤、黑素瘤、乳癌、肺癌、卵巢癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、胃癌和/或前列腺癌。
[0083](i)藥物組合物
[0084]本發(fā)明的一個方面是一種藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)與適合的稀釋劑或載體的混合。本發(fā)明的另一個方面是一種藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的分離的核酸與適合的稀釋劑或載體的混合。本發(fā)明的進一個方面是一種藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的重組表達載體與適合的稀釋劑或載體的混合。
[0085]本發(fā)明的藥物組合物例如可用于治療或預(yù)防癌癥。此外，藥物組合物可用于在研究對象中引起對本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
[0086]這里描述的組合物可由已知的制備可施用于研究對象的藥學(xué)上可接受的組合物的方法制備，使得有效量的活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體進行組合。適合的載體例如描述 (6: Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's PharmaceuticalSciences, 20thed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000)中。在該基礎(chǔ)上，所述組合物包括但不限于與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相關(guān)的物質(zhì)的溶液，且包含在具有適合的pH和生理液體等滲透壓的緩沖液中。
[0087]如果免疫試劑(例如本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)和/或編碼它的核酸序列，和/或重組表達載體)和/或組合物無論采取何種施用形式都與佐劑形成共免疫的話，則免疫原性可得到顯著提高。通常，佐劑的用量是在磷酸緩沖鹽水溶液中占0.05-1.0%。佐劑增強了免疫原的免疫原性，但它們自身不一定是產(chǎn)生免疫性的。佐劑可通過在施用部位附近局部保留免疫原產(chǎn)生貯藏效果，從而有利于緩慢、持續(xù)地向免疫系統(tǒng)的細胞釋放免疫原而作用。佐劑也可將免疫系統(tǒng)的細胞吸引至免疫原貯藏處，并刺激這些細胞引發(fā)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的實施方式進一步包含了含有佐劑的藥物組合物。
[0088]多年以來佐劑已被用于改善宿主對如疫苗的免疫應(yīng)答。內(nèi)源性佐劑(例如脂多糖)通常是用死亡的或減毒的細菌組分作為疫苗。外源性佐劑為免疫調(diào)節(jié)劑，其通常是非共價地連接至抗原且經(jīng)配制增強宿主的免疫應(yīng)答。因此，已鑒定出增強腸胃外給藥的抗原的免疫應(yīng)答的佐劑。然而，這些佐劑中的一些是有毒的，且可導(dǎo)致不期望的副作用，從而使得它們不適合用于人類和許多動物。事實上，僅有氫氧化鋁和磷酸鋁(統(tǒng)稱為明礬(alum))被常規(guī)地用作人和獸用疫苗中的佐劑。明礬在增強抗體對白喉和破傷風(fēng)類毒素的抗體應(yīng)答的效果已得到很好的建立。然而，它也有一些限制。例如，明礬對流感接種疫苗無效，且不能與其他免疫原一致地引發(fā)細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。由明礬作為佐劑抗原引發(fā)的抗體主要是鼠中的IgGl同種型，其受到一些疫苗試劑的保護可能不是最佳的。
[0089]許多外源性佐劑可激發(fā)對免疫原的潛在免疫應(yīng)答。這些包括復(fù)合到細胞膜蛋白抗原上的皂角苷(免疫激發(fā)復(fù)合物)、具有礦物油的普郎尼克類(pluixmic)聚合物、殺死的分枝桿菌和礦物油、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、細胞產(chǎn)物如胞壁?；?MDP)和脂多糖(LPS)，以及脂質(zhì)A和脂質(zhì)體。
[0090]在本發(fā)明的一個方面，可用在這里描述的發(fā)明中任何一種實施方式的佐劑如下。用于腸胃外免疫的佐劑包括鋁化合物(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁和羥基磷酸鋁)。根據(jù)標(biāo)準實驗方案，抗原可以與鋁化合物一同發(fā)生沉淀或吸附到鋁化合物上。其他的佐劑例如RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)也可用于腸胃外施用。
[0091]用于粘膜免疫的佐劑包括細菌毒素(例如霍亂毒素(CT)、大腸桿菌不耐熱毒素(LT)、艱難梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)，或它們的組合、亞單元、類毒素或突變體)。例如，可使用天然霍亂毒素亞單元B (CTB)的純化制劑。只要它們保留著佐劑活性，任何這些毒素的片段、類似物、衍生物和融合物都是適合的。優(yōu)選使用的是具有減毒的突變體。適合的突變體已經(jīng)描述(W095/17211 (Arg-7-Lys CT 突變體)、W096/6627 (Arg-192-Gly LT 突變體)和TO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突變體))。可用于本發(fā)明的方法和組合物中的其他 LT 突變體包括如 Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-11-Asp 和 Glu-112-Asp 突變體。其他的佐劑也可以用于粘膜給藥(例如各種來源的細菌單磷酰脂A(MPLA)(例如大腸桿菌、明尼蘇達沙門氏菌(Sal monella minnesota)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、阜式或聚乳酸/甘醇酸(PLGA)微球。
[0092]可兼用于粘膜和腸胃外的佐劑包括聚磷腈(polyphosphazene)(例如，冊95/2415)、00吐01(313-0-況，^-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰)膽固醇(例如美國專利號 5，283，185 和 W096/14831)以及 QS-21 (例如 W088/9336)。
[0093]可采用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)途徑，用含有本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的分離的核酸序列和/或本發(fā)明的重組表達載體的藥物組合物對研究對象進行免疫。這可包括，例如通過粘膜(例如，眼睛的、鼻內(nèi)的、口腔的、胃的、肺的、腸的、直腸的、陰道的或尿道的)表面、通過腸胃外(例如皮下的、皮內(nèi)的、肌肉的、靜脈內(nèi)的或腹膜內(nèi)的)的途徑或結(jié)節(jié)內(nèi)進行免疫。優(yōu)選的途徑取決于免疫原的選擇，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的?？梢允菃我粍┝炕蛞欢ㄩg隔內(nèi)重復(fù)劑量進行施用。適合的劑量取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的各種參數(shù)，例如免疫原本身(例如肽對核酸(和其更特異性的類型)、施用途徑和被接種的動物的狀況(例如:重量、年齡和類似條件等)。
[0094]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解藥物組合物可配制成適合于在活體內(nèi)施用的生物相容的形式而向研究對象施用。可向包括人和動物在內(nèi)的活的有機體施用這些物質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物的治療活性量的施用定義為獲得期望結(jié)果所必需的在劑量下和時間內(nèi)的有效量。例如，物質(zhì)的治療活性量可因各種因素而變化，例如因個體的疾病狀況、年齡、性別和體重，以及本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力。給藥方案可經(jīng)調(diào)整而提供最佳的治療應(yīng)答。例如，可每日分開多次施用劑量或可根據(jù)治療中出現(xiàn)的緊急事件而成比例地減少劑量。
[0095]本發(fā)明的藥物組合物可全身地給藥。藥物制劑可直接向癌癥部位施用。根據(jù)給藥途徑，藥物組合物可以包衣在材料中，以保護組合物不受失活所述組合物的酶、酸和其他天然條件的作用影響。
[0096]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，藥物組合物是通過直接施用向研究對象給藥的。本發(fā)明預(yù)期了施用至少足以獲得終點的量的藥物組合物，且如果需要，該藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體。
[0097]根據(jù)另一方面，藥物組合物可在活體外進行施用。例如，淋巴細胞可從患有癌癥的研究對象中取出并用組合物進行活體外刺激，然后融合回研究對象中。
[0098]本發(fā)明還提供了用于降低手術(shù)后并發(fā)癥危險的方法，該方法包括在治療癌癥的手術(shù)之前、手術(shù)其間或手術(shù)之后施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
[0099]藥物組合物包括但不限于:凍干粉或水溶液的或非水溶液的經(jīng)滅菌的可注射溶液或懸浮液，其可進一步含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和賦予組合物與受體的組織或血液基本相容性的溶質(zhì)。可存在于這種組合物中的其他成分包括如水、表面活性劑(例如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。即時注射溶液和懸浮液可由滅菌粉末、顆粒、片劑或濃縮溶液或懸浮液來制備。本發(fā)明的藥物組合物的供應(yīng)形式例如包括但不限于凍干粉的形式，其可用消毒過的水或鹽水在向研究對象施用前進行重建。
[0100]本發(fā)明的藥物組合物可含有藥學(xué)上可接受的載體。適合的藥學(xué)上可接受的載體包括基本上為化學(xué)惰性和無毒的組合物，它們不影響藥物組合物的生物活性的有效性。適合的藥物載體的例子包括但不限于:水、鹽水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(I (2, 3-二油酰氧基)丙基)N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和脂質(zhì)體。這些組合物應(yīng)當(dāng)含有治療有效量的化合物和適合量的載體，從而提供可向研究對象直接施用的形式。
[0101]組合物可以是藥學(xué)上可接受的鹽的形式，其包括但不限于那些形成了自由氨基的鹽，例如那些衍生自氯化氫、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，以及那些形成了自由羧基的鹽，例如那些衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。
[0102]在本發(fā)明的各種實施方式中，藥物組合物是直接全身地進行施用或直接向腫瘤區(qū)域施用。
[0103]在所述藥物組合物可用于治療患有癌癥的包括哺乳動物，優(yōu)選為人的動物的方法中。被施用的藥物組合物的劑量和類型將取決于各種因素，而這些因素可在人類研究對象中容易地得到監(jiān)控。這些因素包括癌癥的病因?qū)W和嚴重程度(等級和階段)。
[0104] 使用本發(fā)明的藥物組合物的臨床結(jié)果可容易由相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員，如醫(yī)師所辨別。例如，用于測量癌癥的臨床標(biāo)記物的標(biāo)準醫(yī)學(xué)測試可作為治療有效性的有力的指示物。這些測試可包括但不限于:身體檢查、性能尺度、疾病標(biāo)記物、12-導(dǎo)聯(lián)心電圖(EGC)、腫瘤測量、組織切片檢查、細胞檢查、細胞學(xué)、腫瘤的最長直徑計算、射線照相術(shù)、腫瘤的數(shù)字成像、生命體征、體重、不良事件的記錄、傳染性事件的評估、伴隨藥物治療的評估、疼痛的評估、血液或血清化學(xué)、尿分析、CT掃描以及藥物代謝動力學(xué)分析。另外，包含了本發(fā)明的藥物組合物和另一種癌癥治療劑的聯(lián)合療法的協(xié)同效果可通過與接受單一療法的病人進行比較來確定。
[0105]本發(fā)明的另一種實施方式是用于治療或預(yù)防癌癥的試劑盒，其包含有效量的本發(fā)明的藥物組合物，以及使用這種藥物組合物來治療癌癥的說明。
