一種親和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸適體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種親和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸適體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的核酸適體，是如下(a)或(b)：(a)序列表的序列2所示的單鏈DNA；(b)含有(a)所述核酸適體的單鏈DNA。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，也可以檢測(cè)溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，將有利于丙型肝炎血清學(xué)診斷和血液篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲核心蛋白進(jìn)行丙型肝炎檢測(cè)，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—種親和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸適體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種親和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸適體及其應(yīng)用，具體涉及一種親和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸適體及其在輔助鑒定丙肝患者中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種傳染性疾病，可以通過(guò)血液或血制品感染。目前全世界有近2億人感染HCV，我國(guó)約有4000萬(wàn)至5000萬(wàn)人感染HCV，僅次于乙型肝炎攜帶者數(shù)量。由于丙肝是RNA病毒引起的，目前世界范圍內(nèi)尚未開(kāi)發(fā)出有效的HCV疫苗。丙肝只有早發(fā)現(xiàn)、早治療，才能減輕病毒對(duì)肝細(xì)胞的破壞。因此，探索、開(kāi)發(fā)新型的HCV早期檢測(cè)方法具有非常重要的意義。
[0003]判斷是否感染丙肝的唯一辦法是做丙肝血清檢測(cè)。目前丙型病毒性肝炎的血清學(xué)診斷方法包括檢測(cè)抗HCV抗體和HCV RNA?？笻CV抗體一般出現(xiàn)在感染HCV12周后，并且有相當(dāng)一部分病人體內(nèi)無(wú)抗HCV抗體，不利于對(duì)HCV的早期診斷。HCV RNA多出現(xiàn)于病毒感染I周后，但臨床檢測(cè)易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。因此這些診斷方法或多或少的存在窗口期檢測(cè)效果不理想、檢測(cè) 技術(shù)操作復(fù)雜、儀器昂貴、大批量篩查能力不足等局限性，離早期診斷與臨床血液或血制品篩查的要求還有相當(dāng)差距。
[0004]已知HCV基因組編碼約3100個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，該蛋白在機(jī)體與病毒蛋白酶作用下可分解為核心蛋白(core)、El結(jié)構(gòu)蛋白、E2結(jié)構(gòu)蛋白及p7非結(jié)構(gòu)蛋白、NS2非結(jié)構(gòu)蛋白、NS3非結(jié)構(gòu)蛋白、NS4A非結(jié)構(gòu)蛋白、NS4B非結(jié)構(gòu)蛋白、NS5A非結(jié)構(gòu)蛋白、NS5B非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV core蛋白出現(xiàn)于HCV感染I周后，可作為HCV早期診斷及臨床篩查指標(biāo)，有望實(shí)現(xiàn)窗口期檢測(cè)。
[0005]在國(guó)際上美國(guó)ORTHO公司于2000年推出了第四代HCV-ELISA試劑盒就是基于HCVcore蛋白的檢測(cè)。在國(guó)內(nèi)，2005年湖南景達(dá)生物工程有限公司也生產(chǎn)了類似的檢測(cè)HCV病毒試劑盒。盡管這些試劑盒能夠檢測(cè)HCV抗原，但是因?yàn)檫@些試劑盒均采用雙抗體夾心酶聯(lián)法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，所以需要進(jìn)行大量單克隆抗體的制備。然而單克隆抗體的制備過(guò)程復(fù)雜，價(jià)格昂貴，保存條件苛刻。這使得檢測(cè)HCV病毒的成本較高，檢測(cè)靈敏度也受到嚴(yán)重的影響。
[0006]核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫(kù)中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識(shí)別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識(shí)別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如分子量小、能批量生產(chǎn)、不易失活、無(wú)免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動(dòng)力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會(huì)存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測(cè)、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種親和丙型病毒性肝炎核心蛋白的核酸適體及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供的核酸適體，是如下(a)或(b):
[0009](a)序列表的序列2所示的單鏈DNA ；
[0010](b)含有(a)所述核酸適體的單鏈DNA。
[0011]所述(b)中的核酸適體具體可為序列表的序列I所示的單鏈DNA。
[0012]所述核酸適體與丙型肝炎病毒核心蛋白具有較好的親和能力。
