一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種桑葉中阿苯達唑(ABZ)持留量的測定方法。本發(fā)明采用固相萃取法對目標物質(zhì)進行純化，純化采用氨基固相萃取柱，并選用體積比為(5～20)：(80～95)的甲醇-二氯甲烷混合液活化固相萃取柱，用體積比為(1～10)：(90～99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，可以使得桑葉中的干擾組分幾乎完全被萃取柱填料吸附，而目標成分阿苯達唑幾乎完全洗脫而出，達到了桑葉組織中阿苯達唑的良好分離與富集，純化后的樣品可直接通過液相色譜進行定量。該方法具有簡單易行、成本低且檢測結(jié)果重復性好、準確度高的優(yōu)點。
【專利說明】一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中國蠶桑具有5000多年的歷史，我國蠶絲及其絲綢制品的產(chǎn)銷量約占世界總量的70 %，是唯一可壟斷世界貿(mào)易市場的出口商品。家蠶微粒子病因其具有胚種傳染能力而對蠶種生產(chǎn)具有毀滅性的影響，是世界產(chǎn)絲國的檢疫對象。近二十余年來，家蠶微粒子病在我國呈全國流行趨勢，淘汰超毒蠶種量達數(shù)百萬張，經(jīng)濟損失慘重?，F(xiàn)有研究表明阿苯達唑是治療家蠶微粒子病較理想的藥物(楊瓊，邢東旭，廖森泰等.家蠶微粒子病治療藥物的研究.廣東蠶業(yè)，2010,44:35-37)。
[0003]阿苯達唑(albendazole，ABZ)是一種高效低毒，對線蟲、吸蟲及絳蟲均具有較強驅(qū)防效應的苯并咪唑類藥物，已被廣泛應用于人體醫(yī)學、畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖等多個領(lǐng)域。其在體內(nèi)代謝為亞砜類或砜類后，抑制寄生蟲對葡萄糖的吸收，導致蟲體糖原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統(tǒng)，阻礙ATP產(chǎn)生，使寄生蟲無法存活和繁殖。目前，阿苯達唑作為飼料添加劑或配制成懸濁液噴灑桑葉是給家蠶喂食阿苯達唑的兩種有效途徑，對于廣大蠶農(nóng)而言，后者可操作性和經(jīng)濟性更強，更容易被接受。因此，噴灑在桑葉上阿苯達唑持留量的動態(tài)變化規(guī)律及其在桑葉上的藥效期成為蠶桑業(yè)關(guān)注的焦點。然而，目前在闡明桑葉阿苯達唑持留量和藥效隨時間降解變化規(guī)律尚需要建立測定桑葉上阿苯達唑含量的方法。
[0004]早在20世紀80年代初，國外已有對不同生物材料中阿苯達唑及其代謝物殘留量測定方法的研究報道，Alvinerie和Galtier (Alvinerie M, GaltierP.Simultaneous determination of albendazole and its principal metabolitesin plasma by normal phase high-performance liquid chromatography.Journal ofPharmaceutical&Biomedical Analysis，1984，2:73-79)利用正向高效液相色譜實現(xiàn)了綿羊血漿中阿苯達唑及其代謝物的同時測定，使用的UV檢測器靈敏度較低。到了 21世紀初，國內(nèi)外在人體醫(yī)學、畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖等多領(lǐng)域?qū)Ω鞣N生物組織材料中丙硫咪唑或苯并咪唑類物質(zhì)測定方法的研究報道也逐漸豐富起來，如免疫分析法、毛細管電泳法、氣-質(zhì)聯(lián)用法，液-質(zhì)聯(lián)用法等。Kitzman 等(Dennis K，Cheng K，F(xiàn)leckenstein L，HPLC assayfor albendazole and metabolites in human plasma for clinical pharmacokineticstudies.