[0106]在大多數(shù)批準通過的抗癌療法中，抗癌療法都是與其他抗癌療法組合使用的。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的藥物組合物與至少一種另外的抗癌療法的組合使用預(yù)防或治療癌癥的方法。其他的抗癌療法可在本發(fā)明的藥物組合物施用之前、交疊、 同時和/或之后施用。當(dāng)同時施用時，本發(fā)明的藥物組合物和其他癌癥治療可在單一配方或分開的配方施用，如果是分開的配方，則可選擇地釆用不同的施用模式。一種或多種本發(fā)明的藥物組合物和一種或多種其他的癌癥療法的組合可協(xié)同地對抗腫瘤或癌癥。所述其他的癌癥療法包括但不限于：放射療法和其他的抗癌治療劑。這些其他的抗癌治療劑可包括但不限于：2，2’，2’’-三氯三乙基胺、6-氮雜尿苷、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、6-巰基票呤、醋葡醒內(nèi)酯、阿克拉霉素放射菌素（aclacinomycins actinomycin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨苯乙哌卩定酮(aminoglutethimide)、安口丫 P定(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安西他濱(ancitabine)、血管生成素反義寡核苷酸(angiogenin antisense oligonucleotide)、安曲霉素（anthramycin)、阿扎胞苷（azacitidine)、氮絲氨酸（azaserine)、氮丙唳（aziridine)、batimastar、bcl_2 反義寡核苷酸(bcl_2antisense oligonucleotide)、苯佐替派(benzodepa)、比卡魯胺 (bicalutamide)、比生群（bisantrene)、博來霉素（bleomycin)、布舍瑞林（buserelin)、 白消安（busulfan)、放線菌素 C (cactinomycin)、卡普睪酮（calusterone)、卡鉬 (carboplatin)、卡波昆（carboquone)、洋紅霉素（carminomycin)、卡莫氟（carmofur)、 卡莫司?。╟armustine)、卡柔比星（carubicin)、嗜癌霉素（carzinophilin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯地孕酮(chlormadinone acetate)、 葡糖氯乙亞硝脲(chlorozotocin)、色霉素(chromomycins)、順鉬(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地磷酰胺 (defosfamide)、脫擬秋水仙減(demecolcine)、denopterin、地托比星(detorubicin)、 地口丫酉昆(diaziquone)、多烯紫衫醇(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、多柔比星（doxorubicin)、屈洛昔芬（droloxifene)、屈他雄酮（dromostanolone)、依達曲沙(edatrexate)、efIomithine^ 依利醋銨(elliptinium acetate)、乙啼替氟 (emitefur)、enocitabune、表柔比星(epirubicin)、環(huán)硫雄酉享(epitiostanol)、依索比星 (esorubicin)、雌莫司?。╡stramustine)、依托格魯（etoglucid)、依托泊式（etoposide)、 法倔唑（fadrozole)、芬維 A 胺（fenretinide)、氟尿苷（fIoxuridine)、氟拉達濱 (f Iudarabine)、氟尿啼唳(f Iuorouracil)、氟他胺（f Iutamide)、亞葉酸(folinic acid)、 福美斯坦（formestane)、憐雌酷（fosfestrol)、福莫司汀（fotemustine)、硝酸嫁（gallium nitrate)、吉西他濱(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、己焼雌酷(hexestrol)、 輕基脲(hydroxyurea)、依達比星(idarubicin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、英丙舒凡（improsulfan)、干擾素-ct (interferon-alpha)、干擾素-旦（interferon-beta)、 干擾素-Y (interferon-gamma)、白細胞間介素-2 (interleukin-2)、L-天冬酰胺酶 (L-asparaginase)、香燕多糖（Ientinan)、來曲唑（Ietrozole)、柳菩林（Ieuprolide)、洛莫司汀(1mustine)、氯尼達明(1nidamine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、麻西羅霉素(marcel1mycin)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、安宮黃體素(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、甲地孕酮(melengestrol)、美法侖(melphalan)、美諾立爾(menogaril)、美雄焼(mepit1stane)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美妥替哌(meturedepa)、米帕(miboplatin)、滅特復(fù)星(miltefosine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)、絲裂霉素(mitomycins)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌達酉享(mopidamol)、霉酌.酸(my cophenol ic acid)、尼魯米特(nilutamide)、尼莫司汀(nimustine)、nitracine、諾拉霉素(nogalamycin)、新恩比興(novembichin)、olivomycins、奧沙利鉬(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、噴司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、phenamet、phenesterine、哌泊溴焼(pipobroman)、哌泊舒凡(piposulfan)、吡柔比星(pirarubicin)、批；曲克辛(piritrexim)、普卡霉素(plicamycin)、podophyllinicacid2-ethyl_hydrazide、聚憐酸雌二醇(polyestrad1l phosphate)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、紫菜霉素(porfiromycin)、潑尼莫司汀(prednimustine)、甲基節(jié)月井(procabazine)、普羅帕吉曼(propagermanium)、PSK、蝶羅呤(pteropterin)、P票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、雷莫司汀(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、羅多比星(rodorubicin)、羅喹美克(roquinimex)、西佐糖(sizofican)、索布佐生(sobuzoxane)、鍺螺胺(spirogermanium)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈脲佐菌(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、泰素帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊式(teniposide)、細交鏈抱菌酮酸(tenuzonic acid)、睪內(nèi)酯(testolactone)、thiamiprine、硫鳥_呤(th1guanine)、塞替派(th1tepa)、雷替曲塞(Tomudex)、拓撲替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、三亞胺醌(triaziquone)、曲他胺(triethylenemeIamine)、三乙基憐銨(triethylenephosphoramide)、三乙基硫代憐銨(triethyleneth1phosphoramide)、曲洛司坦(trilostane)、三甲曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、曲憐胺(trofosfamide)、trontecan、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、尿啼卩定氮芥(uracil mustard)、烏瑞替派(uredepa)、氨基甲酸乙酯(urethan)、長春減(vinblastine)、長春新減(vincristine)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、吉姆單抗(gemtuzumab)、th1epa、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、抗代謝藥(如甲氨蝶呤(methotrexate)、6_ 巰口票呤(6-mercaptopurine)、6 —硫代鳥票呤(6-th1guanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿啼卩定(5_fIuorouraciI)、氟達拉濱(fIudarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、氮烯咪胺(dacarbazine)、temozoamide)、六甲三聚氰胺(hexamethyImeIamine)、密妥坦(LYSODREN)、核苷類似物(nucleoside analogues)、植物生物堿(例如泰素(Taxol)、紫杉醇(paclitaxel)、喜樹堿(camptothecin)、拓撲替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan) (CAMPTOSAR，CPT-1I)、長春新減(vincristine)、長春花生物減(vincaalkyloids)例如長春堿(vinblastine))、鬼曰毒素(podophyllotoxin)、表鬼曰毒素(epipodophyIlotoxin)、VP_16 (依托泊式(etoposide))、細胞松馳素 B (cytochalasin B)、短桿菌肽 D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、蒽環(huán)類藥物(anthracyclines)(例如柔紅霉素(daunorubicin))、阿霉素脂質(zhì)體(doxorubicinliposomal)、二羥基蒽化二酮(dihydroxyanthracind1ne)、光輝霉素(mithramycin)、放線菌素 D (actinomycin D)、阿地白介素(aldesleukin)、allutamine、biaomycin、卡培他濱(capecitabine)、carboplain、chlorabusin、cyclarabine、daclinomycin、floxuridhe、醋酸亮丙瑞林(lauproIide acetate)、左方定咪唑(Ievamisole)、lomusline、mercaptopurino、美司那(mesna)、mitolanc、pegaspergase、pentoslatin、picamycin、riuxlmab、坎帕斯 _1 (campath-1)、straplozocin、維 A 酸(tretinoin)、VEGF 反義寡核苷酸(VEGFantisense oligonucleotide)、長春地辛(vindesine)以及長春瑞賓(vinorelbine)。本發(fā)明還涵蓋了含有一種或多種癌癥治療劑(例如FLAG，CHOP)的組合物。FLAG含有氟拉達濱(fludarabine)、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP含有環(huán)磷酰胺、長春新堿、阿霉素和潑尼松(Prednisone)。對于現(xiàn)有技術(shù)中已知的所有癌癥治療劑，例如可參見最近發(fā)表的TheMerck Index and the Physician's Desk Reference。
[0107]用于聯(lián)合療法的藥物組合物可包括但不限于:抗生素(例如放線菌素D、博來霉素、光神霉素、安曲霉素)、門冬酰胺酶、桿狀菌和Guerin，白喉毒素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、抗有絲分裂劑、相思子毒素、篦麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因子、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑、抗組胺劑、抗作嘔劑等。
[0108]實際上，向需要進行治療的患者施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物可達到使另一種具有臨床顯著效果的癌癥治療劑劑量的降低。這種其他癌癥治療劑劑量減少的效果在沒有施用本發(fā)明的藥物組合物的情況下可能觀察不到。因此，本發(fā)明提供了治療腫瘤或癌癥的方法，其包括施用劑量減少的一種或多種其他癌癥治療劑。
[0109]并且，對需要的患者進行的包含本發(fā)明藥物組合物的聯(lián)合療法與標(biāo)準治療方案的持續(xù)時間或周期數(shù)目相比，可允許相對較短的治療時間。因此，本發(fā)明提供了治療腫瘤或癌癥的方法，其包括在較短持續(xù)時間和/或更少的治療周期內(nèi)施用一種或多種其他癌癥治療劑。
[0110]因此，根據(jù)本發(fā)明，含有本發(fā)明的藥物組合物和另一種癌癥治療劑的聯(lián)合療法可降低整體癌癥治療的毒性(即副作用)。例如，在輸送減少的劑量的本發(fā)明的藥物組合物和/或其他癌癥治療劑時，和/或在減少周期持續(xù)時間(即單次施用的周期或一系列的這種施用的時期)，和/或當(dāng)減少周期數(shù)目時，可觀察到與單一療法或另一種聯(lián)合療法相比降低的毒性。
[0111]因此，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其進一步含有一種或多種另外的抗癌治療劑，其可選擇的含在藥學(xué)上可接受的載體中。
[0112]本發(fā)明還提供了試劑盒，該試劑盒含有有效量的本發(fā)明的藥物組合物，其可選擇地與一種或多種其他癌癥治療劑聯(lián)合，以及如何使用其治療癌癥的說明。
[0113]如上所述，含有本發(fā)明的藥物組合物的聯(lián)合療法可使其他癌癥治療劑的施用對癌癥或腫瘤變得敏感。因此，本發(fā)明涵蓋了用于預(yù)防、治療和/或預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的聯(lián)合療法，其包括在施用劑量減少的癌癥治療劑之前、之后、或同時施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物。例如，采用本發(fā)明的藥物組合物的最初治療可增加癌癥或腫瘤對隨后的癌癥治療劑劑量的敏感性。這樣的劑量可以是與單獨施用癌癥治療劑時或在不施用本發(fā)明的藥物組合物時的標(biāo)準劑量的下限接近，或在其之下。當(dāng)同時施用時，本發(fā)明的藥物組合物可與癌癥治療劑分開施用，以及可選擇地通過不同的施用模式。
[0114]在一種替代的實施方式中，施用另外的癌癥治療劑可使得癌癥或腫瘤對本發(fā)明的藥物組合物變得敏感。在這種實施方式中，該另外的癌癥治療劑可在施用本發(fā)明的藥物組合物之前給予。
[0115]在一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含順鉬(cisplatin)，例如PLATIN0L或 PLATINOL-AQ^ristol Myers)，劑量范圍約為 5-10、11-20、21_40 或 41_75mg/m2/ 周期。
[0116]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含卡鉬(carboplatin)，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，劑量范圍約為 2-3，4-8，9-16，17-35，或 36_75mg/m2/ 周期。
[0117]在又一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide),例如 CYTOXAN (Bristol Myers Squibb),其劑量范圍約為 0.25-0.5、0.6-0.9、1_2、3_5、6-10、11-20 或 21-40mg/kg/ 周期。
[0118]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含阿糖胞苷(cytarabine),例如 CYT0SAR-U(Pharmacia & Upjohn)，其劑量范圍約為 0.5_1、2-4、5_10、11_25、26_50 或51-100mg/m2/周期。在又一種實施方式中，另外的癌癥治療劑包含阿糖胞苷脂質(zhì)體，例如DEP0CYT(Chiron Corp.)，其劑量范圍約為 5_50mg/m2/ 周期。