[0013]還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0014]所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種:
[0015]a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0016]b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。 [0017]c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0018]d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0019]e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0020]固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板(如96孔板)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？刹捎妹嘎?lián)放大法檢測(cè)待測(cè)樣本中的丙型肝炎病毒核心蛋白，從而實(shí)現(xiàn)臨床中丙型肝炎病毒的檢測(cè)。
[0021]所述核酸適體可用于制備輔助檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白的試劑盒；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。
[0022]所述核酸適體可用于制備輔助檢測(cè)丙肝患者的試劑盒。
[0023]本發(fā)明還保護(hù)一種輔助檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白的試劑盒，包括所述核酸適體；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。所述試劑盒還可包括包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板(如96孔板)。所述包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板具體可為湖南景達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)的具有肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的96孔板。通過(guò)包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板和核酸適體可以檢測(cè)待測(cè)樣本中的丙型肝炎病毒核心蛋白。所述待測(cè)樣本具體可為血清。
[0024]本發(fā)明還保護(hù)一種輔助檢測(cè)丙肝患者的試劑盒，包括所述核酸適體。所述試劑盒還可包括包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板(如96孔板)。所述包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板具體可為湖南景達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)的具有肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的96孔板。丙肝目前尚沒(méi)有疫苗預(yù)防，因此早期檢測(cè)就顯得相當(dāng)重要。發(fā)展在“窗口期”內(nèi)查出丙型肝炎病毒是目前國(guó)際研究和臨床的熱點(diǎn)問(wèn)題。利用本發(fā)明的核酸適體，可以在丙型肝炎病毒感染I周后，通過(guò)檢測(cè)丙型肝炎病毒核心抗原而不是抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)丙型肝炎病毒的檢測(cè)。本發(fā)明的核酸適體將有利發(fā)展丙肝檢測(cè)的新方法。
[0025]本發(fā)明還保護(hù)固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒可以輔助檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白和/或輔助檢測(cè)丙肝患者；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所不。
[0026]所述核酸適體與丙肝核心蛋白具有較好的親和能力，可以通過(guò)固定有核酸適體的96孔板，采用酶聯(lián)放大方法檢測(cè)溶液中的丙肝核心蛋白，從而實(shí)現(xiàn)臨床中丙肝病毒的檢測(cè)。所述核酸適體與丙肝核心蛋白具有較好的親和能力，可以通過(guò)固定有單克隆抗體的96孔板，采用核酸適體檢測(cè)溶液中的丙肝核心蛋白，從而實(shí)現(xiàn)臨床中丙肝病毒的檢測(cè)。
[0027]利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，也可以檢測(cè)溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，將有利于丙型肝炎血清學(xué)診斷和血液篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲核心蛋白進(jìn)行丙型肝炎檢測(cè)，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為實(shí)施例1中帶組氨酸標(biāo)簽蛋白的western-blot結(jié)果；A:帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白；B:帶組氣fe標(biāo)簽的PET蛋白。
[0029]圖2為核酸適體與丙型肝炎病毒核心蛋白的結(jié)合表征。
[0030]圖3為核酸適體與丙肝核心蛋白結(jié)合的特異性表征。
[0031]圖4為采用生 物素修飾的核酸適體用于丙肝核心蛋白的檢測(cè)。
[0032]圖5采用核酸適體板檢測(cè)丙肝核心蛋白。
[0033]圖6為采用核酸適體板檢測(cè)血清中的丙肝核心蛋白。