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2002，30:801-813)利用C18固相萃取柱對含阿苯達唑的人體血樣在HPLC上機前進行萃取，能有效祛除雜質(zhì)、排除干擾；Mottier 等(Mottier L，Alvarez L，Lanusse C，Quantitative chromatographicdetermination of several benzimidazole anthelmintic molecules in parasitematerial.Journal of Chromatography B，2003，798:117-125)也利用固相萃取柱、反向HPLC技術(shù)同時對綿羊、牛等絳蟲寄主體內(nèi)的苯并咪唑類藥物含量進行了測定；林海丹等(林海丹，謝守新，吳映璇.固相萃取高效液相色譜法測定乳粉中苯并咪唑類藥物殘留.分析試驗室，2005，24:27-29)建立了固相萃取高效液相色譜測定乳粉中苯并咪唑類藥物殘留的方法；劉勇軍等(劉勇軍，吳銀良，姜艷彬，劉興國，王海.固相萃取高效液相色譜法測定豬肉中六種苯并咪唑類藥物殘留的研究.食品科學，2009，30:212-214)也成功利用了固相萃取高效液相色譜法對豬肉中六種苯并咪唑類藥物殘留量進行了研究。這些已有的測定技術(shù)大多是通過固相萃取來達到待測物質(zhì)與基體的分離純化，然后利用高效液相色譜進行檢測，這些方法均具有針對性強，靈敏度高和檢測速率快的優(yōu)越性。然而，由于植物基體組織與動物基體組織的成分差異，導致現(xiàn)有技術(shù)的固相萃取條件并不能實現(xiàn)植物基體組織中阿苯達唑的分離純化，特別是桑葉中的黃酮類、生物堿和植物留醇等成分會對阿苯達唑的檢測產(chǎn)生嚴重的干擾，從而無法直接用高效液相色譜對桑葉基體組織中阿苯達唑的含量進行測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，包含以下操作步驟:
[0008](I)樣品提取:用乙腈萃取桑葉得到萃取液，萃取液濃縮后加入甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液；
[0009](2)樣品純化:采用氨基固相萃取柱，先用甲醇:二氯甲烷的體積比為(5?20):(80?95)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗活化固相萃取柱，然后立即加入步驟(I)中的待凈化液，用甲醇:二氯甲烷的體積比為(I?10):(90?99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，將收集的洗脫液濃縮后用甲醇定容，過微孔濾膜得到待檢測液；
[0010](3)樣品檢測:采用液相色譜對步驟(2)中待檢測液進行檢測，通過與標準曲線的比對得出樣品中阿苯達唑的濃度并計算出阿苯達唑在桑葉中的持留量。
[0011]步驟(I)中所述樣品提取的具體步驟為:準確稱取0.6?1.0質(zhì)量份干桑葉粉，用60?100質(zhì)量份乙腈浸泡，渦旋振蕩提取10?30min，真空抽濾料液，濾液轉(zhuǎn)到具塞量筒中，加4?8質(zhì)量份NaCl，振搖后靜置分層，吸取30.0?50.0質(zhì)量份上層乙腈溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至質(zhì)量的1/15?1/25，加入I?3質(zhì)量份體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液。
[0012]步驟(2)中所述氨基固相萃取柱規(guī)格為體積3?6mL，填料量300?500mg ;所述微孔濾膜的孔徑為0.22?0.45 μ m。
[0013]步驟(3)中所述標準曲線的制備方法為:精確稱取阿苯達唑標準品25mg，在IOOmL乙腈中振蕩至完全溶解，得到250 μ g/mL的標準儲備液，再用乙腈將其稀釋成濃度分別為5 μ g/mL、15 μ g/mL、30 μ g/mL、100 μ g/mL、125 μ g/mL、250 μ g/mL 的標準溶液，標準溶液分別用液相色譜儀進行檢測，繪制溶液濃度與峰面積的標準曲線。
[0014]步驟(3)中所述液相色譜的色譜條件為:
[0015]色譜柱:HypersilBDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ；
[0016]流動相:體積比為(20?33): (30?66): (I?5)的乙腈-水-冰乙酸溶液；
