用于特異性水產(chǎn)類過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條，所述試紙條包被有膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原。本發(fā)明利用膠體金標(biāo)記技術(shù)，首次用膠體金標(biāo)記特異性水產(chǎn)類食物過敏原，然后將標(biāo)記后的過敏原均勻噴線于醋酸纖維素膜或硝酸纖維素膜上，制成試紙條產(chǎn)品進(jìn)行過敏原檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)自由檢測(cè)。
【專利說明】用于特異性水產(chǎn)類過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及膠體金標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]過敏性疾病是當(dāng)代社會(huì)中最常見的一種疾病，它是由廣泛存在的過敏原引起的，我國(guó)約5?10%、美國(guó)和歐洲約5?25%的人群遭受過過敏性侵?jǐn)_，其中幼兒和青少年尤為明顯，危害較嚴(yán)重。過敏反應(yīng)(allergy)是免疫機(jī)體再次接觸相同變應(yīng)原時(shí)，發(fā)生反應(yīng)過度劇烈而引起的生理功能紊亂和組織損傷的病理性免疫反應(yīng)。涉及臨床各科，如內(nèi)科包括支氣管哮喘、過敏性休克、血清病、結(jié)締組織病、腎小球腎炎、偏頭痛等，外科包括移植排異反應(yīng)、耳鼻喉科有過敏性鼻炎、滲出性中耳炎、美尼爾病等，婦產(chǎn)科包括新生兒溶血癥，眼科包括過敏性結(jié)膜炎、交感性眼炎，口腔科包括復(fù)發(fā)性口瘡，皮膚科約半數(shù)以上的疾病為過敏反應(yīng)病，另外還有輸血反應(yīng)、藥物過敏、過敏性休克等。
[0003]2011年4月國(guó)家統(tǒng)計(jì)局頒布的的調(diào)查統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)城市人口約5.7億，其中有1.5億城市過敏原發(fā)病人口，常年處于過敏原狀態(tài)的人群達(dá)5122萬人。據(jù)此估算，中國(guó)人口城市變態(tài)反應(yīng)疾病發(fā)病率為27%，加上非城市人口，實(shí)際中國(guó)變態(tài)反應(yīng)疾病發(fā)病人數(shù)約為3.6億。然而，近十年來，我國(guó)過敏原患者的診治率不到I %，近99%的過敏原患者得不到及時(shí)的診斷和治療。
[0004]據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國(guó)15000家縣級(jí)以上醫(yī)院中引進(jìn)UniCAP的不足150家，引進(jìn)率僅占1%。這一比例與其他生化檢測(cè)設(shè)備(約40?50%)的引進(jìn)率相比，足以說明過敏原的體外診斷領(lǐng)域存在著巨大發(fā)展空間。同時(shí)，體外過敏原檢測(cè)設(shè)備和試劑主要依賴進(jìn)口，這些原料均采自歐美的進(jìn)口過敏原試劑，與我國(guó)患者的地域差和人種差也有待驗(yàn)證?；谏鲜銮闆r，開發(fā)一種符合本土化要求的過敏原檢測(cè)系統(tǒng)，包括我國(guó)自主創(chuàng)新的過敏原檢測(cè)儀和試劑在內(nèi)的研發(fā)勢(shì)在必行。
[0005]過敏原檢測(cè)的方法主要分為體內(nèi)診斷和體外診斷。體內(nèi)診斷包括皮膚診斷(定性檢查)和激發(fā)診斷。常見的皮膚診斷包括皮內(nèi)實(shí)驗(yàn)、點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、斑貼實(shí)驗(yàn)等。激發(fā)診斷包括結(jié)膜實(shí)驗(yàn)、鼻實(shí)驗(yàn)、支氣管實(shí)驗(yàn)、食物實(shí)驗(yàn)、藥物激發(fā)實(shí)驗(yàn)、物理性激發(fā)實(shí)驗(yàn)等。由于體內(nèi)診斷的影響因素復(fù)雜，準(zhǔn)確性低，結(jié)果只能進(jìn)行定性，且檢查本身給患者帶來痛苦，對(duì)嚴(yán)重過敏患者甚至存在生命危險(xiǎn)等諸多因素，限制了體內(nèi)診斷的進(jìn)一步發(fā)展。
[0006]體外診斷的原理是基于IgE抗體診斷，在診斷技術(shù)上包括免疫印記法、放射變應(yīng)原吸附診斷(RAST)、熒光酶標(biāo)法(FEIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。
[0007]目前，國(guó)內(nèi)常用的臨床檢測(cè)過敏原的方法是以皮膚針刺試驗(yàn)(SPT)為主的體內(nèi)試驗(yàn)方法，即用稀釋過敏原液直接點(diǎn)刺皮膚，觀察檢測(cè)點(diǎn)是否出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)或潮紅反應(yīng)，進(jìn)行陰性或陽(yáng)性判定。SPT雖然有簡(jiǎn)便，成本低，患者可見結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。但是其結(jié)果受諸多因素影響，準(zhǔn)確性低，檢查本身給患者尤其是小兒患者帶來痛苦，對(duì)嚴(yán)重過敏患者甚至有生命危險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)體外診斷領(lǐng)域處于落后狀態(tài)，基本集中在手工操作和半定量半自動(dòng)分析狀態(tài)。存在操作煩瑣、靈敏度和精密度差，測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。