[0034]圖7為在單克隆抗體板上采用核酸適體檢測(cè)血清中的丙肝核心蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0036]丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒(顯色液A+B、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)修飾的丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體、具有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的96孔板)購(gòu)自湖南景達(dá)制藥有限公司。N1-NTA瓊脂糖微珠購(gòu)自Qiagen公司。鏈霉親和素修飾的96孔板(購(gòu)于pierce公司)。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)自pierce公司。大腸桿菌(E.coli)DH5a菌株購(gòu)自北京鼎國(guó)公司。大腸桿菌(E.coli)BL21 (DE3)菌株購(gòu)自Invitrogen 公司。
[0037]原核表達(dá)載體pLMl ;公眾可以從中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn):Sodeoka M, Larson C，Chen L, et al.A multifunctional plasmid for proteinexpression by ECPCR: overproduction of the p50subunit of NF- κ B.Bioorg Med ChemLett,1993,3:1089-1094。
[0038]實(shí)施例1、相關(guān)蛋白和相關(guān)溶液的制備[0039]一、帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白(靶標(biāo)蛋白)的制備
[0040]1、HCV核心蛋白的編碼基因的擴(kuò)增
[0041]制備序列表的序列4所示的DNA(丙型肝炎病毒核心蛋白的編碼基因，GENBANKACCESSION N0.HM566118.1，編碼序列表的序列3所示的丙型肝炎病毒核心蛋白)，作為PCR擴(kuò)增的模板，用引物I和引物2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0042]引物I (上游引物):5 ’ -CGCGCGAATTCATGAGCACGAATCCT-3 ’ ；
[0043]引物2 (下游引物):5 ’ -CTGCAGGGATCCAGAGGCCGGGACGGTCA-3 ’ ；
[0044]上、下游引物的5’端分別引入EcoR I酶切位點(diǎn)和BamH I酶切位點(diǎn)。
[0045]PCR 擴(kuò)增條件:95V 2min ；95°C 30s，66。。30s, 72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。
[0046]2、原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047]①用限制性酶EcoR I和BamH I雙酶切步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。
[0048]②用限制性酶EcoR I和BamH I雙酶切原核表達(dá)載體pLMl，回收載體骨架。
[0049]③將步驟①的酶切 產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。
[0050]④將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒依次進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定。
[0051]測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pLMl-core (骨架質(zhì)粒為原核表達(dá)載體pLMl,在EcoR I和BamH I酶切識(shí)別位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所示的DNA，序列4所示的丙型肝炎病毒核心蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸標(biāo)簽的編碼基因融合，表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白)。
[0052]3、帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表達(dá)鑒定
[0053]①將重組質(zhì)粒pLMl-core轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。
[0054]②挑取陽(yáng)性克隆于LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過(guò)夜，加入IPTG (終濃度lmmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)IOh。
[0055]③13000rpm 離心 lmin,收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳和 Western blot。Westernblot的一抗為ant1-his (購(gòu)自Sigma公司)。Western blot的結(jié)果見(jiàn)圖1A。結(jié)果表明，菌體中含有帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白。
[0056]4、帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白的大量表達(dá)、純化及檢測(cè)
[0057]①將重組質(zhì)粒pLMl-core轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌。
[0058]②將步驟①得到的重組菌接種LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1:50的體積比轉(zhuǎn)接到含50 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)約2h (使0D600為0.6-0.8)，加入IPTG (終濃度lmmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)12h。