[0017]柱溫:35?40 0C ;流速:1.0mL/min ;進樣量=IOyL ;檢測器波長:254?292nm。[0018]本發(fā)明的檢測原理為:樣品提取步驟通過選用合適溶劑萃取出桑葉中的阿苯達唑成分；樣品純化步驟的目的是要將阿苯達唑與桑葉中的黃酮類、生物堿和植物留醇等干擾組分進行分離并進行富集，針對桑葉成分的特殊性，本發(fā)明選用氨基固相萃取柱，并選用甲醇:二氯甲烷的體積比為(5?20):(80?95)的甲醇-二氯甲烷混合液活化固相萃取柱，用甲醇:二氯甲烷的體積比為(I?10):(90?99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，可以使得干擾組分幾乎完全被萃取柱填料吸附，而目標成分幾乎完全洗脫而出；樣品檢測步驟通過液相色譜中阿苯達唑的峰面積與標準曲線進行比對得到其濃度，然后計算出桑葉組織中阿苯達唑的持留量。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)方法具有如下優(yōu)點及有益效果:
[0020](I)本發(fā)明針對桑葉成分的特殊性，在樣品純化過程中通過采用特定的萃取柱和洗脫液，即可實現(xiàn)阿苯達唑與桑葉中干擾組分的良好分離，分離后的阿苯達唑可直接進行液相色譜定量分析，方法簡單易行、成本低且檢測結(jié)果重復性好；
[0021](2)通過本發(fā)明的固相萃取條件具有較高的加標回收率，能實現(xiàn)阿苯達唑的良好富集，具有準確度高、靈敏度高的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明繪制的標準曲線；圖2為濃度為5μ g/mL的阿苯達唑乙腈標準溶液的色譜圖；圖3?6分別為實施例1?4中樣品檢測的色譜圖；圖7為對比實施例1中樣品檢測的色譜圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0024]試驗材料來源:
[0025]于2013年5月和10月分別進行兩批次田間試驗，試驗地位于廣州市郊的廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所白云基地內(nèi)的國家桑樹種質(zhì)資源華南分圃，土壤質(zhì)地為紅黏土。供試桑樹為長勢良好的3年生品種“粵椹大10” (粵桑審2006002)。實驗區(qū)分為處理一區(qū)、處理二區(qū)和空白區(qū)，每區(qū)面積50m2。處理一區(qū)和二區(qū)均用阿苯達唑(購于常州亞邦齊暉醫(yī)藥化工有限公司，純度> 98% )懸濁液進行均勻噴桑處理:處理一區(qū)噴灑濃度為1000mg/L，處理二區(qū)噴灑濃度為1500mg/L，噴灑量均為5L/區(qū)；空白區(qū)則用同樣體積的清水噴灑均勻。每個實驗區(qū)設3小區(qū)，為3個重復。第一次噴藥在5月份進行，處理后0(當天)、l、2、3、4、5、6、7、8、9d用五點法分別在各實驗區(qū)取樣，每區(qū)共取500g鮮葉，立即運回實驗室進行冷凍干燥，并研磨成桑葉粉末(80目)，得到待測干桑葉粉和空白干桑葉粉。
[0026]標準曲線繪制:
[0027]精確稱取阿苯達唑標準品25mg，在IOOmL乙腈中振蕩至完全溶解，得到250 μ g/mL的標準儲備液，再用乙腈將其稀釋成濃度分別為5 μ g/mL、15 μ g/mL、30 μ g/mL、100 μ g/mL、125 μ g/mL、250 μ g/mL 的標準溶液；
[0028]采用以下液相色譜條件對標準溶液進行測定:
[0029]色譜柱:HypersilBDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ；
[0030]流動相:體積比為33:66: I的乙腈-水-冰乙酸溶液；[0031]柱溫:35°C ;流速:1.0mL/min ；
[0032]進樣量:10 μ L ;檢測器波長:292nm ；
[0033]所得結(jié)果以標準溶液的濃度值(X)為橫坐標，以各濃度所得的對應峰面積數(shù)值(y)為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果如圖1所示；5μ g/mL標準溶液的色譜圖如圖2所示。
[0034]實施例1
[0035]一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，具體操作步驟如下:
[0036](I)樣品提取:準確稱取0.Sg待測干桑葉粉，加80g乙腈浸泡，渦旋振蕩提取20min，真空抽濾料液，濾液轉(zhuǎn)到IOOmL具塞量筒中，加6g NaCl，振搖Imin后靜置分層，吸取40.0g上層乙腈溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C條件下濃縮至1/20，加入2g體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液；
