一種藥物靶標(biāo)捕獲方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種藥物靶標(biāo)的捕獲方法，包括如下步驟：（1）取原料：取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方；（2）連接：將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價(jià)連接得化合物；（3）轉(zhuǎn)運(yùn)：用基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法，將步驟（2）得到的標(biāo)簽化合物分別轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)；（4）靶標(biāo)捕獲：將步驟（3）的細(xì)胞破碎，用固定化的互補(bǔ)DNA或RNA捕獲步驟（1）中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟（1）中的親和材料一方，將靶標(biāo)富集；（5）靶標(biāo)識別；（6）靶標(biāo)確認(rèn)，即可。本發(fā)明方法可以將透膜性差的化合物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)與靶標(biāo)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)更接近真實(shí)生理環(huán)境的靶標(biāo)識別，為藥物的作用機(jī)理提供更確鑿的證據(jù)。
【專利說明】一種藥物朝標(biāo)捕獲方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物靶標(biāo)的捕獲方法。

【背景技術(shù)】
[0002]選擇確定新穎有效的藥物靶標(biāo)是新藥開發(fā)的首要任務(wù)。藥物作用靶標(biāo)的確定，有助于更好的了解藥物在體內(nèi)的功能及作用機(jī)理，在對藥物定向合成、療效、給藥方式、藥物代謝及安全性評價(jià)方面都起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)有的方法在對藥物靶標(biāo)的捕獲方法大體可分為兩種:一是從細(xì)胞表型或者功能的變化來判斷，如生物芯片和基于酵母雙雜交或三雜交的捕獲技術(shù)，但是細(xì)胞內(nèi)信號通路錯(cuò)綜復(fù)雜，不同的信號分子可調(diào)節(jié)相同的細(xì)胞功能，同一信號分子在不同的信號通路中也可行使不同的作用，因此依據(jù)細(xì)胞表型或功能的變化不能明確判定細(xì)胞內(nèi)的藥物靶標(biāo)；另外一類捕獲方法是依據(jù)藥物與藥物靶標(biāo)的親和性，在細(xì)胞裂解液中用已知藥物捕獲潛在的藥物靶標(biāo)，但細(xì)胞內(nèi)不同的蛋白存在于不同的細(xì)胞器中，這些細(xì)胞器之間彼此相隔成為獨(dú)立的小室，細(xì)胞在裂解過程中將細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白混合在一起，這樣在加入藥物后，可能正常生理狀態(tài)下藥物不會作用的靶蛋白在全細(xì)胞裂解的時(shí)候會相互作用，引起假陽性從而對藥物靶標(biāo)的捕獲造成干擾。大部分藥物需要穿過細(xì)胞膜才能進(jìn)入組織細(xì)胞發(fā)揮其作用，而細(xì)胞膜這一天然屏障卻使得許多具有很好體外生物活性的分子(如極性比較高的分子)包括藥物不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以至于無法發(fā)揮其應(yīng)有的作用，從而限制了藥物的應(yīng)用。
[0003]為了解決現(xiàn)有藥物靶標(biāo)捕獲方法存在的問題，我們設(shè)計(jì)了一種新的藥物靶標(biāo)捕獲方法靶標(biāo)，即把化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方進(jìn)行共價(jià)連接，再通過不損傷細(xì)胞的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行藥物靶標(biāo)的捕獲，然后對捕獲的靶標(biāo)進(jìn)行識別和驗(yàn)證。其優(yōu)勢在于靶標(biāo)捕獲的環(huán)境是在細(xì)胞內(nèi):相對于傳統(tǒng)的先裂解細(xì)胞再捕獲靶標(biāo)的方法，本發(fā)明的化合物與靶標(biāo)結(jié)合的過程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部，接近于實(shí)際的生理狀態(tài)，發(fā)生結(jié)合時(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白能夠保持原有的構(gòu)象，因此能夠更好的模擬體內(nèi)的藥物作用過程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種藥物靶標(biāo)捕獲方法。
[0005]本發(fā)明藥物靶標(biāo)捕獲方法，包括如下步驟:
[0006](I)取原料:取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方；
[0007](2)將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價(jià)連接，得如圖1所示的標(biāo)簽化合物；