[0059]③3500rpm離心收集菌體,在含100ug/ml溶菌酶的start buffer (0.02M憐酸鈉，0.5M NaCl, pH7.4)中超聲破碎(頻率120w，每個(gè)循環(huán)內(nèi)超聲3s停3s，400個(gè)循環(huán)，在冰浴上進(jìn)行)，4°C、1000Orpm離心10min,收集裂解上清。
[0060]④將裂解上清上樣于N1-NTA偶聯(lián)的瓊脂糖黏附柱(購(gòu)自GE公司),用washingbuffer (0.02M 磷酸鈉，0.5M NaCl,0.05M 咪唑，ρΗ7.4)洗滌去除雜蛋白，用 elutionbuffer (0.02M磷酸鈉，0.5M NaCl, 0.5M咪唑，pH7.4)洗脫目的蛋白，得到帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白(用丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性)。[0061]二、帶組氨酸標(biāo)簽的PET蛋白(對(duì)照蛋白)的制備
[0062]1、制備序列表的序列6所示的DNA (PET蛋白的編碼基因，GENBANK ACCESS IONN0.U46489.1,編碼序列表的序列5所示的PET蛋白)，插入原核表達(dá)載體pLMl的EcoR I和BamH I位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pLMl-PET (骨架質(zhì)粒為原核表達(dá)載體pLMl，在EcoR I和BamH I酶切識(shí)別位點(diǎn)之間插入了序列表的序列6所示的DNA，序列6所示的PET蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸標(biāo)簽的編碼基因融合，表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的PET蛋白)。
[0063]2、帶組氨酸標(biāo)簽的PET蛋白的原核表達(dá)鑒定
[0064]①將重組質(zhì)粒pLMl-PET轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。
[0065]②挑取陽(yáng)性克隆于LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過(guò)夜，加入IPTG (終濃度lmmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)IOh。
[0066]③13000rpm 離心 lmin,收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳和 Western blot。Westernblot的一抗為ant1-his (購(gòu)自Sigma公司)。Western blot的結(jié)果見(jiàn)圖1B。結(jié)果表明，菌體中含有帶組氨酸標(biāo)簽的PET蛋白。
[0067]3、用重組質(zhì)粒pLMl-PET代替重組質(zhì)粒pLMl-core,其它同步驟一的4,得到帶組氨酸標(biāo)簽的PET蛋白。
[0068]三、相關(guān)溶液的制備
[0069]PBS緩沖液:pH為7.4，由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為:39mM NaH2PO4,6ImMNa2HPO4,150mM NaCl。
[0070]結(jié)合緩沖液:pH為7.4，由PBS緩沖液和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為:lmM MgCl2,0.2mg/ml酵母轉(zhuǎn)移RNA。
[0071]洗滌液:pH為7.2，由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為:25mM Tris, 150mM NaCl,
0.1% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白(BSA)，0.05% (體積百分含量)Tween-20。
[0072]TBST緩沖液:pH為7.4，由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其濃度為:0.02M Tris-HCl,160mM NaCl, 0.1% (體積百分含量)Tween-20。
[0073]將實(shí)施例1制備的帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒核心蛋白(靶標(biāo)蛋白，為溶液形式，靶標(biāo)蛋白的濃度為100 μ g/mL)、實(shí)施例1制備的帶組氨酸標(biāo)簽的PET蛋白(對(duì)照蛋白，為溶液形式，對(duì)照蛋白的濃度為100μ g/mL)和實(shí)施例1制備的各種相關(guān)溶液用于實(shí)施例2至實(shí)施例8。
[0074]實(shí)施例2、核酸適體的篩選和制備
[0075]一、蛋白的固定
[0076]1、取N1-NTA瓊脂糖微珠置于5ml離心管中，移走上清，PBS緩沖液洗滌三次；
[0077]2、將步驟I的微珠分散于靶標(biāo)蛋白(或?qū)φ盏鞍?中，室溫孵育lh，PBS緩沖液離心洗滌三次；
[0078]3、將步驟2的微珠重新分散于Iml PBS緩沖液中，置于4°C備用。[0079]二、隨機(jī)核酸文庫(kù)的設(shè)計(jì)
[0080]設(shè)計(jì)兩端包含20個(gè)核苷酸、中間包括40個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫(kù)如下:5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG (N4tl) CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；N4tl 代表 40 個(gè)隨機(jī)核苷酸。
[0081]三、核酸適體的篩選[0082]1、DNA文庫(kù)預(yù)處理
[0083]將隨機(jī)核酸文庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液中。
[0084]2、反篩
[0085]將隨機(jī)核酸文庫(kù)與固定有對(duì)照蛋白的微珠混合，37°C孵育1-2小時(shí)；經(jīng)結(jié)合緩沖液洗滌后，將微珠通過(guò)超濾離心。
[0086]3、正篩