[0037](2)樣品純化:首先用5mL甲醇:二氯甲烷的體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱規(guī)格為體積6mL，填料量300mg，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，棄去淋洗液，立即加入步驟(I)中的待凈化液，用4.0mL甲醇:二氯甲烷的體積比為1:99的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，將收集的洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/20，用甲醇準確定容至4.0mL,在渦旋儀上混勻，過0.22 μ m微孔濾膜得到待檢測液；
[0038](3)樣品檢測:采用以下液相色譜條件對步驟(2)中的待檢測液進行測定:
[0039]色譜柱:HypersilBDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ；
[0040]流動相:體積比為33:66: I的乙腈-水-冰乙酸溶液；
[0041]柱溫:35°C;流速:1.0mL/min ；
[0042]進樣量:10 μ L ;檢測器波長:292nm。
[0043]測定結(jié)果如圖3所示，由圖中可以看出:試驗樣品中阿苯達唑的保留時間(8.191min)與標準品的保留時間(8.037min)基本一致，峰形良好，周圍基本無雜質(zhì)峰干擾，通過與標準曲線的比對可計算出本實施例試驗樣品中阿苯達唑的持留量為236.69mg/
kg ο
[0044]實施例2
[0045]一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，具體操作步驟如下:
[0046](I)樣品提取:準確稱取0.6g待測干桑葉粉，加60g乙腈浸泡，渦旋振蕩提取25min，真空抽濾料液，濾液轉(zhuǎn)到IOOmL具塞量筒中，加4g NaCl，振搖Imin后靜置分層，吸取50.0g上層乙腈溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C條件下濃縮至1/20，加入3g體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液；
[0047](2)樣品純化:首先用5mL甲醇:二氯甲烷的體積比為20:80的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱規(guī)格為體積3mL，填料量300mg，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，棄去淋洗液，立即加入步驟(I)中的待凈化液，用4.0mL甲醇:二氯甲烷的體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液洗脫，將收集的洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/20，用甲醇準確定容至4.0mL,在渦旋儀上混勻，過0.30 μ m微孔濾膜得到待檢測液；
[0048](3)樣品檢測:采用以下液相色譜條件對步驟(2)中的待檢測液進行測定:
[0049]色譜柱:HypersilBDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ；
[0050]流動相:體積比為33:66: I的乙腈-水-冰乙酸溶液；
[0051]柱溫:35°C;流速:1.0mL/min ；[0052]進樣量:10 μ L ;檢測器波長:292nm。
[0053]測定結(jié)果如圖4所示，由圖中可以看出:試驗樣品中阿苯達唑的保留時間(8.194min)與標準品的保留時間(8.037min)基本一致，峰形良好，周圍基本無雜質(zhì)峰干擾，通過與標準曲線的比對可計算出本實施例試驗樣品中阿苯達唑的持留量為92.60mg/
kg ο
[0054]實施例3
[0055]一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，具體操作步驟如下:
[0056](I)樣品提取:準確稱取1.0g待測干桑葉粉，加IOOg乙腈浸泡，渦旋振蕩提取lOmin，真空抽濾料液，濾液轉(zhuǎn)到IOOmL具塞量筒中，加8g NaCl，振搖Imin后靜置分層，吸取30.0g上層乙腈溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C條件下濃縮至1/15，加入Ig體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液；
[0057](2)樣品純化:首先用5mL甲醇:二氯甲烷的體積比為5:95的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱規(guī)格為體積5mL，填料量500mg，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，棄去淋洗液，立即加入步驟(I)中的待凈化液，用4.0mL甲醇:二氯甲烷的體積比為5:95的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，將收集的洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/20，用甲醇準確定容至4.0mL,在渦旋儀上混勻，過0.45 μ m微孔濾膜得到待檢測液；
[0058](3)樣品檢測:采用以下液相色譜條件對步驟(2)中的待檢測液進行測定:
[0059]色譜柱:HypersilBDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ；
[0060]流動相:體積比為33:66: I的乙腈-水-冰乙酸溶液；
[0061]柱溫:35°C;流速:1.0mL/min ；
[0062]進樣量:10 μ L ;檢測器波長:292nm。
[0063]測定結(jié)果如圖5所示，由圖中可以看出:試驗樣品中阿苯達唑的保留時間(8.229min)與標準品的保留時間(8.037min)基本一致，峰形良好，周圍基本無雜質(zhì)峰干擾，通過與標準曲線的比對可計算出本實施例試驗樣品中阿苯達唑的持留量為253.91mg/
kg ο
[0064]實施例4
[0065]一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，具體操作步驟如下:
[0066](I)樣品提取:準確稱取0.8g待測干桑葉粉,加IOOg乙臆浸泡，潤旋振蕩提取20min，真空抽濾料液，濾液轉(zhuǎn)到IOOmL具塞量筒中，加8g NaCl，振搖Imin后靜置分層，吸取50.0g上層乙腈溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C條件下濃縮至1/25，加入2g體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液；
[0067](2)樣品純化:首先用5mL甲醇:二氯甲烷的體積比為5:95的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗氨基固相萃取柱，氨基固相萃取柱規(guī)格為體積6mL，填料量500mg，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，棄去淋洗液，立即加入步驟(I)中的待凈化液，用4.0mL甲醇:二氯甲烷的體積比為1:99的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，將收集的洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1/20，用甲醇準確定容至4.0mL,在渦旋儀上混勻，過0.35 μ m微孔濾膜得到待檢測液；
[0068](3)樣品檢測:采用以下液相色譜條件對步驟(2)中的待檢測液進行測定:
[0069]色譜柱:HypersilBDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ；
[0070]流動相:體積比為20:30:5的乙腈-水-冰乙酸溶液；[0071]柱溫:40°C ;流速:1.0mL/min ；
[0072]進樣量:10 μ L ;檢測器波長:254nm。
[0073]測定結(jié)果如圖6所示，由圖中可以看出:試驗樣品中阿苯達唑的保留時間(8.385min)與標準品的保留時間(8.037min)基本一致，峰形良好，周圍基本無雜質(zhì)峰干擾，通過與標準曲線的比對可計算出本實施例試驗樣品中阿苯達唑的持留量為203.63mg/
kg .