[0008]與體內(nèi)試驗(yàn)相比，只需少量血清即可篩選和確定百種過敏原，具有效能參數(shù)可靠，不受藥物影響，無全身反應(yīng)危險(xiǎn)等顯著優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用比較突出的是PHARDIA UNICAP系統(tǒng)和SIEMENS診斷系統(tǒng)。PHARDIA UNICAP系統(tǒng)自70年代問世以來，一直被作為過敏原診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。80年代進(jìn)入中國(guó)，一直處于壟斷地位。而SIEMENS診斷系統(tǒng)是過敏原自動(dòng)化新技術(shù)的代表，是近幾年新興的過敏原診斷系統(tǒng)，尚未進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)。
[0009]在發(fā)達(dá)國(guó)家，臨床上通行的全自動(dòng)過敏原檢測(cè)是基于酶聯(lián)免疫法。常用兩種方法:酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定法和生物素-親和素系統(tǒng)-酶聯(lián)免疫法。
[0010]酶聯(lián)免疫突光測(cè)定法的經(jīng)典系統(tǒng)是Pharmacia (法瑪西亞)公司的Immuno CAP檢測(cè)系統(tǒng)，它采用纖維素固相載體，該固相載體經(jīng)溴化氧活化后與過敏原共價(jià)結(jié)合。過敏原預(yù)先結(jié)合在固相載體上，加入血樣后37°C孵育，如患者血清中有針對(duì)該過敏原的特異性IgE，即形成抗此過敏原抗體復(fù)合物。洗脫后加入酶標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，形成固相載體-過敏原-特異性IgE-酶標(biāo)二抗的結(jié)合物。再次洗脫后加入底物，產(chǎn)生酶催化熒光產(chǎn)物。測(cè)定熒光值。根據(jù)熒光吸光度的大小換算成特異性IgE含量。
[0011]生物素-親和素系統(tǒng)-酶聯(lián)免疫法采用Fooke公司的ALLERG-0-LIQ測(cè)定系統(tǒng)，酶標(biāo)板由抗人IgE抗體包被,可用來檢測(cè)總IgE和特異性IgE。加入血樣后孵育和洗滌，酶標(biāo)板結(jié)合所有IgE，洗滌可避免其他免疫球蛋干擾(如特異性抗原)，再加入生物素標(biāo)記的過敏原，然后加入結(jié)合了酶的鏈霉親和素結(jié)合物和顯色底物，通過酶與底物反應(yīng)后吸光度的變化來檢測(cè)針對(duì)特異性過敏原的IgE含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條。
[0013]本發(fā)明的另一目的是提供所述試紙條的制備方法。
[0014]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條，所述試紙條包被有膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原。
[0015]具體地，本發(fā)明所述試紙條為包被有膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原的硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
[0016]其中，所述試紙條的pH值為8.5-10，膠體金顆粒與水產(chǎn)類食物抗原之間的摩爾比為20-40:1。水產(chǎn)類的來源為海產(chǎn)品類和淡水類。海產(chǎn)品類包括但不限于帶魚、黃魚、平魚、墨斗魚、海蝦、海蟹、海貝等；淡水類包括但不限于鯉魚、鯽魚、草魚、鰱魚、胖頭魚、河蝦、河蟹等。存在于魚類肌肉組織中的小清蛋白是主要引起過敏的蛋白。甲殼類的主要過敏原是原肌球蛋白。
[0017]所述帶魚抗原的制備方法為:取帶魚的肌肉組織，冷凍后用組織粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，取IOOg粉碎后的魚肉勻漿，分別用300mL丙酮分析純?nèi)芤汉?00mL苯的分析純?nèi)芤哼M(jìn)行交替脫脂5-6次(例如，用丙酮分析純?nèi)芤汉捅降姆治黾內(nèi)芤焊髅撝?次)，離心后所得沉淀物置于通風(fēng)櫥中，將殘余的丙酮和苯揮發(fā)完全，所得物質(zhì)即為帶魚抗原。
[0018]本發(fā)明還提供所述試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0019]I)水產(chǎn)類食物抗原溶液的制備:將待標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原溶解在0.9% pH7.0的NaCl溶液中，使其終濃度為50-500 μ g/ml,即得水產(chǎn)類食物抗原溶液；[0020]2)膠體金溶液的制備:用0.1M K2CO3溶液和0.1M HCl調(diào)0.01 % HAuCl4膠體金溶液的PH值至8.5-10，使膠體金的粒徑達(dá)到40-60nm，濃度達(dá)到0.5-2%,即得膠體金溶液；