[0087]將反篩過(guò)程中超濾離心的溶液加入固定有靶標(biāo)蛋白的微珠中，37°C孵育1-2小時(shí)。將微珠通過(guò)超濾離心洗滌后，用滅菌水將微珠轉(zhuǎn)移到離心管中。將微珠經(jīng)95°C加熱IOmin、冰上冷卻IOmin、高速離心后，收集上清液并以其中的DNA為模板，利用引物(FITC-5，-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3，和 Biotin-5，-GTC ACC AGC ACG TCC ATG AG-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增后通過(guò)親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，然后利用
0.2M的氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集FITC標(biāo)記的DNA單鏈，這些DNA單鏈脫鹽后用于下一輪篩選。
[0088]為了獲得高親和性和特異性結(jié)合靶標(biāo)蛋白的核酸適體，在篩選的過(guò)程中逐步改變反篩和正篩的蛋白量、篩選時(shí)間、篩選溶液中tRNA含量以及正篩洗滌次數(shù)，以增加篩選壓力。
[0089]8輪篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過(guò)引物(5，-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3’和5’ -GTC ACC AGC ACG TCC ATG AG-3’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
[0090]最終選擇的核酸適體(核酸適體HCV-1)序列如下(見(jiàn)序列表的序列I，單鏈DNA):5， -ACGCTCGGATGCCACTACAGTAACACACACAACTTAAAATCATACAAAAAAGAGTAAATGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，；
[0091]其中加粗下劃線標(biāo)記的為核心序列(見(jiàn)序列表的序列2，單鏈DNA)。
[0092]實(shí)施例3、核酸適體與丙型肝炎病毒核心蛋白的結(jié)合表征
[0093]一、核酸適體和隨機(jī)核酸文庫(kù)的FITC標(biāo)記
[0094]用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體HCV-1。
[0095]用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記實(shí)施例2制備的的隨機(jī)核酸文庫(kù)。
[0096]二、核酸適體與丙型肝炎病毒核心蛋白的結(jié)合表征
[0097]1、靶標(biāo)蛋白的固定
[0098](I)取200 μ I N1-NTA瓊脂糖微珠置于5ml離心管中，移走上清，PBS緩沖液洗滌三次；
[0099](2)將步驟(1)的微珠分散于ImL靶標(biāo)蛋白中，室溫孵育lh，PBS緩沖液離心洗滌三次；
[0100](3)將步驟(2)的微珠重新分散于Iml PBS緩沖液中，置于4°C備用。
[0101]2、核酸適體與丙型肝炎病毒核心蛋白的結(jié)合表征
[0102]設(shè)置以下兩組處理:
[0103]第I組:將I μ 110 μ M FITC標(biāo)記的核酸適體HCV-1用結(jié)合緩沖液稀釋使得核酸適體HCV-1的濃度為ΙΟΟηΜ，然后與70 μ I步驟I得到的固定有靶標(biāo)蛋白的微珠孵育Ih ；
[0104] 第2組:將I μ 110 μ M FITC標(biāo)記的隨機(jī)核酸文庫(kù)用結(jié)合緩沖液稀釋使得隨機(jī)核酸文庫(kù)的濃度為ΙΟΟηΜ，然后與70 μ I步驟I得到的固定有靶標(biāo)蛋白的微珠孵育Ih ；[0105]用結(jié)合緩沖液超濾洗滌后，用共聚焦熒光顯微鏡觀察微珠的熒光信號(hào)。
[0106]結(jié)果見(jiàn)圖2。核酸適體HCV-1與固定有靶標(biāo)蛋白的微珠結(jié)合能力強(qiáng)，微珠表面具有很強(qiáng)的突光。隨機(jī)核酸文庫(kù)與固定有祀標(biāo)蛋白的微珠的結(jié)合能力弱，微珠表面突光非常弱。結(jié)果表明，核酸適體HCV-1與丙型肝炎病毒核心蛋白具有很好的結(jié)合能力。
[0107]實(shí)施例4、核酸適體與丙肝核心蛋白結(jié)合的特異性表征
[0108]一、核酸適體的FITC標(biāo)記
[0109]用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體HCV-1。
[0110]二、核酸適體的特異性
[0111]1、蛋白的固定
[0112](I)取200 μ I N1-NTA瓊脂糖微珠置于5ml離心管中，移走上清，PBS緩沖液洗滌三次；
[0113](2)將步驟(1)的微珠分散于ImL待固定蛋白(靶標(biāo)蛋白或?qū)φ盏鞍?中，室溫孵育lh，PBS緩沖液離心洗滌三次；
[0114](3)將步驟(2)的微珠重新分散于Iml PBS緩沖液中，置于4°C備用。
[0115]2、核酸適體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的特異性 [0116]設(shè)置以下兩組處理:
[0117]第I組:將I μ 110 μ M FITC標(biāo)記的核酸適體HCV-1用結(jié)合緩沖液稀釋使得核酸適體HCV-1的濃度為ΙΟΟηΜ，然后與70 μ I步驟I得到的固定有靶標(biāo)蛋白的微珠孵育Ih ；
[0118]第2組:將I μ 110 μ M FITC標(biāo)記的核酸適體HCV-1用結(jié)合緩沖液稀釋使得隨機(jī)核酸文庫(kù)的濃度為ΙΟΟηΜ，然后與70 μ I步驟I得到的固定有對(duì)照蛋白的微珠孵育Ih ；
[0119]用結(jié)合緩沖液超濾洗滌后，用共聚焦熒光顯微鏡觀察微珠的熒光信號(hào)。
[0120]結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)核酸適體HCV-1與丙型肝炎病毒核心蛋白或PET蛋白作用時(shí)，只有固定有丙型肝炎病毒核心蛋白的微珠表面有明顯的突光信號(hào)；而固定有PET蛋白的微珠表面熒光強(qiáng)度非常弱。結(jié)果表明，核酸適體HCV-1對(duì)丙型肝炎病毒核心蛋白具有很好的特異性。
[0121]實(shí)施例5、采用生物素修飾的核酸適體用于丙肝核心蛋白的檢測(cè)