[0119]在又一種實施方式中，另外的癌癥治療劑包含氮烯咪胺(dacarbazine)，例如DTIC 或 DTICD0ME (Bayer Corp.)，其劑量范圍約為 15_250mg/m2/ 周期或約 0.2_2mg/kg/ 周期。
[0120]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含拓撲替康(topotecan),例如 HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，其劑量范圍約為 0.1-0.2,0.3-0.4,0.5-0.8 或0.9-1.5mg/m2/ 周期。
[0121]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含伊立替康(irinotecan),例如CAMPTOSAR (Pharmacia & Up john)，其劑量范圍約為 5-9、10-25 或 26_50mg/m2/ 周期。
[0122]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含氟拉達濱(f ludarabine)，例如FLUDARA (Berlex Laboratories)，其劑量范圍約為 2.5_5、6_10、11-15 或 16_25mg/m2/周期。
[0123]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含阿糖胞苷(Ara-C) (cytosinearabinoside (Ara-C))，其劑量范圍約為 200-2000mg/m2/ 周期、300-1000mg/m2/ 周期、400-800mg/m2/ 周期或 500-700mg/m2/ 周期。
[0124]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含多烯紫衫醇(docetaxel),例如TAXOTERE (Rhone Poulenc Rorer)，其劑量范圍約為 6-10、11-30 或 31_60mg/m2/ 周期。
[0125]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含紫杉醇(paclitaxel)，例如TAXOL(Bristol Myers Squibb)，其劑量范圍約為 10-20、21-40、41_70 或 71_135mg/kg/周期。
[0126] 在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含5-氟尿B密唳(5-fIuorouraciI),其劑量范圍約為0.5-5mg/kg/周期、l-4mg/kg/周期或2_3mg/kg/周期。
[0127]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含多柔比星(doxorubicin)，例如ADRIAMYCIN (Pharmacia & Up john)、DOXIL (Alza)、RUBEX (Bristol Myers Squibb)，其劑量范圍約為 2-4、5-8、9-15、16-30 或 31_60mg/kg/ 周期。
[0128]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含依托泊甙(etoposide)，例如VEPESID (Pharmacia & Up john)，其劑量范圍約為 3.5_7、8_15、16-25 或 26_50mg/m2/ 周期。
[0129]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含硫酸長春堿(vinblastine),例如VELBAN(Eli Lilly)，其劑量范圍約為 0.3-0.5,0.6-0.9,1-2 或 3-3.6mg/m2/ 周期。
[0130]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含硫酸長春新堿(vincristine),例如 ONCOVIN (Eli Lilly)，其劑量范圍約為 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 或 0.7mg/m2/ 周期。
[0131]在另一種實施方式中，該另外的癌癥治療劑包含甲氨蝶呤(methotrexate)，其劑量范圍約為 0.2-0.9、1-5、6-10 或 ll-20mg/m2/ 周期。
[0132]在另一種實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物與至少一種其他免疫治療劑聯(lián)合施用，那些免疫治療劑包括但不限于美羅華(rituxan)、利妥昔單抗(Rituximab)、阿侖單抗-1 (campath-1)、吉妥單抗(gemtuzumab)和曲妥珠單抗(trastuzutmab)。
[0133]在另一種實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是與一種或多種抗血管形成劑組合施用，這些抗血管形成劑包括但不限于:血管生成抑制素、沙利度胺(Thalidomide)、kringle5、人內(nèi)皮抑素(Endostatin)、Serpin (絲氨酸蛋白酶抑制劑)、抗凝血酶、纖維粘連蛋白的29kDa N-末端和40kDa C-末端蛋白質(zhì)水解片段、泌乳刺激素的16kDa蛋白質(zhì)水解片段、血小板因子-4的7.SkDa蛋白質(zhì)水解片段、對應(yīng)于血小板因子-4的13氨基酸肽(Ma1ne等人，1991，Cancer Res.51:2077-2083)、對應(yīng)于膠原質(zhì)I的片段的14-氨基酸肽(Tolsma等人，1993，J.Cell B1l.122:497-511)、對應(yīng)于凝血栓蛋白I的片段的19-氨基酸肽(Tolsma 等人，1993，J.Cell B1l.122:497-511)、對應(yīng)于 SPARC 的片段的 20-氨基酸肽(Sage等人，1995，J.Cell.B1chem.57:1329-1334)以及它們的變異體，還包括它們的藥學(xué)上可接受的鹽。
[0134]在另一種實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是與放射療法聯(lián)合施用的。療法也可包含外科手術(shù)和/或化學(xué)療法。例如，本發(fā)明的藥物組合物可與放射療法、順鉬、氟尿嘧啶(5-FU, Adrucil)、卡鉬和/或紫杉醇(Taxol)聯(lián)合施用。使用本發(fā)明的藥物組合物進行的治療可允許使用更低的放射劑量和/或更少次數(shù)的放射治療，這例如可減少嚴重的喉嚨痛的發(fā)生，這種疼痛會阻礙吞咽功能，并可能會導(dǎo)致不期望的減重或脫水。
[0135]在另一種實施方式中，藥物組合物是與一種或多種細胞因子組合施用的，這些細胞因子包括但不限于:淋巴因子、腫瘤壞死因子、與腫瘤壞死因子類似的細胞因子、淋巴毒素、干擾素、巨噬細胞炎性蛋白、粒單核細胞集落刺激因子、白細胞間介素(包括但不限于:白細胞間介素-1、白細胞間介素-2、白細胞間介素-6、白細胞間介素-12、白細胞間介素-15、白細胞間介素-18)以及它們的變異體，和包括它們的藥學(xué)上可接受的鹽。
[0136] 在又一種實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是與癌癥疫苗或生物制劑組合施用，這些癌癥疫苗或生物制劑包括但不限于:自體同源的細胞或組織、非自體同源的細胞或組織、癌胚抗原、甲胎蛋白(a-fetoprotein)、人類絨毛膜性腺激素、卡介苗(BCG)活疫苗、分枝桿菌細胞壁-DNA復(fù)合物、黑素細胞系蛋白質(zhì)以及突變的腫瘤特異性抗原。
[0137]在另一種實施方式中，藥物組合物是與荷爾蒙療法聯(lián)合施用。荷爾蒙治療劑包括但不限于:荷爾蒙促進劑、荷爾蒙拮抗劑(例如:氟他胺、他莫西芬、醋酸亮丙瑞林(柳培林(LUPRON))以及類固醇(例如:地塞米松、類維生素A、倍他米松、氫化可的松、可的松、強的松、去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素，雌激素、睪丸激素、孕酮)。
[0138]在另一種實施方式中，藥物組合物是與基因療法計劃聯(lián)合施用以治療或預(yù)防癌癥。
[0139]因此，聯(lián)合療法可增加癌癥或腫瘤對施用的本發(fā)明的藥物組合物和/或其他癌癥治療劑的敏感性。這樣，就可能實現(xiàn)較短的治療周期，從而降低毒性事件的發(fā)生。對于具體使用的癌癥治療劑而言，周期的期間可能有所不同。本發(fā)明還涵蓋了連續(xù)的或不連續(xù)的施藥，或?qū)⒚咳談┝糠殖蓴?shù)個部分進行施用。具體癌癥治療劑的適合的周期持續(xù)期間將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，而本發(fā)明涵蓋了對各種癌癥治療劑的最優(yōu)化治療計劃的持續(xù)的評估?，F(xiàn)有技術(shù)中已提供了對本領(lǐng)域技術(shù)人員的具體指導(dǎo)。如參見Therasse等人，2000, “Newguidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors.EuropeanOrganizat1n for Research and Treatment of Cancer, Nat1nal Cancer Institute ofthe United States, Nat1nal Cancer Institute of Canada，，，J Natl Cancer Inst.Feb2 ；92(3): 205-16。
[0140]本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)當(dāng)能夠以任何適合的方法進行施用，例如注射、口服、吸入、經(jīng)皮或腫瘤內(nèi)，且任何其他的癌癥治療劑也可通過相同的或不同的施用模式向患者輸送。此外，當(dāng)欲向研究對象輸送多種癌癥治療劑時，本發(fā)明的藥物組合物和一種或多種其他的癌癥治療劑可通過一種方法給藥，而其他的癌癥治療劑可通過另外的施用模式施用。
[0141]本發(fā)明還提供了試劑盒，該試劑盒含有有效量的本發(fā)明的藥物組合物，其可選擇地與一種或多種其他癌癥治療劑聯(lián)合，以及如何使用的說明。
[0142](ii)診斷方法
[0143]由于新的與癌癥相關(guān)的抗原是在癌癥細胞上表達，而在正常細胞上無顯著表達，因此對新的與癌癥相關(guān)的抗原的檢測可被用作癌癥的診斷方法。
[0144]本發(fā)明的一種實施方式是檢測或監(jiān)控患有或疑似患有癌癥的研究對象中癌癥的方法，其包括在樣品中的細胞中檢測與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體的表達，其中當(dāng)在細胞中檢測出與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體的表達時，表明存在癌癥。
[0145]在發(fā)明的一種實施方式中，提供了一種檢測研究對象中癌癥細胞的方法，該方法包括:
[0146](a)由該研究對象提供樣品；
[0147](b)檢測該樣品中的與癌癥相關(guān)的抗原的水平；以及
[0148](C)比較該樣品中的與癌癥相關(guān)的抗原的水平與對照樣品中的水平，其中與對照樣品相比，若與癌癥相關(guān)的抗原的水平增加，則表明該研究對象患有癌癥。
[0149]短語“檢測與癌癥相關(guān)的抗原的水平”包括檢測與癌癥相關(guān)的抗原的水平和檢測編碼該與癌癥相關(guān)的抗原的核酸分子的水平。下面將更詳細地討論用于檢測蛋白質(zhì)和核酸的方法的例子。
[0150]與癌癥相關(guān)的抗原優(yōu)選的含有示于SEQ ID NO: 2中的序列，更優(yōu)選地為SEQ IDNO:1中的序列。
[0151]術(shù)語“樣品”可以是任何含有希望檢測到的癌細胞的樣品，這些樣品包括但不限于:生理流體(包括血液、血清、腹水)、組織提取物、新鮮收獲的細胞以及在細胞培養(yǎng)物中培育的細胞的溶解產(chǎn)物。
[0152]術(shù)語“對照樣品”包括任何可用于建立基礎(chǔ)或正常水平的樣品，且可包括采自健康人群的組織樣品或模擬生理流體的樣品。對照樣品也可以是來自研究對象的不同時間點的樣品，例如在進行癌癥治療之前。
[0153]本發(fā)明的方法可用于診斷癌癥的階段。本發(fā)明還可用于監(jiān)控癌癥的進展以及監(jiān)控特定的治療是否有效。特別是該方法可用于證實在手術(shù)、癌癥化療、和/或放療后腫瘤組織的不存在或去除。該方法可被進一步用于監(jiān)控癌癥化療發(fā)和腫瘤的復(fù)發(fā)。
[0154]在一種實施方式中，本發(fā)明涵蓋了用于監(jiān)控研究對象中癌癥進展的方法，包括:
[0155](a)由研究對象提供樣品；
[0156](b)確定該樣品中的與癌癥相關(guān)的抗原的水平；
[0157](c)在稍后重復(fù)步驟(a)和(b)，并比較步驟(b)與步驟(C)的結(jié)果，其中在與癌癥相關(guān)的抗原表達水平上的差異指示出在研究對象中癌癥的進展。
[0158]特別是在稍后出現(xiàn)的升高水平的與癌癥相關(guān)的抗原可指示出癌癥正在發(fā)展，且治療(如果實施了的話)并不有效。相反，在稍后出現(xiàn)的降低水平的與癌癥相關(guān)的抗原可指示出癌癥正在衰退，且治療(如果實施了的話)是有效的。
[0159]許多技術(shù)可被用于檢測細胞上哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體。例如，結(jié)合蛋白，如結(jié)合到哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的抗體可用于免疫分析以檢測細胞表面哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解，許多技術(shù)都可用于檢測和/或定量哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的細胞表面表達，這些技術(shù)包括但不限于:蛋白質(zhì)印跡法法、在SDS-PAGE后進行的免疫沉淀法、免疫細胞化學(xué)法、FACS、蛋白質(zhì)陣列和類似的方法等。
[0160]檢測核酸分子的方法
[0161]在一種實施方式中，本發(fā)明的方法涉及對檢測編碼與癌癥相關(guān)的抗原的核酸分子的檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員可構(gòu)建出用于檢測樣品中編碼與癌癥相關(guān)的抗原的核酸分子的核苷酸探針。適合的探針可基于SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:25中所示的核酸序列制備。適合的探針包括基于編碼來自癌癥相關(guān)抗原區(qū)域的至少5個連續(xù)氨基酸的核酸序列的核酸分子，優(yōu)選的探針包含15-30個核苷酸。核苷酸探針可用可檢測的物質(zhì)來標(biāo)記，例如可采用提供充分信號且具有足夠半衰期的放射性標(biāo)記如32p、3h、14c和類似物等。其他可采用的可檢測物質(zhì)包括由特異性標(biāo)記的抗體識別的抗原、熒光化合物、酶、對標(biāo)記的抗原呈特異性的抗體以及發(fā)光化合物?？筛鶕?jù)雜交速度和探針結(jié)合到待檢測的核苷酸上的速度以及可用于雜交的核苷酸的量來選擇適合的探針。標(biāo)記的探針可雜交到在固體支持物上的核酸上，固體支持物例如有在 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nded.)中進行過一般描述的硝化纖維過濾器或尼龍膜。核酸探針可用于檢測基因，優(yōu)選人類細胞中的編碼與癌癥相關(guān)抗原的基因。核苷酸探針也可用于診斷涉及與癌癥相關(guān)抗原的疾患，監(jiān)控這類疾患的發(fā)展，或監(jiān)控治療。在一種實施方式中，探針被用于診斷和監(jiān)控癌癥的發(fā)展，優(yōu)選地為婦產(chǎn)科癌癥的發(fā)展。