[0021]3)膠體金與水產(chǎn)類食物抗原的結(jié)合:用0.1M K2CO3溶液調(diào)步驟I)的抗原溶液的pH值至8.5-10，邊攪拌邊向其中加入步驟2)的膠體金溶液，抗原溶液與膠體金溶液的體積比為1-10:100，同時(shí)加入穩(wěn)定劑以防止水產(chǎn)類食物抗原與膠體金顆粒聚合沉淀，即得膠體金-水產(chǎn)類食物抗原結(jié)合物；所述穩(wěn)定劑為BSA(牛血清白蛋白)和分子量20KD的聚乙二醇，二者終濃度分別為1^^P0.1%;
[0022]4)膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原的純化:將步驟3)中制備的膠體金-水產(chǎn)類食物抗原結(jié)合物經(jīng)1500r/min離心20min ;收集沉淀溶于穩(wěn)定劑中，使其濃度達(dá)到5-30% ;然后加至Sephacryl S-400層析柱上進(jìn)行純化，將純化的膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原溶液過濾除菌，4°C保存；所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液；
[0023]5)試紙條的包被:將步驟4)中制備的膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原溶液噴線于試紙條上，干燥后即得用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條成品。
[0024]前述的制備方法，步驟4)中加樣量為S印hacryl S-400層析柱體積的1/10，以穩(wěn)定劑作為洗脫液，流速為5-10ml/h ;所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液。
[0025]使用時(shí) ，將本發(fā)明的試紙條浸入人血清中，使血清中IgE抗體與特異性過敏原結(jié)合，產(chǎn)生紫色條帶。根據(jù)條帶顏色的深淺對(duì)照比色卡進(jìn)行分級(jí)，
[0026]本發(fā)明利用膠體金標(biāo)記技術(shù)，首次用膠體金標(biāo)記特異性水產(chǎn)類食物過敏原抗原，然后將標(biāo)記后的過敏原均勻噴線于醋酸纖維素膜或硝酸纖維素膜上，制成試紙條產(chǎn)品進(jìn)行過敏原檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)自由檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0028]實(shí)施例用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條及其制備方法
[0029]用于特異性帶魚過敏原IgE篩查的試紙條的制備包括待標(biāo)記抗原溶液的制備、待標(biāo)膠體金溶液的制備、膠體金標(biāo)記帶魚抗原、膠體金帶魚抗原的純化、膠體金蛋白顆粒的粒徑鑒定以及試紙條的包被。具體步驟如下:
[0030]1、待標(biāo)記抗原溶液的制備
[0031]所述帶魚抗原的制備方法為:取帶魚的肌肉組織，冷凍后用組織粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，取100g粉碎后的魚肉勻漿，分別用300mL丙酮分析純?nèi)芤汉?00mL苯的分析純?nèi)芤哼M(jìn)行交替脫脂(各3次)，離心后所得沉淀物置于通風(fēng)櫥中，將殘余的丙酮和苯揮發(fā)完全，所得物質(zhì)即為帶魚抗原，于4°C保存。
[0032]將待標(biāo)記的帶魚抗原溶解在0.9 % pH7.0的NaCl溶液中，使其終濃度為50-500 μ g/ml,即得帶魚抗原溶液。
[0033]2、待標(biāo)膠體金溶液的制備
[0034]用0.1M K2CO3溶液或0.1M HCl調(diào)膠體金溶液的pH值至9.0，使膠體金的粒徑達(dá)到50nm,濃度達(dá)到I %。[0035]3、膠體金標(biāo)記帶魚抗原:將膠體金和抗原溶液分別用0.1M K2CO3溶液調(diào)pH至9.0，電磁攪拌抗原溶液，加入膠體金溶液，抗原溶液與膠體金溶液的體積比為1-10:100，繼續(xù)攪拌lOmin，加入穩(wěn)定劑BSA和分子量20KD的聚乙二醇，得到I % BSA和0.1 %分子量20KD的聚乙二醇溶液。此過程需要調(diào)整抗原的用量，以膠體金標(biāo)記抗原完成后的溶液呈葡萄酒紅色為最佳。
[0036]4、膠體金標(biāo)記的帶魚抗原的純化:將步驟3中制備的膠體金-帶魚抗原結(jié)合物經(jīng)1500r/min離心20min ;收集沉淀溶于穩(wěn)定劑(所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液)中，使其濃度達(dá)到5-30% ;然后加至S^hacryl S-400層析柱上進(jìn)行純化,將純化的膠體金標(biāo)記的帶魚抗原溶液過濾除菌,4°C保存。
[0037]純化過程中，加樣量為Sephacryl S-400層析柱體積的1/10，以穩(wěn)定劑(所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液)作為洗脫液，流速為5_10ml/h。
[0038]5、膠體金蛋白顆粒的粒徑鑒定