[0122]1、用生物素(biotin)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體HCV-1。
[0123]2、將1.5μ I待測(cè)蛋白(靶標(biāo)蛋白或?qū)φ盏鞍?點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，待吸收完全后，將膜用5% (質(zhì)量百分含量)BSA水溶液在室溫條件下封閉2小時(shí)。
[0124]3、取步驟I得到的生物素標(biāo)記的核酸適體HCV-1，用結(jié)合緩沖液稀釋，得到核酸適體溶液(生物素標(biāo)記的核酸適體的濃度為IOOnM)。
[0125]4、將ImL步驟3得到的核酸適體溶液與步驟2得到的帶有待測(cè)蛋白的膜37°C雜交1-2小時(shí)，用TBST緩沖液清洗后，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，發(fā)光顯跡。
[0126]結(jié)果見(jiàn)圖4。在PET蛋白處無(wú)斑點(diǎn)產(chǎn)生，而丙型肝炎病毒核心蛋白處呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。結(jié)果表明，核酸適體與丙型肝炎病毒核心蛋白的結(jié)合具有特異性，可用于丙型肝炎病毒核心蛋白的檢測(cè)。
[0127]實(shí)施例6、采用核酸適體板檢測(cè)丙肝核心蛋白
[0128]一、核酸適體的生物素標(biāo)記[0129]用生物素(biotin)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體HCV-1。
[0130]二、核酸適體板的制備
[0131 ] 將步驟一得到的生物素標(biāo)記的核酸適體HCV-1用結(jié)合緩沖液溶解(生物素標(biāo)記的核酸適體的濃度為IOOnM)，然后加入鏈霉親和素修飾的96孔板中，每孔加入200微升，孵育I小時(shí)，經(jīng)洗滌液洗滌后置于4°C備用。
[0132]三、核酸適體板上的核酸適體對(duì)靶標(biāo)蛋白的捕獲作用
[0133]設(shè)置以下兩組處理:
[0134]第I組:將靶標(biāo)蛋白加入步驟二得到的核酸適體板中，每孔200 μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1-2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入HRP修飾的丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B，顯色10分鐘；
[0135]第2組:將靶標(biāo)蛋白加入鏈霉親和素修飾的96孔板，每孔200μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1-2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入HRP修飾的丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體，37°C孵育0.5小時(shí)(0 .5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B，顯色10分鐘；
[0136]顯色后檢測(cè)450nm下的光吸收值。
[0137]將第2組的光吸收值作為1，計(jì)算核酸適體板的相對(duì)吸光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖5A。核酸適體HCV-1對(duì)丙型肝炎病毒核心蛋白具有顯著的捕獲作用。
[0138]四、用核酸適體板檢測(cè)靶標(biāo)蛋白的特異性
[0139]將待測(cè)蛋白(靶標(biāo)蛋白、PET蛋白；等體積的結(jié)合緩沖液作為空白對(duì)照)加入步驟二得到的核酸適體板，每孔200 μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1-2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入HRP修飾的丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B，顯色10分鐘；
[0140]顯色后檢測(cè)450nm下的光吸收值。
[0141]將PET蛋白作為待測(cè)蛋白的孔的光吸收值作為1，計(jì)算核酸適體板加入各個(gè)待測(cè)蛋白時(shí)的相對(duì)吸光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖5B。核酸適體HCV-1能特異性的捕獲丙型肝炎病毒核心蛋白，通過(guò)HRP標(biāo)記的抗體實(shí)現(xiàn)丙型肝炎病毒核心蛋白的檢測(cè)，從而該核酸適體在臨床上可用于丙型肝炎的檢測(cè)。
[0142]實(shí)施例7、采用核酸適體板檢測(cè)血清中的丙肝核心蛋白
[0143]一、核酸適體的生物素標(biāo)記
[0144]用生物素(biotin)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體HCV-1。
[0145]二、核酸適體板的制備
[0146]同實(shí)施例6的步驟二。
[0147]三、采用核酸適體板檢測(cè)血清中的丙肝核心蛋白
[0148]設(shè)置以下兩組處理:
[0149]第I組:在100 μ I小牛血清中加入20 μ I靶標(biāo)蛋白，得到含靶標(biāo)蛋白的血清；將含靶標(biāo)蛋白的血清與結(jié)合緩沖液等體積混合，將混合液加入到步驟二得到的核酸適體板中，每孔200μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1-2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入HRP修飾的丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B,顯色10分鐘；
[0150]第2組:將小牛血清加入到步驟二得到的核酸適體板，每孔200 μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1-2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入HRP修飾的丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B，顯色10分鐘；