[0008](3)轉(zhuǎn)運(yùn):用特定的基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法，將步驟(2)得到的標(biāo)簽化合物分別轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)；
[0009](4)靶標(biāo)捕獲:將步驟(3)的細(xì)胞破碎，用固定化的互補(bǔ)DNA或RNA捕獲步驟(I)中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟(I)中的親和材料一方，從而通過共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽化合物與靶標(biāo)的親和力將靶標(biāo)富集。
[0010](5)靶標(biāo)識別；將富集的靶標(biāo)從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學(xué)的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標(biāo)。
[0011](6)靶標(biāo)確認(rèn)，即可。
[0012]步驟⑴中所述化合物，是藥物本身或者其成分。
[0013]步驟(2)中所述標(biāo)簽化合物是指在連接了帶生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標(biāo)記的DNA或RNA的化合物。
[0014]步驟(5)所述靶標(biāo)識別是將富集的靶標(biāo)從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學(xué)的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標(biāo)。
[0015]步驟(6)所述靶標(biāo)確認(rèn)是按優(yōu)先級表達(dá)或購買(5)中識別的靶標(biāo)，并逐一通過化合物與這些靶標(biāo)的相互作用比較，最終達(dá)到化合物靶標(biāo)的確認(rèn)。
[0016]步驟(I)中，所述化合物的分子量為100?4000Da。
[0017]步驟(I)中，所述化合物為用于步驟(2)中共價(jià)連接的、經(jīng)過化學(xué)修飾并具有與靶標(biāo)化合物相似生物活性的化合物。
[0018]步驟(I)所述的DNA或RNA為在所述范圍的任意序列并具有步驟⑵中用于與化合物共價(jià)連接的官能團(tuán)。
[0019]步驟(I)中，所述DNA或RNA的長度不小于5個(gè)堿基對或堿基。
[0020]步驟(I)中,所述的標(biāo)記為生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標(biāo)記。
[0021]步驟(I)所述其它親和材料的一方為任意無明顯細(xì)胞毒性的、具有與步驟(2)中化合物共價(jià)連接的特異性親和材料對的一方。
[0022]步驟⑵所述的標(biāo)簽化合物為具有與待識別靶標(biāo)化合物相似活性的化合物。步驟
(3)中，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)的方法是不造成明顯細(xì)胞損傷的所有轉(zhuǎn)運(yùn)方法。
[0023]步驟(3)中，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法是陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法轉(zhuǎn)染法、納米顆粒轉(zhuǎn)染法或電穿孔轉(zhuǎn)染法以及其他能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)手段。
[0024]所述“基因轉(zhuǎn)運(yùn)”是指使用物理、化學(xué)或者生物方法將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的過程。
[0025]所述“特異性親和材料”是指能夠相互作用并且特異性結(jié)合的一對分子，例如:互補(bǔ)的核酸片段、酶與底物，酶與抑制劑，酶與輔酶，激素與細(xì)胞受體，維生素與結(jié)合蛋白，抗體與抗原。
[0026]步驟(I)中，所述的DNA或RNA為是隨機(jī)的雙鏈序列時(shí)，步驟⑷中用于捕獲的互補(bǔ)的DNA或RNA是能夠與隨機(jī)的雙鏈序列中的一條鏈互補(bǔ)的單鏈序列。在捕獲時(shí)，需要先對隨機(jī)的雙鏈序列進(jìn)行解鏈。
[0027]步驟(6)中，所述的相互作用為靶標(biāo)與未經(jīng)修飾的化合物的親和性。
[0028]步驟￠)中，所述優(yōu)先級是指從差異蛋白中排除細(xì)胞骨架蛋白后，將潛在的靶標(biāo)蛋白根據(jù)(相對)豐度進(jìn)行優(yōu)先級排序。
[0029]本發(fā)明方法可以將透膜性差的化合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而在細(xì)胞內(nèi)與靶標(biāo)結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)更接近真實(shí)生理環(huán)境的靶標(biāo)識別，為化合物對疾病的作用機(jī)理提供更為確鑿的證據(jù)。此外，該發(fā)明技術(shù)新穎、方法簡單、速度快、成本低，應(yīng)用前景非常良好。
[0030]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0031]以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1標(biāo)簽化合物分子的結(jié)構(gòu)通式