[0162]探針可用于雜交技術(shù)以檢測編碼與癌癥相關(guān)抗原的基因。該項技術(shù)一般涉及用探針在對探針特異性地退火到核酸的互補鏈上有利的條件下，接觸和培育由研究對象或其他細胞源獲得的樣品中的核酸(例如重組DNA分子，克隆的基因)。培育之后，除去未退火的核酸分子，檢測已雜交到探針上核酸分子的存在。
[0163]對核酸分子的檢測可能會涉及用擴增的方法對特異性基因序列進行擴增，這些方法例如有聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，然后采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對擴增的分子進行分析。適合的引物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員按常規(guī)進行設(shè)計。
[0164]這里描述的雜交和擴增技術(shù)可用于分析編碼與癌癥相關(guān)的抗原的基因的定性和定量方面。例如，RNA可從已知表達與癌癥相關(guān)的抗原的基因的細胞類型和組織中分離出，并采用現(xiàn)有技術(shù)已知的雜交(如標(biāo)準的Northern分析)或PCR技術(shù)進行測試。
[0165]引物和探針可原位用于以上描述的方法中，即直接用于從活組織檢查或切除術(shù)中獲得的研究對象的組織的組織切片(固定的和/或冷凍的)。
[0166]因此，本發(fā)明提供了一種檢測研究對象中癌細胞的方法，包括:
[0167](a)由研究對象提供樣品；
[0168](b)從該樣品中提取編碼該與癌癥相關(guān)的抗原或其部分的核酸分子；
[0169](C)使用聚合酶鏈反應(yīng)擴增提取的核酸分子；
[0170](d)確定編碼該與癌癥相關(guān)的抗原的核酸分子的存在；以及
[0171]e)比較該樣品中的編碼與癌癥相關(guān)的抗原的核酸分子的水平與對照樣品中的水平，其中與對照樣品相比，若編碼與癌癥相關(guān)的抗原的核酸分子的水平增加，則表明該研究對象患有癌癥。
[0172]在優(yōu)選的實施方式中，所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO: 2，更優(yōu)選的為SEQ IDNO:1的與癌癥相關(guān)的抗原。在一【具體實施方式】中，該核酸分子含有不于SEQ ID N0:6或其診斷片段。在另一種實施方式中，該核酸分子含有示于SEQ ID NO:25(其編碼示于SEQ IDNO:2中的跨膜片段)或其診斷片段。
[0173] 這里描述的本發(fā)明的方法還可采用微陣列，如寡核苷酸陣列、cDNA陣列、染色體組DNA陣列或組織陣列進行。優(yōu)選的陣列是組織微陣列。
[0174]在一優(yōu)選的實施例中，編碼哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的RNA表達產(chǎn)品用于檢測細胞中哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解，RNA表達產(chǎn)品的檢測或定量可通過檢測編碼哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體或其片段，或那些特異性地和/或選擇性地雜交到編碼哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的mRNA或其片段上的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產(chǎn)品、合成的DNA、合成的RNA或其他天然的或改性的核苷酸的組合而實現(xiàn)。
[0175]許多方法可用于檢測和/或定量細胞中哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的RNA表達，這些方法包括RT-PCR、核酸酶保護試驗、例如核糖核酸酶保護試驗和SI核酸酶試驗，以及Northern印跡和類似方法等。
[0176]在一種【具體實施方式】中，
【發(fā)明者】們制備出了如實施例4中描述的擴增變異型和野生型scratch(SEQ ID NO:26)兩者或僅擴增變異型scratch(SEQ ID NO:27)的PCR引物。使用這種引物能夠區(qū)別出變異型和野生型scratch。
[0177]
【發(fā)明者】們還確定出野生型哺乳動物的Scratch的序列在核苷酸118處含有一KpnI限制性位點，而在與癌癥相關(guān)的變異體中不存在該限制性位點。因此，為了測試癌癥是否表達了該變異體，可在凝膠電泳之后用KpnI限制性酶消化擴增的pCR產(chǎn)物。如果測試的細胞表達了野生型的哺乳動物的Scratch，則將能檢測到67bp和93bp的兩個片段。如果細胞表達了與癌癥相關(guān)的變異體，則PCR產(chǎn)物的大小將與未消化的對照的相同。
[0178]因此，本發(fā)明提供了一種檢測或監(jiān)控患有或疑似患有癌癥的研究對象中癌細胞癌癥的方法，包括:
[0179](a)由研究對象提供樣品；
[0180](b)從該樣品中提取編碼野生型scratch或scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的核酸分子；
[0181](c)用KpnI限制性酶消化核酸分子；以及
[0182](d)確定消化的核酸分子的大小，其中未消化的核酸分子的存在指示出研究對象患有癌癥。
[0183]檢測與癌癥相關(guān)的抗原的方法
[0184]在另一種實施方式中，本發(fā)明的方法涉及對與癌癥相關(guān)的抗原的檢測。在一種實施方式中，該與癌癥相關(guān)的抗原是用特異性結(jié)合到與癌癥相關(guān)的抗原上的抗體進行檢測的。結(jié)合到與癌癥相關(guān)的抗原上的抗體可使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法進行制備。
[0185]對與癌癥相關(guān)的抗原具有特異性活性的抗體，或衍生物，如酶聯(lián)接體或標(biāo)記的衍生物，可用于檢測各種樣品(如生物材料)中與癌癥相關(guān)的抗原。它們可用作診斷或預(yù)后試劑，且它們可用于檢測與癌癥相關(guān)的抗原的蛋白質(zhì)表達水平中的異常、或結(jié)構(gòu)和/或時間的、組織的、細胞的或亞細胞位置中的異常?；铙w外免疫分析也可用于評價或監(jiān)控具體療法的有效性。本發(fā)明的抗體也可用于活體外以確定編碼經(jīng)基因改造而產(chǎn)生與癌癥相關(guān)的抗原的細胞中的與癌癥相關(guān)的抗原的基因表達的水平。
[0186]抗體可用于任何已知的依賴于與癌癥相關(guān)的抗原的抗原決定簇和抗體之間的結(jié)合相互作用的免疫分析中。這類分析的例子有放射免疫分析、酶免疫分析Uf^BELISA)、免疫熒光、免疫沉淀、乳膠粘著、紅血球凝聚和組織化學(xué)測試?？贵w可用于檢測和定量樣品中與癌癥相關(guān)的抗原，以確定其在癌癥中的角色和診斷癌癥。
[0187]特別是，本發(fā)明的抗體可用于免疫-化學(xué)分析，例如在細胞的和亞細胞的水平，以檢測與癌癥相關(guān)的抗原，將其定位于特定的細胞和組織上，以及定位于特定的亞細胞位置，以及對表達水平進行定量。
[0188]現(xiàn)有技術(shù)已知的使用光和電子顯微鏡的用于定位抗原的細胞化學(xué)技術(shù)可用于檢測與癌癥相關(guān)的抗原。一般而言，本發(fā)明的抗體可用可檢測的物質(zhì)進行標(biāo)記，且與癌癥相關(guān)的抗原可基于這種可檢測的物質(zhì)的存在而定位在組織和細胞中。可檢測的物質(zhì)的例子包括但不限于以下:放射性同位元素(例如咕、14(:、355、1251、1311)、熒光標(biāo)記(例如FITC、若丹明、鑭、磷)、發(fā)光標(biāo)記，例如發(fā)光氨；酶標(biāo)記(例如辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酯酶、乙酰膽堿脂酶)、生物素基(其可通過標(biāo)記的抗生物素蛋白如含熒光標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素或通過光學(xué)或量熱方法檢測到的酶活性而檢測到)，由第二個報告基因識別的預(yù)定的多肽表位(如亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體結(jié)合部位、金屬結(jié)合區(qū)域、表位標(biāo)簽)。在一些實施方式中，標(biāo)記是通過各種長度的間隔筆連接的以減少潛在的空間位阻?？贵w也可與電子密度物質(zhì)如鐵蛋白或膠體金偶合，這些物質(zhì)可容易地通過電子顯微鏡顯現(xiàn)出。
[0189]抗體或樣品可固定在能夠固定細胞、抗體等的載體或固體支持物上。例如，載體或固體支持物可以是硝化纖維、或玻璃、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵礦。支持材料可以具有任何可能的構(gòu)型，包括球形(如小珠)、圓柱形(如試管或孔的內(nèi)壁、或棒的外表面)、或平的(如片、測試條)。也可以采用一些間接方法，其中主要抗原-抗體反應(yīng)通過引入第二種對與癌癥相關(guān)的抗原的抗體反應(yīng)具有特異性的抗體來擴增。例如，對與癌癥相關(guān)的抗原具有特異性的抗體是兔IgG抗體，則該第二種抗體可以是用這里描述的可檢測的物質(zhì)標(biāo)記的山羊抗-兔Y-血球素。
[0190]當(dāng)使用放射性標(biāo)記作為可檢測的物質(zhì)時，與癌癥相關(guān)的抗原可以通過放射自顯照相術(shù)進行固定。放射自顯照相術(shù)的結(jié)果可以通過確定放射自顯照相術(shù)中顆粒密度來進行定量，顆粒密度的確定可通過各種光學(xué)方法，或?qū)︻w粒進行計數(shù)來進行。
[0191]標(biāo)記的抗癌癥相關(guān)的抗原的抗體可用于在研究對象進行手術(shù)，即成像時來定位腫瘤組織。通常,對于活體內(nèi)應(yīng)用而言,抗體使用放射性標(biāo)記物(例如:碘-123、碘-125、碘-131、鎵-67、锝-99和銦-111)來標(biāo)記的?？稍诮M織成像前數(shù)小時到4天的時間，將標(biāo)記的抗體制劑在適合的載體內(nèi)通過靜脈注射而向研究對象施用。在這段期間，未結(jié)合的部分從研究對象中清除，而僅有剩余的抗體是與腫瘤組織相關(guān)的抗體。通過適合的Y照相機檢測出同位素的存在。標(biāo)記的組織可用已知的標(biāo)記物關(guān)聯(lián)到研究對象的身體，以精確定位進行手術(shù)的腫瘤的位置。
[0192]因此，在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測研究對象中癌癥的方法，包括:
[0193](a)由研究對象提供樣品；
[0194](b)用結(jié)合到與癌癥相關(guān)的抗原的抗體接觸該樣品；
[0195](C)檢測該樣品中的與癌癥相關(guān)的抗原的水平；以及
[0196](d)比較該樣品中的與癌癥相關(guān)的抗原的水平與對照樣品中的水平，其中與對照樣品相比，若與癌癥相關(guān)的抗原的水平增加，則表明該研究對象患有癌癥。
[0197](iii)治療方法
[0198] 如上所述，與癌癥相關(guān)的新抗原存在于癌細胞上，但不顯著存在于正常細胞上。因此，與癌癥相關(guān)的新抗原可用于預(yù)防和治療癌癥的治療方法中。此外，與癌癥相關(guān)的新抗原或其片段可用于引起活體內(nèi)例如疫苗中或活體外的免疫應(yīng)答。
[0199]本發(fā)明的一種實施方式是本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或其片段在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一種實施方式是本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或其片段在治療或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。本發(fā)明的進一步實施方式是本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或其片段在制備引起免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一種實施方式是本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或其片段在引起免疫應(yīng)答的中的應(yīng)用。
[0200]本發(fā)明還包括本發(fā)明的分離的核酸序列在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還進一步包括本發(fā)明的分離的核酸序列在治療或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明的分離的核酸序列或其片段在制備引起免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還進一步包括本發(fā)明的分離的核酸序列在引起免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。
[0201]本發(fā)明的進一步的實施方式是本發(fā)明的重組表達載體在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一種實施方式是本發(fā)明的重組表達載體在治療或預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還包括本發(fā)明的重組表達載體在制備在研究對象中引起免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一種實施方式是本發(fā)明的重組表達載體在研究對象中引起免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
[0202]本發(fā)明的另一種實施方式是治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括向有需要的研究對象或他的細胞施用有效量的本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或其片段。此外，本發(fā)明包括治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括向有需要的研究對象或他的細胞施用有效量的本發(fā)明的分離的核酸序列。此外，本發(fā)明還包括治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括向有需要的研究對象或他的細胞施用有效量的本發(fā)明的重組表達載體。