[0039]膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量:在透射電鏡下觀察膠體金顆粒，計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑應(yīng)在40~60nm范圍內(nèi)。
[0040]6、試紙條的包被
[0041 ] 將陰性對(duì)照溶液(含40-70 %牛血清白蛋白的PBS溶液)，步驟4純化的抗原溶液進(jìn)行均勻噴線。
[0042]在免疫層析試紙硝酸纖維素膜表面進(jìn)行陰性對(duì)照和抗原溶液的噴線。用氣動(dòng)噴頭進(jìn)行定量操作。用三維平臺(tái)往復(fù)來回間隔噴線。最后將噴好的硝酸纖維素膜干燥并裁切成條。
[0043]7、結(jié)果判斷
[0044]根據(jù)條帶顏色的深淺對(duì)照比色卡進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)方法見表1:
[0045]表1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條，其特征在于，所述試紙條包被有膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條為包被有膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原的硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條的pH值為8.5-10，膠體金顆粒與水產(chǎn)類食物抗原之間的摩爾比為20-40:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于，水產(chǎn)類的來源為海產(chǎn)品類和淡水類。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙條，其特征在于，所述海產(chǎn)品類包括但不限于帶魚、黃魚、平魚、墨斗魚、海蝦、海蟹、海貝；淡水類包括但不限于鯉魚、鯽魚、草魚、鰱魚、胖頭魚、河蝦、河蟹。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試紙條，其特征在于，所述水產(chǎn)類食物抗原為帶魚抗原；所述帶魚抗原的制備方法為:取帶魚的肌肉組織，冷凍后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，取IOOg粉碎后的魚肉勻漿，分別用300mL丙酮分析純?nèi)芤汉?00mL苯的分析純?nèi)芤哼M(jìn)行交替脫脂5_6次，離心后所得沉淀物置于通風(fēng)櫥中，將殘余的丙酮和苯揮發(fā)完全，所得物質(zhì)即為帶魚抗原。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)水產(chǎn)類食物抗原溶液的制備:將待標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原溶解在0.9% pH7.0的NaCl溶液中，使其終濃度為50-500 μ g/ml,即得水產(chǎn)類食物抗原溶液； 2)膠體金溶液的制備:用0.1M K2CO3溶液和0.1M HCl調(diào)0.01% HAuCl4膠體金溶液的pH值至8.5-10，使膠體金的粒徑達(dá)到40-60nm，濃度達(dá)到0.5_2%，即得膠體金溶液； 3)膠體金與水產(chǎn)類食物抗原的結(jié)合:用0.1M K2CO3溶液調(diào)步驟I)的抗原溶液的pH值至8.5-10，邊攪拌邊向其中加入步驟2)的膠體金溶液，抗原溶液與膠體金溶液的體積比為1-10:100，同時(shí)加入穩(wěn)定劑以防止水產(chǎn)類食物抗原與膠體金顆粒聚合沉淀，即得膠體金-水產(chǎn)類食物抗原結(jié)合物；所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇； 4)膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原的純化:將步驟3)中制備的膠體金-水產(chǎn)類食物抗原結(jié)合物經(jīng)1500r/min離心20min ;收集沉淀溶于穩(wěn)定劑中，使其濃度達(dá)到5-30% ;然后加至Sephacryl S-400層析柱上進(jìn)行純化，將純化的膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原溶液過濾除菌，4°C保存；所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液； 5)試紙條的包被:將步驟4)中制備的膠體金標(biāo)記的水產(chǎn)類食物抗原溶液噴線于試紙條上，干燥后即得用于特異性水產(chǎn)類食物過敏原IgE篩查的試紙條成品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟4)中加樣量為SephacrylS-400層析柱體積的1/10，以穩(wěn)定劑作為洗脫液，流速為5-10ml/h ;所述穩(wěn)定劑為1% BSA和0.1%分子量20KD的聚乙二醇溶液。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103995110SQ201410231103
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】蔣琳 申請(qǐng)人:中生北控生物科技股份有限公司