[0033]圖2化合物1-3的1H NMR譜圖
[0034]圖3化合物1-5的1H NMR譜圖
[0035]圖4標(biāo)簽化合物I的HPLC純度分析
[0036]圖5標(biāo)簽化合物I的質(zhì)譜分析
[0037]圖6激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)簽化合物I在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為FITC標(biāo)記的標(biāo)簽化合物I
[0038]圖7Lanel:生物素聯(lián)合對照化合物2直接從細(xì)胞裂解液中捕獲蛋白；lane2_3:全細(xì)胞裂解液；Lane4:蛋白分子量標(biāo)尺；Lane5:將標(biāo)簽化合物I轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)捕獲革巴蛋白后，用Oligo (dT)磁珠聯(lián)合標(biāo)簽化合物I從細(xì)胞裂解液中捕獲的蛋白
[0039]圖8差異蛋白對比以及潛在靶標(biāo)識別
[0040]圖9未經(jīng)修飾的化合物對PTPlB的IC50值測定
[0041]圖10激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)簽化合物3在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為FITC標(biāo)記的標(biāo)簽化合物3
[0042]圖11激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)簽化合物4在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為FITC標(biāo)記的標(biāo)簽化合物4

【具體實(shí)施方式】
[0043]實(shí)施例1
[0044]1.標(biāo)簽化合物合成
[0045]1.1化合物連接位點(diǎn)選擇:根據(jù)化合物的構(gòu)效關(guān)系，確定不影響化合物活性的反應(yīng)位點(diǎn)；
[0046]1.2化合物修飾:用雙官能團(tuán)試劑對化合物進(jìn)行修飾，其中未反應(yīng)的官能團(tuán)應(yīng)與用于標(biāo)簽化合物的反應(yīng)兼容；
[0047]1.3DNA或RNA或其它特異親和材料的一方的修飾:用雙官能團(tuán)試劑進(jìn)行修飾；
[0048]1.4標(biāo)簽化合物合成:將修飾的化合物與修飾的DNA或RNA或其它特異親和材料的一方進(jìn)行共價(jià)鍵合。
[0049]2.標(biāo)簽化合物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞
[0050]選擇適合化合物轉(zhuǎn)導(dǎo)的、不造成明顯細(xì)胞損傷的基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法，包括陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法轉(zhuǎn)染法、納米顆粒轉(zhuǎn)染法或電穿孔轉(zhuǎn)染法以及其他能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)手段，將標(biāo)簽化合物有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。
[0051]3.靶標(biāo)捕獲
[0052]3.1室溫融解RIPA裂解緩沖液，加入蛋白酶抑制劑，置于冰上待用。
[0053]3.2用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，留下細(xì)胞沉淀備用。
[0054]3.3每20 μ L細(xì)胞沉淀加入200 μ L添加了蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液。
[0055]3.4冰浴反應(yīng)30分鐘。
[0056]3.540C 14000g 離心 10 分鐘。
[0057]3.6立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞質(zhì)蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢訽70°C凍存。
[0058]3.7根據(jù)裂解液體積，加入含兩倍裂解液體積結(jié)合緩沖液的磁珠或固定化的其它高親和材料，孵育20分鐘；
[0059]3.8磁鐵吸附磁珠或?qū)⒐潭ɑ钠渌哂H和材料過濾，并用20mMTris-HCl (pH8.0)洗滌三次；
[0060]3.9加入少量如上20mM Tris-HCl緩沖液，80度加熱3分鐘，然后快速吸取上清，樣品進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE展開后銀染；
[0061]4.靶標(biāo)識別
[0062]4.1將蛋白條帶與空白對照提交進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定，獲得與化合物結(jié)合蛋白的詳細(xì)信息。
[0063]4.2比對經(jīng)親和富集的蛋白與空白對照的差異，確定潛在的化合物靶標(biāo)。
[0064]5.革巴標(biāo)確認(rèn)
[0065]5.1按優(yōu)先級表達(dá)或購買4.2中識別的潛在化合物靶標(biāo)。
[0066]5.2用化合物對潛在的靶標(biāo)進(jìn)行逐一親和性實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行對比后，最終確認(rèn)化合物靶標(biāo)。