[0203]本發(fā)明的另一種實施方式是誘導(dǎo)研究對象對本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的方法，其包括向有需要的研究對象或他的細胞施用有效量的本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或其片段。此外，本發(fā)明還包括在研究對象中引起對本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，其包括向有需要的研究對象或他的細胞施用有效量的本發(fā)明的分離的核酸序列。此外，本發(fā)明還包括在研究對象中引起對本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，其包括向有需要的研究對象或他的細胞施用有效量的本發(fā)明的重組表達載體。
[0204]上述方法包括活體內(nèi)或活體外施用本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)。對于活體外應(yīng)用而言，蛋白質(zhì)可被用于刺激由患者獲得的淋巴細胞，這些淋巴細胞然后被重新輸入到研究對象體內(nèi)以增加對表達了與癌癥相關(guān)的抗原的癌細胞的免疫應(yīng)答。
[0205]本發(fā)明的進一方面是一種通過調(diào)節(jié)在癌細胞上或在癌細胞內(nèi)的哺乳動物Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的活性或表達來治療或預(yù)防研究對象中癌癥的方法。
[0206]在本發(fā)明的一種實施方式中，治療或預(yù)防研究對象中癌癥的方法包括阻礙或降低哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的功能。在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白被用于阻礙或降低哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的功能。
[0207]在本發(fā)明的另一種實施方式中，哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的功能是通過減少或阻礙哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的功能在細胞中的表達而得到了阻礙或減少。
[0208]可采用標(biāo)準技術(shù)來阻礙或降低哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的功能在細胞中的表達，所使用的技術(shù)包括與哺乳動物的Scratch基因的與癌癥相關(guān)的變異體具有反應(yīng)性的反義的、三重螺旋的或核糖酶分子。
[0209]例如，可采用標(biāo)準技術(shù)來產(chǎn)生反義核酸分子，即與編碼目的多肽的有義核酸分子互補的分子，例如與編碼雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補。這樣,反義核酸即可以氫鍵連接到正義核酸上。反義核酸可以互補到整條編碼鏈上，或僅其一部分上，例如所有的或部分的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(或開放讀碼框)。反義核酸分子可與編碼目的多肽的核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區(qū)的全部或部分形成反義。非編碼區(qū)(“5’和3’未翻譯區(qū)”)為編碼區(qū)的5’和3’邊側(cè)序列，且未被翻譯成為氨基酸。
[0210]反義寡核苷酸可以是長度如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個或更長的核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)按照現(xiàn)有技術(shù)已知的步驟進行構(gòu)建。例如，反義核酸(如反義寡核苷酸)可使用天然核苷酸或各類為增加分子的生物穩(wěn)定性或增加在反義和正義核酸之間形成的雙鏈的物理穩(wěn)定性而設(shè)計的改性核苷酸來化學(xué)合成，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于產(chǎn)生反義核酸的改性的核苷酸的例子包括:5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二羥尿嘧啶、β -D-半乳糖Q核苷、次黃嘌呤核苷、Ν6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-Ν6-異戍烯腺嘌呤、尿喃唳-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿喃唳、Q核苷、2_巰基嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(&叩3)?以及2，6-二氨基嘌呤?；蛘撸戳x核酸可用核酸已被反義方向亞克隆進的表達載體生物產(chǎn)生，(即從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA與目的靶核酸呈反義取向)。
[0211]向研究對象施用的或在原位生成的反義核酸分子與編碼興趣多肽的細胞的mRNA進行雜交或與其結(jié)合，從而抑制了表達，例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而達成。雜交可以通過傳統(tǒng)的核苷酸互補性以形成穩(wěn)定的雙鏈，或在反義核酸分子結(jié)合到DNA雙鏈的情況下，通過在雙螺旋的大溝內(nèi)的特異性相互作用形成。本發(fā)明的反義核酸分子的施用途徑例如包括直接注射到組織部位?；蛘撸戳x核酸分子可經(jīng)改性而靶向選擇的細胞，然后再進行全身性施用。例如，對于全身性施用，反義分子可經(jīng)改性，從而它們能特異性地結(jié)合到在選擇細胞如T細胞或腦細胞上表達的受體或抗原,例如通過將反義核酸分子連接至結(jié)合在細胞表面受體或抗原上的肽或抗體上。反義核酸分子也可使用載體，例如下面描述的基因療法載體來向細胞輸送。為獲得足夠的反義分子的細胞內(nèi)濃度，其中反義核酸分子在強PoiII或Pol III啟動子控制下的載體構(gòu)建是優(yōu)選的。
[0212]目的反義核酸分子可以是α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與互補的RNA形成特異的雙鏈雜種，其中與常見的α-單元不同的是，這兩條鏈相互平行(Gautier等人，1987，Nucleic Acids Res.15:6625-6641)。反義核酸分子也可含有2’ -ο-甲基核糖核苷酸(Inoue 等人，1987，Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合的 RNA-DNA 類似物(Inoue 等人，1987，F(xiàn)EBS Lett.215:327-330)。
[0213] 核酶是具有核糖核酸酶活性的起催化作用的RNA分子，這種核糖核酸酶活性能夠切斷具有與他們互補區(qū)域的單鏈的核酸，例如mRNA，且也可使用標(biāo)準的技術(shù)來生成。因此，核酶(例如銀頭狀的核酶(描述于 Haseloff and Gerlach, 1988，Nature334:585-591)可用于催化裂解mRNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制由mRNA編碼的蛋白質(zhì)的翻譯。對編碼目的多肽的核酸分子具有特異性的核酶可基于編碼與哺乳動物的Scratch基因的與癌癥相關(guān)的變異體的核苷酸序列而設(shè)計。例如，在Cech等人的美國專利號4，987，071和Cech等人的美國專利號5，116，742中，構(gòu)建出四膜蟲L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與待切斷的核苷酸序列互補?？蛇x地，也可使用編碼目的多肽的mRNA從RNA分子庫中篩選具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如參見Bartel and Szostak, 1993, Science261:1411-1418。
[0214]使用熟知的技術(shù)也可產(chǎn)生出三重螺旋結(jié)構(gòu)。例如，目的多肽的表達可通過靶向與編碼該多肽的調(diào)節(jié)區(qū)的基因(如啟動子和/增強子或)的互補的核苷酸序列所抑制，形成三重螺旋結(jié)構(gòu)以防止基因在目標(biāo)細胞上的轉(zhuǎn)錄。一般描述參見Helene, 1991，AnticancerDrug Des.6 (6): 569-84 ；Helene, 1992, Ann.N.Y.Acad.Sc1.660:27-36 ；和 Maher, 1992, B1assaysl4(12):807-15。
[0215]在各種實施方式中，可在堿基部分，糖部分或磷酸酯骨架對核酸組合物進行改性，以改進分子的如穩(wěn)定性、雜交性或溶解性。例如，核酸的脫氧核醣磷酸酯骨架可經(jīng)改性而產(chǎn)生妝核酸(見 Hyrup 等人，1996，B10rganic & Medicinal Chemistry4 (I): 5-23)。這里使用的術(shù)語“肽核酸”或“PNAs”是指核酸類似物，如DNA類似物，其中的脫氧核醣磷酸酯骨架被假肽骨架替代，且只保留了四種天然核堿基。已發(fā)現(xiàn)PNA的中性骨架允許DNA在低離子強度條件下對RNA的特異性雜交。PNA寡聚體的合成可采用標(biāo)準的固相肽合成方法進行，例如在 Hyrup 等人,1996,見上；Perry_0’ Keefe 等人,1996, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:14670-675中描述的方法。
[0216]PNA例如可通過將親脂性的或其它的輔助基團連接到PNA上，通過形成PNA-DNA嵌合體，或通過使用脂質(zhì)體或其它現(xiàn)有技術(shù)已知的藥物輸送技術(shù)改性而增強它們的穩(wěn)定性或細胞的吸收性。例如，可產(chǎn)生出集中了 PNA和DNA兩者優(yōu)點的PNA-DNA嵌合體。這樣的嵌合體允許DNA識別酶，例如RNAse H和DNA聚合酶，與DNA部分相互作用，同時在PNA部分提供高結(jié)合親和力和特異性。PNA-DNA嵌合體可使用根據(jù)堿基堆積、核堿基之間的鍵數(shù)目以及取向而選擇的適當(dāng)長度的連接物連接(Hyrup，1996，見上)。PNA-DNA嵌合體的合成可如Hyrup, 1996，見上，和Finn等人所述的進行，1996，Nucleic AcidsRes.24(17):3357-63中所描述那樣進行。例如，可使用標(biāo)準的亞磷酰胺偶聯(lián)化學(xué)和改性的核類似物來在支持物上合成DNA鏈。化合物例如5’ -(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’ -脫氧_胸苷亞磷酰胺可用作PNA和DNA的5’端之間的連接(Mag等人，1989，Nucleic AcidsRes.17:5973-88)。然后，PNA單體可逐步偶聯(lián)以產(chǎn)生具有5’ PNA片段和3’ DNA片段的嵌合分子(Finn 等人，1996，Nucleic Acids Res.24 (17): 3357—63)。或者，可使用具有 5’PNA片段和3’ DNA片段的嵌合分子來合成嵌合分子(Petersen等人，1995，B10rganic Med.Chem.Lett.5:1119-1124)。
[0217]在其他的實施方式中，寡核苷酸可包括其它的附加基團，例如肽(例如用于在活體內(nèi)祀向宿主細胞受體)，或輔助穿過細胞膜(參見如Letsinger等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:6553-6556 ；Lemaitre 等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:648-652 ；Internat1nal Publicat1n N0.W088/09810)或血腦屏障(參見如 Internat1nalPublicat1n N0.W089/10134)的試劑。此外，寡核苷酸可用雜交_觸發(fā)的裂解劑(參見如van der Krol 等人，1988，B1/Techniques6:958-976)或嵌入劑(參見如 Zon, 1988, Pharm.Res.5:539-549)修飾。為此，寡核苷酸可偶聯(lián)到另一個分子上，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、運輸劑、雜交觸發(fā)的裂解劑等。
[0218] 本發(fā)明的另一方面是一種識別能夠調(diào)節(jié)哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的表達或活性的化合物的方法，其可用于預(yù)防或治療癌癥。在本發(fā)明的一種實施方式中，該用于識別能夠預(yù)防或治療癌癥的化合物的方法包括以下步驟:
[0219](a)將表達哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的細胞與測試化合物接觸；以及
[0220](b)確定哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的表達或功能；以及
[0221](c)將哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的表達或功能與對照比較，其中若與對照比較哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體的表達或功能降低則指示出該化合物可用于預(yù)防或治療癌癥。
[0222](D)結(jié)合蛋白質(zhì)
[0223]本發(fā)明的另一方面是結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選為一結(jié)合到本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)上的抗體或抗體片段。這種結(jié)合蛋白質(zhì)通常可被稱作“本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)”，或優(yōu)選被稱作“本發(fā)明的抗體或抗體片段”。
[0224]在一種實施方式中，本發(fā)明包括對哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體特異的結(jié)合蛋白質(zhì)。在一種優(yōu)選的實施方式中，該與癌癥相關(guān)的哺乳動物的Scratch的變異體包含由SEQ ID NO:1定義的氨基酸序列或其變異體，或由SEQ ID N0:2定義的氨基酸序列或其變異體。在另一種實施方式中，該結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合到分離的蛋白質(zhì)上，這種分離的蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其變異體或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其變異體。