[0151]顯色后檢測(cè)450nm下的光吸收值。
[0152]結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，核酸適體板能夠特異性的檢測(cè)血清中的丙型肝炎病毒核心蛋白，從而核酸適體HCV-1在臨床上可用于丙型肝炎的血清檢測(cè)。
[0153]實(shí)施例8、在單克隆抗體板上采用核酸適體檢測(cè)血清中的丙肝核心蛋白
[0154]一、核酸適體的生物素標(biāo)記
[0155]用生物素(biotin)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體HCV-1。
[0156]二、應(yīng)用單克隆抗體板和核酸適體檢測(cè)靶標(biāo)蛋白的特異性
[0157]將靶標(biāo)蛋白或?qū)φ盏鞍谆蚪Y(jié)合緩沖液加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的96孔板，每孔200μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1_2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入生物素標(biāo)記的核酸適體HCV-1，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素，37°C孵育30分鐘(20-60分鐘均可)；經(jīng)洗滌液洗漆后，加入顯 色液A+B,顯色10分鐘；
[0158]顯色后檢測(cè)450nm下的光吸收值。
[0159]結(jié)果見(jiàn)圖7A。
[0160]二、在單克隆抗體板上采用核酸適體檢測(cè)血清中的丙肝核心蛋白
[0161]設(shè)置以下兩組處理:
[0162]第I組:在100 μ I小牛血清中加入20 μ I靶標(biāo)蛋白，得到含靶標(biāo)蛋白的血清；將含靶標(biāo)蛋白的血清與結(jié)合緩沖液等體積混合，將混合液加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的96孔板中，每孔200 μ 1，37°C孵育I小時(shí)(1_2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入生物素標(biāo)記的核酸適體HCV-1，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素，37°C孵育30分鐘(30-60分鐘均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B，顯色10分鐘；
[0163]第2組:將小牛血清加入到具有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的96孔板中，每孔200μ1，37?孵育I小時(shí)(1-2小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入生物素標(biāo)記的核酸適體HCV-1，37°C孵育0.5小時(shí)(0.5-1小時(shí)均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素，37°C孵育30分鐘(30-60分鐘均可)；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液A+B,顯色10分鐘；
[0164]顯色后檢測(cè)450nm下的光吸收值。
[0165]結(jié)果見(jiàn)圖7B。
[0166]圖7的結(jié)果表明，核酸適體HCV-1能夠特異性的檢測(cè)血清中的丙型肝炎病毒核心蛋白，并通過(guò)biotin與HRP修飾的streptavidin能夠放大信號(hào),從而該核酸適體在臨床上可用于丙型肝炎的血清檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.核酸適體，是如下(a)或(b): (a)序列表的序列2所示的單鏈DNA； (b)含有(a)所述核酸適體的單鏈DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸適體，其特征在于:所述(b)中的核酸適體是序列表的序列I所示的單鏈DNA。
3.固定有權(quán)利要求1或2所述核酸適體的酶標(biāo)板。
4.權(quán)利要求1或2所述核酸適體在制備輔助檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白的試劑盒中的應(yīng)用；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。
5.權(quán)利要求1或2所述核酸適體在制備輔助鑒定丙肝患者的試劑盒中的應(yīng)用。
6.一種輔助檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白的試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述核酸適體；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板。
8.一種輔助鑒定丙肝患者的試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述核酸適體。
9.如權(quán)利要求8 所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括包被有丙型肝炎病毒核心蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板。
10.權(quán)利要求3所述的酶標(biāo)板在制備輔助檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白和/或輔助鑒定丙肝患者的試劑盒中的應(yīng)用；所述丙型肝炎病毒核心蛋白如序列表的序列3所示。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK104004763SQ201410219472
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】方曉紅, 張振, 趙子龍, 徐麗, 董再再, 趙立波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所