[0067]下面用實(shí)驗(yàn)例的方式驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0068]實(shí)驗(yàn)例I標(biāo)簽化合物I的合成
[0069]1、實(shí)驗(yàn)材料和試劑
[0070]化合物1-1根據(jù)參考文獻(xiàn)的方法(D.P.Wilson et al，J.Med.Chem.2007，50，4681-4698)在本公司合成；5’ -氨基、3’ -熒光素修飾的多聚腺苷酸(5，-(CH2) 12-A19-3，-FITC)由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(Invitrogen TradingShanghai C0.，Ltd)定制合成；其余化學(xué)合成使用的試劑分別從Aldrich或TCI購買而得。
[0071]2、標(biāo)簽化合物I的合成
[0072]標(biāo)簽化合物I的合成路線如下:
[0073]

【權(quán)利要求】
1.一種藥物靶標(biāo)捕獲方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取原料:取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方； (2)連接:將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價(jià)連接得化合物； (3)轉(zhuǎn)運(yùn):用基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法，將步驟(2)得到的標(biāo)簽化合物分別轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)； (4)靶標(biāo)捕獲:將步驟(3)的細(xì)胞破碎，用固定化的互補(bǔ)DNA或RNA捕獲步驟⑴中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟(I)中的親和材料一方，將靶標(biāo)富集; (5)靶標(biāo)識別； (6)靶標(biāo)確認(rèn)，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟(5)所述靶標(biāo)識別是將富集的靶標(biāo)從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學(xué)的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標(biāo)； 步驟(6)所述靶標(biāo)確認(rèn)是按優(yōu)先級表達(dá)或購買(5)中識別的靶標(biāo)，并逐一通過化合物與這些靶標(biāo)的相互作用比較，最終達(dá)到化合物靶標(biāo)的確認(rèn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述化合物的分子量為100 ?4000Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述化合物為用于步驟(2)中共價(jià)連接的、經(jīng)過化學(xué)修飾并具有與靶標(biāo)化合物相似生物活性的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的DNA或RNA為在所述范圍的任意序列并具有步驟(2)中用于與化合物共價(jià)連接的官能團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟⑴中，所述DNA或RNA的長度不小于5個(gè)堿基對或堿基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述DNA或RNA標(biāo)記有生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述其它親和材料的一方為任意無明顯細(xì)胞毒性的、具有與步驟(2)中化合物共價(jià)連接的特異性親和材料對的一方。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的標(biāo)簽化合物為具有與待識別靶標(biāo)化合物相似活性的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)的方法是不造成明顯細(xì)胞損傷的所有轉(zhuǎn)運(yùn)方法。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法是陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法轉(zhuǎn)染法、納米顆粒轉(zhuǎn)染法或電穿孔轉(zhuǎn)染法以及其它能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)手段。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(6)中，所述的相互作用為靶標(biāo)與未經(jīng)修飾的化合物的親和性。
【文檔編號】G01N27/62GK104181221SQ201410214864
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】李進(jìn), 楊本艷姿, 竇登峰, 葛嘯虎, 宋宏梅, 萬金橋, 張艷, 胡曉, 王星, 馮靜超, 鐘國慶 申請人:成都先導(dǎo)藥物開發(fā)有限公司