[0225]在一些實施方式中，抗體或抗體片段包含所有或部分的重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。并且，抗體或抗體片段可包含所有或部分的K輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)。
[0226]本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)可被用于制備單克隆或多克隆抗體?？刹捎脗鹘y(tǒng)的方法來制備抗體。例如參考Goding, J.W.，Monoclonal Antibodies !Principles and Practice, 2ndEd.，Academic Press, London, 1986。
[0227]也可通過對在具有細胞表面組成的細胞中表達的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達庫進行篩選來產(chǎn)生對具體抗原或分子如癌細胞上的抗原或分子具有特異性的抗體，或抗體片段。例如，可使用噬菌體表達庫來在細節(jié)中表達完整的Fab片段，VH區(qū)和FV區(qū)。(例如參見 Ward 等人，Nature341:544-546 (1989) ；Huse 等人，Science246:1275-1281 (1989)；和 McCafferty 等人，Nature348:552-554 (1990))。
[0228]本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選為抗體和抗體片段，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩(wěn)定劑的組合物。
[0229]此外，本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)可用于診斷癌癥。
[0230]在一種優(yōu)選的實施方式中，該結(jié)合蛋白質(zhì)是結(jié)合到在癌細胞表面表達的哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體上的抗體或抗體片段，其優(yōu)選為含有氨基酸序列SEQ IDN0S:1或2中任何一者的分離的蛋白質(zhì)。此外，可對癌細胞進行評估以確定它們對本發(fā)明治療方法的易感性，例如可獲得癌細胞的樣品并確定樣品結(jié)合到本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選為抗體或抗體片段上的能力。
[0231]因此，本發(fā)明包括診斷方法、試劑和試劑盒，其本身可在本發(fā)明的治療方法進行之前、進行其間或進行之后使用，以確定是否有癌細胞表達了抗原并能結(jié)合到本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選為抗體和抗體片段。
[0232]在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測或監(jiān)控研究對象中癌癥的方法，其包括以下步驟:
[0233](I)將取自所述研究對象的測試樣品與特異性結(jié)合到癌細胞抗原的結(jié)合蛋白接觸，以產(chǎn)生結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物；
[0234](2)測量測試樣品中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的量；以及
[0235](3)比較測試樣品和對照中結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的量。
[0236]在一種實施方式中，抗原是哺乳動物的Scratch的與癌癥相關(guān)的變異體，優(yōu)選為含有氨基酸序列SEQ ID N0S: 1-2中任何一種的分離的蛋白質(zhì)。
[0237]本發(fā)明進一步包括用于檢測或監(jiān)控癌癥的試劑盒，其含有本發(fā)明的結(jié)合到癌細胞上的抗原上的任何一種結(jié)合蛋白質(zhì)以及對其的使用說明。
[0238]當(dāng)用于診斷應(yīng)用中時，本發(fā)明的結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選為抗體或抗體片段，可用可檢測的標(biāo)記物如不透射線的或放射性同位素；例如3h、14c、32p、35s、1231、1251、131i ;突光(熒光團)或化學(xué)發(fā)光(發(fā)色團)化合物，例如異硫氰酸熒光素、若丹明或蟲螢光素、酶如堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根過氧物酶、顯象劑或金屬離子進行標(biāo)記。如上所描述的，將標(biāo)記物連接到結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，如抗體或抗體片段上的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。
[0239]本發(fā)明的另一方面是一種檢測或監(jiān)控研究對象中癌癥的方法，其包括以下步驟:
[0240](I)在取自所述研究對象的樣品中測量本發(fā)明的抗體的量；以及
[0241](2)比較測試樣品和對照中本發(fā)明的抗體的量。
[0242]在一種實施方式中，本發(fā)明的抗體的量是通過測量測試樣品中發(fā)明的抗體的量來測量的，例如通過ELISA進行。在另一種實施方式中，發(fā)明的抗體的量是通過測量測試樣品中編碼本發(fā)明的抗體的核酸的表達水平來測量的，例如通過RT-PCR進行。
[0243]Ε)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的制備
[0244]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到可通過多種方式中的任何一種來自被本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如與癌癥相關(guān)的新抗原，結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選為抗體和抗體片段，但最優(yōu)選的是使用重組方法來制備。
[0245]因此，本發(fā)明的核酸分子可通過已知的方式插入適合的表達載體中，以確保本發(fā)明蛋白質(zhì)的良好表達?？赡艿谋磉_載體包括但不限于:粘粒、質(zhì)?；蚋男缘牟《?例如有復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，只要該載體與使用的宿主細胞相容即可。該表達載體“適合于宿主細胞的轉(zhuǎn)化”，這意味著該表達載體含有本發(fā)明的核酸分子和基于用于表達的宿主細胞選擇的調(diào)節(jié)序列，該序列有效地連接至核酸分子。有效地連接意味著核酸分子連接至調(diào)節(jié)序列的方式使得該核酸得以表達。
[0246] 因此，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的重組表達載體，其含有本發(fā)明的核酸分子，或其片段，以及用于轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的蛋白質(zhì)序列所必需的調(diào)節(jié)序列。
[0247]適合的調(diào)節(jié)序列可源自各種來源，其包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物或昆蟲基因(例如參見在 Goeddel, Gene Express1n Technology:Methods inEnzymologyl85, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述的調(diào)節(jié)序列)。如以下討論的那樣，對適合的調(diào)節(jié)序列的選擇取決于宿主細胞，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地完成。這種調(diào)節(jié)序列的例子包括:轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結(jié)合序列、核醣體結(jié)合序列包括翻譯開始信號。此外，根據(jù)選擇的宿主細胞和采用的載體，其他的序列如復(fù)制原點、其他的DNA限制位點、增強子以及賦予轉(zhuǎn)錄可誘導(dǎo)性的序列均可插入到表達載體中。
[0248]本發(fā)明的重組表達載體也可含有可選擇的標(biāo)記物基因，以便于具有本發(fā)明重組分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞的選擇。可選擇的標(biāo)記物基因的例子是編碼蛋白質(zhì)的基因，如對某些藥物產(chǎn)生抗性的G418和潮霉素、編碼β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒光蟲熒光素酶或免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白的Fe部分，優(yōu)選為IgG的基因。對可選擇的標(biāo)記物基因的轉(zhuǎn)錄是通過可選擇的標(biāo)記物蛋白質(zhì)如β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或熒光蟲熒光素酶的濃度變化來監(jiān)控的。如果可選擇的標(biāo)記物基因編碼的蛋白質(zhì)具有耐抗生素性，如耐新霉素性，則可用G418來選擇轉(zhuǎn)化體細胞。已插入可選擇的標(biāo)記物基因中的細胞將存活，而其他的細胞將死亡。這就使得本發(fā)明的重組表達載體的可視化和檢測，特別是確定突變對表達和表型的影響成為可能?？梢哉J為可選擇的標(biāo)記物可從目的核酸中引入到分離的載體上。
[0249]該重組表達載體也可含有編碼融合部分的基因，該融合部分提供了重組蛋白質(zhì)的增強的表達、重組蛋白質(zhì)的增強的溶解性，并且通過作為在親和性純化過程中作為配體而輔助目標(biāo)重組蛋白質(zhì)的純化。例如，可在目標(biāo)重組蛋白質(zhì)中插入蛋白質(zhì)水解裂解位點，以使重組蛋白質(zhì)在融合蛋白質(zhì)純化后從融合部分分離。典型的融合表達載體包括pGEX(Amrad Corp., Melbourne, Australia) > pMal (New England B1labs, Beverly, MA)和pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)，它們分別將谷胱甘肽S_轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)A融合到重組蛋白質(zhì)上。
[0250]重組表達載體可被引入到宿主細胞中而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細胞。術(shù)語“用……進行轉(zhuǎn)化”、“用……進行轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意在包括將核酸(如載體)通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何技術(shù)引入細胞。這里使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的宿主細胞”也意在包括能夠進行糖基化的細胞，其用本發(fā)明的重組表達載體進行了轉(zhuǎn)化。原核細胞可用核酸通過如電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而進行轉(zhuǎn)化。例如，可通過傳統(tǒng)的技術(shù)如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、電穿孔或微注射將核酸引入到哺乳動物細胞中。適用于轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法可在Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3rd Edit1n, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001),以及其他實驗室教科書中找到。
[0251]適合的宿主細胞包括大量不同的各種真核宿主細胞和原核細胞。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。其他適合的宿主細胞可在Goeddel,Gene Express1n Technology:Methods in Enzymologyl85, Academic Press, SanDiego, CA(1990)中找到。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在原核細胞，如大腸桿菌(Zhang等人，Science303(5656):371-3(2004))中表達。另外，可使用基于假單胞菌的表達系統(tǒng)例如熒光假單胞菌(美國專利申請公布號US2005/0186666，Schneider, Jane C等人)。
[0252] 適用于本發(fā)明的酵母和真菌宿主細胞包括但不限于:釀酒酵母、畢赤酵母(Pichia)屬或克魯維酵母(Kluyveromyces)屬以及曲霉菌類的各個種。用于在酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達的載體包括pYepSecl (BaIdar1.等人，EmboJ.6:229-234(1987))、pMFa (Kurjan and Herskowitz,Cell30:933-943 (1982))、pJRY88(Schultz 等人，Gene54:113-123(1987))和 pYES2(Invitrogen Corporat1n, SanDiego, CA)。酵母和真菌轉(zhuǎn)化的實驗方案為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知(參見Hinnen等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1929 (1978) ；Itoh 等人，J.Bacter1logyl53:163 (1983)和 Cullen等人，(B1lTechnology5:369 (1987))。
[0253]適用于進行本發(fā)明的哺乳動物細胞包括:C0S(e.g.，ATCC N0.CRL1650orl651)、BHK (e.g.ATCC N0.CRL6281)、CHO (ATCC N0.CCL61)、HeLa (e.g.，ATCC N0.CCL2)、293 (ATCCN0.1573)和NS-1細胞。用于在哺乳動物細胞中直接表達的適合的表達載體通常包括啟動子(例如來自病毒材料如多瘤病毒、腺病毒2、細胞巨化病毒和猿病毒40)，以及其他的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed，B.，Nature329:840 (1987))和 pMT2PC (Kaufman 等人，EMBO J.6:187-195 (1987))。