[0074]對比實施例1
[0075]采用現(xiàn)有技術(shù)動物組織中阿苯達唑分離的固相萃取條件:固相萃取柱選用HLB柱，分離采用20%體積分數(shù)的甲醇水溶液淋洗，然后采用甲醇洗脫，其它檢測條件如同實施例1，對實施例1的待測干桑葉粉中阿苯達唑持留量進行檢測，測定結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，目標物質(zhì)峰峰形不正，拖尾嚴重，無法達到準確定量的要求。
[0076]方法學驗證及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
[0077]參照Buick 等的步驟(Buick.A R, Doig M V, Jeal S C, et al.(1990)Methodvalidation in the bioanalytical laboratory.Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis8:629-637.)，對本檢測方法進行方法學驗證。包括方法的重復性(精密度)、回收率(準確度)、檢測限和定量限(靈敏度)；利用色譜儀分析自帶軟件對液譜、質(zhì)譜信號數(shù)據(jù)進行分析、物質(zhì)峰面積的自動積分、色譜質(zhì)譜圖的生成；對數(shù)據(jù)進行物質(zhì)含量、線性回歸分析、相對標準偏差等統(tǒng)計分析。驗證及分析結(jié)果如下所述。
[0078]方法重復性驗證:
[0079]選取濃度為15 μ g/mL、100 μ g/mL,250 μ g/mL的標準液和實施例1中的待測干桑葉粉進行測定，在同一天內(nèi)分別重復進樣6次，分析各樣品的變異系數(shù)，考察日內(nèi)精密度；對上述樣品進行連續(xù)三天的重復測定，分析各樣品的變異系數(shù)，考察日間精密度，結(jié)果用保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSDs)表示(見表1)，結(jié)果顯示日內(nèi)精密度樣品峰保留時間變異系數(shù)< 3.00%，峰面積的變異系數(shù)范圍在2.40%~5.51% ;日間精密度樣品峰保留時間變異系數(shù)< 4.00% ;峰面積的變異系數(shù)范圍在3.70%~5.69%，日內(nèi)和日間的精密度檢驗得到的變異系數(shù)均在可接受范圍，說明本方法具有良好的重復性。
[0080]表1精密度試驗ABZ信號峰保留時間和峰面積的變異系數(shù)(η = 6)
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，其特性在于:具體操作步驟如下: (1)樣品提取:用乙腈萃取桑葉得到萃取液，萃取液濃縮后加入甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液； (2)樣品純化:采用氨基固相萃取柱，先用甲醇:二氯甲烷的體積比為(5~20): (80~95)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗活化固相萃取柱，然后加入步驟(1)中的待凈化液，用甲醇:二氯甲烷的體積比為(I~10):(90~99)的甲醇-二氯甲烷混合液淋洗，收集洗脫液后濃縮，用甲醇溶解定容，過微孔濾膜得到待檢測液； (3)樣品檢測:采用液相色譜對步驟(2)中待檢測液進行檢測，通過與標準曲線的比對得出樣品中阿苯達唑的濃度并計算出阿苯達唑在桑葉中的持留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，其特征在于:步驟(1)中所述樣品提取的具體步驟為:稱取0.6~1.0質(zhì)量份干桑葉粉，用60~100質(zhì)量份乙腈浸泡，渦旋振蕩提取10~30min，真空抽濾料液，濾液轉(zhuǎn)到具塞量筒中，加4~8質(zhì)量份NaCl，振搖后靜置分層，吸取30.0~50.0質(zhì)量份上層乙腈溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至質(zhì)量的1/15~1/25，加入1~3質(zhì)量份體積比為10:90的甲醇-二氯甲烷混合液溶解得到待凈化液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，其特征在于:步驟(2)中所述氨基固相萃取柱規(guī)格為體積3~6mL，填料量300~500mg;所述微孔濾膜的孔徑為 0.22 ~0.45 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，其特征在于:步驟(3)中所述標準曲線的制備方法為:精確稱取阿苯達唑標準品25mg，在IOOmL乙腈中振蕩至完全溶解，得到250 μ g/mL的標準儲備液，再用乙腈將其稀釋成濃度分別為5 μ g/mL、15 μ g/mL>30 μ g/mL、100 μ g/mL、125 μ g/mL>250 μ g/mL 的標準溶液,標準溶液分別用液相色譜進行檢測，繪制溶液濃度與峰面積的標準曲線。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種桑葉中阿苯達唑持留量的測定方法，其特征在于:所述液相色譜的色譜條件為:
色譜柱:Hypersil BDS C18, 300mmX 4.0mm, 5 μ m ； 流動相:體積比為(20~33): (30~66): (I~5)的乙腈-水-冰乙酸溶液； 柱溫:35 ~40°C ;流速:1.0mL/min ； 進樣量=IOyL ;檢測器波長:254~292nm。
【文檔編號】G01N30/06GK103969374SQ201410229278
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】楊瓊, 李麗, 邢東旭, 肖陽, 李慶榮, 葉明強 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所