[0254]根據(jù)這里提供的教導(dǎo)，也可以輕松地實現(xiàn)啟動子、終止子和用于將適合類型的表達載體引入植物、鳥類和昆蟲細胞內(nèi)的方法。例如，在一種實施方式中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可由植物細胞表達(參見Sinkar等人，J.B1sci (Bangalore) 11:47-58 (1987),該文綜述了發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)載體的使用；另見Zambryski等人，Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow(eds.), Vol.VI, pp.253-278, Plenum Press, New York(1984),該文描述了將表達載體用于植物細胞，包括 PAPS2O22、PAPS2023 和 PAPS20:M 等)。
[0255]適合于進行本發(fā)明的昆蟲細胞包括來自家蠶(Bombyx)、金翅夜蛾(Trichoplusia)或斜紋夜蛾(斜紋夜蛾)的細胞和細胞系?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(SF9細胞)中進行蛋白表達的桿狀病毒(Baculovirus)載體包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell B1l.3:2156-2165(1983))和 pVL 系列(Luckow, V.A.,和 Summers, Μ.D.，Virologyl70:31-39 (1989))。一些適合本發(fā)明重組蛋白質(zhì)表達的桿狀病毒-昆蟲細胞表達體系在PCT/US/02442 中進行了描述。
[0256]另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可在非人類的轉(zhuǎn)基因動物如小鼠、大鼠、兔、羊和豬(Hammer 等人，Nature315:680-683 (1985) ;Palmiter 等人，Science222:809-814 (1983)；Brinster 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:4438-4442(1985) ；Palmiter 和 BrinsterCell41:343-345 (1985)和美國專利號4，736，866))中進行表達。
[0257]本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可通過化學(xué)合成法采用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域熟知的技術(shù)如固相合成(Merrifield, J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154 (1964) ;Frische 等人，J.Pept.Sc1.2(4): 212-22 (1996))或在均勻溶液中合成(Houbenweyl, Methods of OrganicChemistry, ed.E.ffansch, Vol.151 and II, Thieme, Stuttgart (1987))來制備。
[0258]包括與其他分子，如蛋白質(zhì)綴合的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N-端或C-端融合蛋白質(zhì)，可經(jīng)重組技術(shù)通過融合制備。所得的融合蛋白質(zhì)含有本發(fā)明的融合到這里描述的選擇的蛋白質(zhì)或標(biāo)記物蛋白質(zhì)上的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)也可通過已知技術(shù)結(jié)合到其他蛋白質(zhì)上。例如，可使用W090/10457中描述的異種雙功能含硫醇的連接劑N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫-并酸酯)或N-琥珀酰亞胺基-5硫乙酸酯來偶聯(lián)蛋白質(zhì)?？捎糜谥苽淙诤系鞍踪|(zhì)或偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)的例子包括細胞結(jié)合蛋白質(zhì)如免疫球蛋白、荷爾蒙、生長因子、外源凝集素、胰島素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、內(nèi)啡肽、鐵傳遞蛋白、鈴蟾肽、去唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、紅血球凝聚素(HA)以及截取的myc。
[0259]因此，本發(fā)明提供了一種重組表達載體，其含有編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)如本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)的核酸序列。另外，本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，其含有本發(fā)明的重組表達載體。
[0260]下面使用非限制性的實施例對本發(fā)明進行描述:
[0261]實施例
[0262]實施例1:與癌癥相關(guān)的Scratch的分離和確定
[0263]實驗設(shè)計
[0264]使用了黑素瘤細胞系(A-375)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U118iK^PU87MG)、乳癌細胞系(MDA-MB435S)、胰腺細胞系(PANC-1)和T-細胞系(Daudi)來進行研究(表1)。這些細胞系是基于流式細胞儀得出的腫瘤細胞系測量結(jié)果選擇的。
[0265]腫瘤細胞系的生長和維持
[0266]用于研究的細胞系購自ATCC并根據(jù)ATCC推薦的指南進行培養(yǎng)。收集90%匯合以及生存力>90%的細胞。
[0267]結(jié)合到VB3-011的抗原的初步表征
[0268]由設(shè)計成評價點印跡法的基于凝膠的方法進行檢測的實驗獲得了初步表征數(shù)據(jù)；并從進行實驗來確定與抗原相關(guān)的抗原決定部位的性質(zhì)。
[0269]由這些實驗獲得的數(shù)據(jù)將VB3-011抗原歸類為帶有聚糖改性的“不能印跡的”抗原，即涉及到在抗原上結(jié)合至VB3-011的表位被糖基化。
[0270]VB3_011Ag富集和純化
[0271]由印跡性研究獲得的初步數(shù)據(jù)給出了基于外源凝集素的純化方法是對VB3-011的最佳抗原制備方法。大量的實驗揭露了聚糖改性涉及CS(軟骨素硫酸鹽)的可溶形式；這些(CSB和CSE)中的兩種具有有限的組織分布。這樣，聚糖改性可歸因于CSA，而透明質(zhì)酸對其的影響較小。
[0272]軟骨素硫酸鹽A(CSA)是由含D-半乳糖胺和D-葡萄糖醛酸的線性重復(fù)單元構(gòu)成。軟骨素硫酸鹽A的基本單元中的半乳糖胺的氨基被乙酰化，產(chǎn)生N-乙?；?半乳糖胺；N-乙?；?半乳糖胺4-位的硫酸基被酯化(圖1A) (Sugahara K等人，1988.J.B1l.Chem.Vol.263:10168-10174 ；Sugahara K等人，1991.Eur.J.B1chem.Vol.202:805-811 ；Prydz K和 Dalen KT.2000.J.Cell Sc1.Vol.113:193-205)。當(dāng)在第二條碳鏈的 C2 和第一條碳鏈的C6的這些線性重復(fù)單元在支化點處發(fā)生交聯(lián)(α 2-6)，這樣出現(xiàn)代表多于一條CSA線性鏈的聚糖單一單元時，除了硫酸鹽化作用外，它類似于HA識別的聚糖和Neu5Ac ( α 2 - 6)Gal (β I — 4)葡糖醛酸(圖1B)。
[0273] 當(dāng)兩個或多個CSA分子交聯(lián)在一起時，其類似于由紅血球凝聚素(HA)識別的聚糖-Neu5Ac ( α 2 — 6)Gal ( β I — 4)葡糖醒酸，Azumi等人.，(1991)顯示出從海鞘類的血細胞分離的紅血球凝聚素的活性，真海鞘(Halocynthia roretzi)被肝磷脂、軟骨素硫酸鹽和脂聚糖(LPS)抑制，但不被單糖和二糖如N-乙酰基-半乳糖胺、半乳糖和蜜二糖抑制。紅血球凝聚素顯示出對肝磷脂、軟骨素硫酸鹽和LPS的結(jié)合能力，這可分別由肝磷脂-瓊脂糖凝膠色譜和離心分離實驗得到證實(Ajit Varki等人，eds.1999.Essentials of Glycob1logy)。同樣地，分支桿菌的紅血球凝聚素顯示出對硫酸乙酰肝素的結(jié)合，和流感嗜血菌的紅血球凝聚素結(jié)合到CSA具有額外的α 2-6鍵(Azumi K等人，Α1991.Dev.Comp.1mmunol.Vol.15 (1-2): 9-16 ;Menozzi FD 等人，11996.J.Exp.Med.,Vol.184(3):993-1001)。硫酸乙酰肝素和軟骨素硫酸鹽A在C5差向異構(gòu)上不同。因此，如下生成了能夠進行基于外源凝集素的純化的新的試劑。重組HA通過與二甲基環(huán)已酮(DMP)偶聯(lián)而固定到抗-HA的抗體上，這樣當(dāng)被用作IP試劑時，HA識別細胞表面上與抗原相關(guān)的CSA。細胞膜制備物用固定的HA進行親和性純化，洗出液進行SDS-PAGE和WB分析，然后用VB3-011抗體進行探測。
[0274]基于外源凝集素的純化
[0275]在室溫下的章動器上使特異結(jié)合到聚糖_Neu5Ac ( α 2 — 6) Gal (I — 4) Glc上的重組HA分子結(jié)合到抗-HA抗體上2小時，然后將HA-抗-HA復(fù)合物結(jié)合到蛋白質(zhì)-G-瓊脂糖上。此后進行離心分離步驟以除去未結(jié)合的部分。然后用已知能使鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)的二甲基環(huán)已酮(DMP)交聯(lián)該固定的復(fù)合物。通過簡單的離心分離步驟除去過剩的或未用到的交聯(lián)劑和未結(jié)合的材料。交聯(lián)步驟中可能產(chǎn)生的副產(chǎn)物非特異性氨基，其用三乙醇胺在室溫下中和2小時。這樣，用PBS充分清洗并存儲在2-8°C的含0.05% NaN3的PBS中，就生成了基于外源凝集素的試劑。除了 HA-試劑外、Con-A-瓊脂糖和WGA-瓊脂糖也被用作親和性純化試劑來檢測更佳的抗原回收。
[0276]在基于外源凝集素的純化中，最少用到500 μ g細胞膜蛋白質(zhì)。單獨使用蛋白質(zhì)-G瓊脂糖凝膠的預(yù)清潔步驟是在加入試劑之前的抗原純化中的第一步。混合物中總共用到了15-20 μ L的試劑作為沉淀劑。采用模擬生理環(huán)境的緩沖條件，將該抗原-外源凝集素混合物在4°C章動過夜。應(yīng)當(dāng)小心確保在每一步抗原分離步驟中均使用了蛋白酶抑制劑。
[0277]離心分離抗原-外源凝集素復(fù)合物，用RIP-A溶解緩沖液洗，并用pH2.5的0.2M糖膠洗提。將代表未結(jié)合部分的上清液儲存以測試那些未在親和性純化中分離的蛋白質(zhì)?；谕庠茨氐募兓窃趦煞N神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U118MG和U87MG): —黑素瘤細胞系(A-375)、一上皮細胞系(MDA-MB-435S)和兩種陰性細胞系(Panc-1 JPDaudi)中進行的。基于凝膠的分析和蛋白質(zhì)印跡
[0278]ID-PAGE:將純化的蛋白質(zhì)置于樣品制備的還原條件，然后用SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡進行分析。當(dāng)使用還原條件時，分離的抗原用含1%的β_巰基乙醇的樣品緩沖液在65°C處理15分鐘。所得點印跡用VB3-011和相應(yīng)的偶聯(lián)到HRP上的次級抗體進行探測，并通過化學(xué)發(fā)光顯示出純化的蛋白質(zhì)。
[0279]2D-PAGE:純化的蛋白質(zhì)用二維凝膠電泳進行分離，以解開在ID-PAGE分析中可能出現(xiàn)的任何蛋白質(zhì)堆積效果。二維凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)在第一維中的等電點(Pl)以及在第二維中的分子量來解開蛋白質(zhì)。將上述解開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上過夜，并在ID-PAGE的情況下進行處理。蛋白質(zhì)印跡用VB3-011進行探測，反應(yīng)的蛋白質(zhì)通過化學(xué)發(fā)光而顯示。
[0280]肽提取和抗原ID
[0281]由凝膠內(nèi)核溶液內(nèi)胰蛋白酶消化物種提取肽:胰蛋白酶消化是采用順序等級的胰蛋白酶在20小時的肽提取過程中進行的，最終提取到的肽在QSTARPulsar-1 (ES1-qTOF-MS/MS)上進行分析，該設(shè)備配備了工作流速為20_50nL/min的納米源。肽被離子化且檢測到的分子為帶雙重、三重或四重電荷，這些分子隨后根據(jù)它們相應(yīng)的質(zhì)量進行細分。在可能的條件下還對確認的蛋白質(zhì)進行了從頭測序(De-novosequencing) 0肽從陽性和陰性細胞系中都進行提取，以確保它是正確的抗原。由質(zhì)譜獲取的肽的質(zhì)量被直接用于識別抗原，其依據(jù)是由蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫所獲得的MOWSE得分，該數(shù)據(jù)庫可通過MOWSE搜索引擎進入。由凝膠切片和溶液內(nèi)(U118MG，U87MG，A-375，435S)兩者提取肽，并對其進行MS分析。
[0282]結(jié)果
[0283]HA試劑固定
[0284]重組HA分子不是抗體，故不會作為固定用伴侶而直接結(jié)合到蛋白質(zhì)-G-瓊脂糖凝膠上。為了使這種分子在抗原純化過程中發(fā)揮作用，將HA結(jié)合到能夠特異性地結(jié)合到HA的抗-HA抗體上，分子用蛋白質(zhì)-G-瓊脂糖凝膠以連續(xù)的方式固定。這不僅會固定戶和無，并且還會鎖住如圖2所示的任何可能由抗-HA引起的非特異性作用。該固定的HA-抗-HA復(fù)合物隨后用二甲基環(huán)已酮這一將各種試劑保持接近的交聯(lián)試劑穩(wěn)定。最終復(fù)合物在過程中生成多個反應(yīng)性胺，而非HA分子上的反應(yīng)性結(jié)合位點。這些反應(yīng)性基團主要用IM的三乙醇胺來阻滯，從而保證HA分子上反應(yīng)性位點的最大暴露。
[0285]外源凝集素-純化
[0286]所有純化反應(yīng)均用預(yù)清除的(pre-cleared)蛋白質(zhì)進行。使用更長的培育時間以最小化非特異性和增強同類抗體-抗原復(fù)合物的穩(wěn)定性。在該項研究中用到了 6種細胞系(A-375、U118MG、U87MG、MDA-MB-435S、Panc-1 和 Daudi)。在對 SDS-PAGE 上分離的抗原進行解開之前，采用了還原條件來制備樣品。用VB3-011來探測蛋白質(zhì)印跡，以確保純化的抗原是VB3-011的同類結(jié)合伴侶。
[0287]lD-PAGE/ffestern 分析
[0288]當(dāng)使用HA試劑時，在抗原-陽性細胞系(A-375)中還原條件下(圖3A)在ID-PAGE~50kDa分離后，僅檢測到一個特異性帶，而這個帶在陰性細胞系(Panc-1)子中不存在。觀察到了與Con-A和WGA凝集素的非特異性相互作用，這表明在VB3-011抗原上存在的聚糖可被HA識別。當(dāng)用HA試劑純化時(圖3B)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U118MG和U87MG)也顯示出~50kDa的單帶。當(dāng)樣品在SDS-PAGE分離前置于室溫I小時時，在抗原-陽性細胞系(A-375、U118MG和U87MG)中觀察到~36kDa的強帶和50kDa的弱帶(圖4)。
[0289]2D-PAGE 分析
[0290]為了確定等電點(pi)和評價在ID-PAGE分析中蛋白質(zhì)堆積的可能性，由HA純化的抗原在二維聚酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)上進行分離，其中第一維中的分離是基于pl，而第二維中的分離是基于分子量。然后將凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，并進行標(biāo)準的蛋白質(zhì)印跡步驟。由于2D凝膠對蛋白質(zhì)的檢測要求量約比ID凝膠要求的高4倍，從4個獨立反應(yīng)中純化的抗原被匯集到并一起用于2D-PAGE分析。同時處理兩組凝膠以用于蛋白質(zhì)印跡分析，以確保在庫馬西染色凝膠上檢測到的蛋白質(zhì)與在蛋白質(zhì)印跡中觀察到的是一樣的。用VB3-011探測2D的蛋白質(zhì)印跡，并用ECL(化學(xué)發(fā)光)進行檢測。如圖5所示，在~36kDa/Pl = 9.7+0.2檢測到一個單點。
[0291]肽的提取和蛋白質(zhì)的分析
[0292]A-375、U87MG和U118MG膜被用于純化特異性結(jié)合到VB3-011上的抗原。如圖3A和3B所示，在所有的三種細胞系中均觀察到了~50kDa的帶。從庫馬西染色凝膠中切除蛋白質(zhì)帶，用于凝膠內(nèi)消化以提取肽進行MS分析。
[0293]ID-凝膠帶和2D-點中的蛋白質(zhì)用胰骯酶進行消化，而將他們從凝膠中釋放出，并在反相LC-MS/MS系統(tǒng)中進行分析。使用生物資訊分析工具由數(shù)據(jù)庫分析找出蛋白質(zhì)。原始數(shù)據(jù)包括那些在TOF-MS譜圖、MS/MS破裂數(shù)據(jù)中所列出的肽和一列提出的含雜質(zhì)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與分離的蛋白質(zhì)的Pl或分子量不符。為了進行分析，MS/MS譜圖被直接提交至Ij Mascot 搜索弓 I擎在 www.Matrixscience.com。
[0294] 質(zhì)譜分析
[0295]肽的分析按兩種方式進行:
[0296]?所有回收的和重建成它們的正確質(zhì)量的肽均直接用于肽質(zhì)譜的指紋步驟以獲得蛋白質(zhì)的ID。
[0297]?選擇充裕的和離子化良好的肽作進一步MS/MS離子碎片化，其中‘y’和‘b’離子被用于推導(dǎo)它們的主要結(jié)構(gòu)。然后搜索這些序列的，找出蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的同種，得到蛋白質(zhì)至ID。
[0298]肽經(jīng)離子化在LC-MS/MS系統(tǒng)中以帶兩重、三重或四重電荷的分子檢出，這與在物質(zhì)輔助離子化如MALDI中以帶單一電荷檢測出的不同。帶不同電荷的肽隨后在質(zhì)譜步驟中被凈化到它們相應(yīng)的質(zhì)量。然后用基于mascot搜索引擎的基質(zhì)科學(xué)對這些肽的質(zhì)量進行直接分析，以得到抗原的ID。根據(jù)由蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫所獲得的MOWSE得分，直接使用由質(zhì)譜獲取的肽的質(zhì)量來確定抗原，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫可通過搜索引擎如MASCOT、SEQUEST和Prospector進入。對所有的蛋白質(zhì)身份均使用和選擇QSTAR-pulsar_I,這是由于它包括與MASCOT相匹配的來自Pepsea的最新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫添加。
[0299]2D印跡分析
[0300]由2D-凝膠切除的蛋白質(zhì)印跡被確認為Scratch。pi和分子量完全與哺乳動物的Scratch相符?；厥盏胶?5個匹配的肽的總和為37%序列覆蓋，其中每個肽顯示出與原始蛋白質(zhì)的100%的同源性。
[0301]由神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑素瘤細胞系純化得到的50kDa帶的分析
[0302]由所有三種細胞系(U87MG、U118MG和A375)的質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)均表明哺乳動物的Scratch作為抗原而結(jié)合到VB3-011上。在所有篩選的細胞系中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U87MG和U118MG)顯示出最高的得分同一性。黑素瘤細胞系A(chǔ)-375也顯示出抗原的過度表達。除了上述細胞系外，上皮細胞系如MDA-MB-435S、PC_3、A-549和CFPAC-1也以相同的方式被篩選，除了顯示出存在Scratch的截取的版本即17.823kDa蛋白質(zhì)gi 115928387的MDA-MB-435S外，其余的都與原始Scratch分子的序列158-366具有100%的同源性。參見圖7(SEQ ID N0:4)。由這些細胞系獲得的細胞膜制備物被用于使用HA-試劑進行的對VB3-011抗原的親和性純化。其余的上皮細胞系未顯示出可檢測的蛋白質(zhì)。
[0303]在手工模式和IDA兩種模式下獲得的TOF-MS掃描，以回收具有意義ID的最多數(shù)目的肽。見圖8-10。
[0304] 回收的肽的清單和它們在哺乳動物的Scratch序列上的定位在圖11 (SEQ IDNO:1)和表2(SEQ ID N0S:2和7_24)中給出。通過從頭測序獲得了所有存在的肽。
[0305]肽2402.1206 和 2134.9614 的 MS/MS 碎片化
[0306]一安裝在納米源上不連續(xù)的納米噴霧頭被用于此用途。碰撞能量為48V以及氣幕和CAD氣分別維持在25和6，和使樣品循環(huán)1.667分鐘(100個周期)以獲得穩(wěn)定的質(zhì)譜離子碎片。兩種肽(2402.978172 - 802.00000，3+ ；2134.985448 - 1068.500000，2+)的 MS/MS碎片化得到了圖14和15中示出的碎片離子。對應(yīng)于肽質(zhì)量為2402.97812的肽‘PELATAAGGYINGDAAVSEGYAADAF’ (SEQ ID NO:7) 100%地定位到 Scratch 序列上，而對應(yīng)于肽質(zhì)量為 2134.985448 的肽 RFLAAFLAAAGPFGFALGPSSV(SEQ ID NO:2)顯示出與邊側(cè)序列 100%的同源性，但與中間的序列不同，這表明確定出了一種新的序列。這種序列的存在僅解釋了蛋白質(zhì)上可存在的跨膜區(qū)域。數(shù)據(jù)庫中可獲得的哺乳動物的Scratch序列是一種假設(shè)翻譯的結(jié)果，而在序列中并不存在任何跨膜區(qū)?；謴?fù)的蛋白質(zhì)序列顯示出與數(shù)據(jù)庫中可獲得的哺乳動物的Scratch蛋白質(zhì)67%的同源性，表明由于存在跨膜區(qū)而存在于細胞表面。由光譜獲得的其他的肽顯然與哺乳動物的Scratch中的序列匹配，因此被算在主要吻合之內(nèi)。離子碎片化數(shù)據(jù)進一步證實了作為VB3-011的同源抗原的Scratch的新形式的身份。
[0307]圖12和13確認哺乳動物的Scratch為抗原。
[0308]討論
[0309]使用Hybridomics? 和 ImmunoMine?Viventia 的專有平臺技術(shù)(參見W097/044461)，從分離自診斷患有II級星細胞瘤的患者的外周血淋巴細胞(PBL)生成的VB3-011,其為一種IgG MAb。該抗體對其他細胞系的宿主顯示出活性，這些細胞系各自代表不同的癌癥適應(yīng)癥。盡管對多種腫瘤細胞類型顯示出活性，VB3-011僅限于結(jié)合到正常組織上。VB3-011抗原被歸類為具有聚糖改性的“不能印跡的”抗原，這是由于CSA的原因。。
[0310]由于CSA分子的特征在于是(1-4) GlcNAc/葡糖醛酸結(jié)構(gòu)，因此它們類似由紅血球凝聚素(HA)識別的外源凝集素-NeU5AC(a 2 — 6)Gal(i3 I — 4)葡糖醛酸。一種用重組HA生成的能夠使基于外源凝集素的純化得以進行的新的試劑被固定到抗-HA抗體上作為純化試劑。細胞膜制備物用固定的HA進行親和性純化，洗出液進行SDS-PAGE和WB分析，然后用VB3-011抗體進行探測。VB3-011在ID-PAGE上探測出~50kDa的蛋白質(zhì)，其進一步在2D-PAGE分析中解開成~36kDa的帶。ID和2D印跡的LC-MS/MS分析確認了哺乳動物的Scratch是分子量為36kDa的抗原(1D-PAGE的WB分析觀察到~50kDa的)，因此將剩余的歸結(jié)于聚糖的存在，4-硫酸鹽化的，Neu5Ac(a2 —6)Gal(i3 1 —4)葡糖醛酸。在2D-PAGE上探測到的36kDa的印跡符合哺乳動物的Scratch的分子量和等電點[(pl)，1.e.,9.7±0.2]特征。
[0311]由MS/MS碎片化分析進行的從頭測序恢復(fù)的蛋白質(zhì)序列獲得了 17個肽中16個的67%的覆蓋，顯示出與數(shù)據(jù)庫中的哺乳動物的Scratch序列(gi 113775236)的100%的同源性。對應(yīng)于肽質(zhì)量 2134.985448 的肽 RFLAAFLAAAGPFGFALGPSSV (SEQ ID NO: 2)顯示出與邊側(cè)序列100%的同源性，但與中間的序列不同，這表明確定出了一種新的序列。這種序列的存在僅解釋了蛋白質(zhì)上可存在的跨膜區(qū)，并將Scratch置于細胞表面上而不是細胞溶質(zhì)中。這是對哺乳動物的Scratch作為細胞表面的腫瘤抗原的首次報道。
[0312] 實施例2 =Scratch的與癌癥相關(guān)的表汰
[0313]使用HD福爾馬林固定的TMA’ s對顯示出對哺乳動物的Scratch具有特異性的抗體進行腫瘤特異性測試。表3中為正常組織，表4為對腫瘤特異的細胞膜結(jié)合。在正常組織的細胞膜上沒有探測到Scratch抗原。然而在各類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了強的陽性細胞膜著色。
[0314]實施例3:作為癌癥診斷的Scratch的定位
[0315]Scratch蛋白質(zhì)的異常定位作為癌癥的指示:如Nakakura等人，2001的描述，野生型Scratch蛋白質(zhì)在細胞核內(nèi)具有有限的表達模式。然而，本
【發(fā)明者】們已在細胞膜上和細胞質(zhì)內(nèi)建立了在腫瘤組織類型和癌細胞類型中的表達。使用現(xiàn)有技術(shù)已知的技術(shù)如:流式細胞術(shù)、免疫組織化學(xué)和細胞膜部分的蛋白質(zhì)印跡法，可在癌細胞的細胞膜上和細胞質(zhì)內(nèi)建立起Scratch蛋白質(zhì)和其變異體的異常表達。這種在位置上的改變可用作癌癥的診斷指
/Jn ο
[0316]變異體Scratch蛋白質(zhì)的細胞膜表達已由流式細胞術(shù)和細胞膜部分的蛋白質(zhì)印跡法從如U-87Mg、A375、MDA-MB-435S和U118-MG的癌細胞類型中得到建立。這示于表1和圖3，4和15中。
[0317]實施例4:變異mRNA的的探測作為癌癥的指示
[0318]用于靈敏探測含跨膜區(qū)域的哺乳動物的Scratch的變異體mRNA的RT-PCR法:從不同類型的腫瘤細胞中分離出信使RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo dT引物合成第一條互補DNA(cDNA)。接著利用以下引物通過PCRjf cDNA用于檢測野生型Scratch的mRNA和可能的變異體，具體地跨膜突變體的表達:
[0319]5’弓丨物1:用于Wt和變異體(對應(yīng)于核苷酸51-82)
[0320]5，-GCC GAC CTG GAG AGC GCC TAC GGA CGC GCC(SEQ ID NO:26)
[0321]5’引物2:用于貫穿細胞膜變異體(對應(yīng)于核苷酸76-105)
[0322]5，-CGC GCC CGC TTXl TTX2 GCX3 GCX3 TTXl TTX2 GCX3 (SEQ ID NO:27)
[0323]其中Xl是T或C;X2是A或G;以及X3是A、G、C或T
[0324]3’引物:(對應(yīng)于核苷酸183-210)
[0325]5’ -TGC GTA CAT GGG CTC CGG CGA CGG CCC(SEQ ID NO:28)
[0326]PCR反應(yīng)包括50 μ L的反應(yīng)體積，其中含有:
[0327]

【權(quán)利要求】
1.分離的抗體或抗體片段，其結(jié)合包含SEQID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的抗體片段，其中所述抗體片段選自Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚體、微抗體(minibody)、雙價抗體(diabody)和它們的多聚體以及雙特異性的抗體片段組成的組。
3.權(quán)利要求1的分離的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段連接到不透射線的或放射性同位素、酶、熒光團、發(fā)色團、顯象劑或金屬離子。
4.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-3任一項所述的分離的抗體或抗體片段和藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩(wěn)定劑。
5.診斷癌癥的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-3任一項的分離的抗體或抗體片段和其診斷癌癥的使用說明。
6.改性的bouganin與特異性識別腫瘤細胞表面上的哺乳動物的Scratch蛋白質(zhì)的抗體偶聯(lián)得到的免疫偶聯(lián)物VB6-011，其中哺乳動物的Scratch蛋白質(zhì)由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。
7.一種組合物，其包含權(quán)利要求6的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩(wěn)定劑。
8.權(quán)利要求6的免疫偶聯(lián)物或權(quán)利要求7的組合物在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。
【文檔編號】G01N33/68GK104072611SQ201410210188
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月21日
【發(fā)明者】弗蘭西娜·C·查海爾, 格倫·麥克唐納, 吉恩尼克·西茲爾尤 申請人:維文蒂阿生物公司