一種新的Gus染色液及其配制方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的Gus染色液配制方法，包括以下步驟：1)K3[Fe(CN)6]溶液和K4[Fe(CN)6]溶液的配制；2)PBS磷酸緩沖液的配制：3)染色液的配制方法：將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯溶于甲醇，完全溶解以后，按順序依次加入：K3[Fe(CN)6]溶液、K4[Fe(CN)6]溶液、甲醇、10％的Triton-100(曲拉通)、PBS磷酸緩沖液。本發(fā)明配制過程相對簡單，操作容易。所用試劑都為無毒無害試劑，不會(huì)對人體造成傷害，不會(huì)污染環(huán)境。配制得到的染色液染色效果好，通常染色1小時(shí)就能夠顯色，不需要像其他染色液過夜染色，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間。
【專利說明】一種新的Gus染色液及其配制方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種在轉(zhuǎn)基因植物中使用的一種新的Gus染色液及其配制方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]gus基因(β_葡萄糖苷酸酶基因)是目前轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用最為廣泛的報(bào)告基因。β -葡萄糖苷酸酶是一個(gè)水解酶，以葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可以用多種方法檢測出來。絕大多數(shù)植物沒有葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此gus基因作為報(bào)告基因廣泛應(yīng)用在植物基因工程中。以X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸)作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細(xì)胞被轉(zhuǎn)入了 gus基因，并表達(dá)出Gus，適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用形成的靛藍(lán)染料，它使具Gus活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出Gus活性。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
[0003]植物基因工程中常用Gus染色液浸染轉(zhuǎn)基因材料來確定基因轉(zhuǎn)化是否成功或者基因的表達(dá)。因此Gus染色液的配制方法是這個(gè)過程中非常重要的內(nèi)容。Gus染色液配制的是否成功，或者染色液效率的高低直接決定整個(gè)轉(zhuǎn)基因過程能否順利進(jìn)行。目前Gus染色液的配制方法比較多，常用的有兩種配制方法。
[0004]第一種配制Gus染色液的方法:
[0005](I)配制X - Gluc母液:X-Gluc，用DMF (N_N_ 二甲基酰胺)配成20mM的貯存液，分裝成每管100 μ L，保存于-20°c ；
[0006](2)配制 X - Gluc 基液:
[0007]配制方法:(50mMPBS (磷酸緩沖液)，pH7.0):50mM NaH2P04,0.78g 和 50mMNa2HP04,1.79g共同溶解于100ml無菌去離子水中；Na2EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)(10mM，372mg)，Triton-100 (曲拉通)(0.1%, 100 μ L)，K3[Fe (CN)6](鐵氰化鉀)(0.5mM, 16.5mg)；K4 [Fe (CN) 6](亞鐵氰化鉀)(0.5mM,21.lmg)；
[0008](3)配制 Gus 染色液:50 μ L X-Gluc 母液 +450 μ L 基液
[0009]所有過程需要試劑:X - Gluc(5_溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯)；DMF(N-N-二甲基甲酰胺)；NaH2P04(磷酸二氫鈉)；Na2HP04 (磷酸氫二鈉)；Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉);Triton-100 (曲拉通);K3 [Fe (CN) 6](鐵氰化鉀);K4 [Fe (CN) 6](亞鐵氰化鉀)。
[0010]這種配制Gus染色液的方法過程繁雜，容易出錯(cuò)，而且在實(shí)際配制的過程中容易產(chǎn)生沉淀，有時(shí)需要加熱溶解，加熱的過程會(huì)導(dǎo)致N-N-二甲基甲酰胺(DMF)揮發(fā)，人體吸入后造成對人體器官的損傷。這種方法配制的Gus染色液，染色效率不高，一般都需要37°C過夜染色，需要等的時(shí)間長。這種方法配制的Gus染色液不能夠重復(fù)使用，在需要檢測大批量的材料時(shí)，很浪費(fèi)Gus染色液。這種方法配制的Gus染色液染有些組織比較致密或者是組織比較大的材料比如有些果實(shí)或者有的植物的根莖時(shí)就不容易上色。經(jīng)常需要通過切片的方法或者真空滲入法來染色。
[0011]第二種配制Gus染色液的方法:
[0012]第一步先用DMSO (二甲基亞砜)溶解X —Gluc，溶解后的濃度為50mg/mL(毫克每毫升);
[0013]第二步按照所需的濃度依次加入以下試劑配制成ImL的Gus染色液:
[0014]0.5M, Na2EDTA(乙二胺二乙酸二鈉)，20 μ L ；TritonX-100,1 μ L ;1Μ，磷酸鈉緩沖液(ΡΗ7.0)，100 μ L ；0.1Μ，K3Fe (CN) 6 (鐵氰化鉀),5 μ L ;0.1Μ，K4Fe (CN) 6 (亞鐵氰化鉀)，
5μ L ； 10mg/ml, X-Gulc, 200 μ L ;無菌去離子水，669 μ L ；
[0015]所有過程需要試劑:Χ — Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯)；DMS0(二甲基亞砜)；NaH2P04(磷酸二氫鈉)；Na2HP04(磷酸氫二鈉)；Na2EDTA(乙二胺四乙酸二鈉);Triton-100 (曲拉通)；K3 [Fe (CN) 6](鐵氰化鉀)；K4 [Fe (CN) 6](亞鐵氰化鉀)。
[0016]這種配制方法過程相對簡單一些，但是在實(shí)際配制的過程中容易產(chǎn)生沉淀，尤其是最后加入無菌去離子水以后會(huì)有部分沉淀析出，需要加熱溶解，加熱的過程會(huì)導(dǎo)致二甲基亞砜(DMSO)揮發(fā)，人體吸入后造成對人體器官的損傷。這種方法配制的染色液，染色效率不高，一般都需要37°C過夜染色，需要等的時(shí)間長。這種方法配制的染色液不能夠重復(fù)使用，在需要檢測大批量的材料時(shí)，很浪費(fèi)染色液。這種方法配制的染色液染有些組織比較致密或者是組織比較大的材料比如有些果實(shí)或者有的植物的根莖時(shí)就不容易上色。經(jīng)常需要通過切片的方法或者真空滲入法來染色。操作比較麻煩。
[0017]綜上所述的兩種配制方法是目前最常用的染色液配制方法。但是這兩種方法都有其缺陷，不管是從試驗(yàn)的過程結(jié)果還是從試劑的選用上都是有缺陷的。因此我們需要尋求一種新的配制方法，這種新的方法應(yīng)該具備有操作簡單，染色效率高，無毒無害的特點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種新的Gus染色液配制方法。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供上述配制方法得到的新的Gus染色液。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供了上述新的Gus染色液在轉(zhuǎn)基因植物染色中的應(yīng)用。
[0019]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，一種新的Gus染色液配制方法，包括以下步驟:
[0020]I) K3 [Fe (CN) 6]溶液和 K4 [Fe (CN) 6]溶液的配制；
[0021]2) PBS磷酸緩沖液的配制:
[0022]3)染色液的配制方法:將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯溶于甲醇，完全溶解以后，按順序依次加入:K3[Fe(CN)6]溶液、K4 [Fe (CN)6]溶液、甲醇、10%的Triton-100 (曲拉通)、PBS磷酸緩沖液。
[0023]其中，上述步驟I)中的K3[Fe (CN) 6]溶液的濃度為50mM，所述K4[Fe (CN) 6]溶液濃度為50mM。
[0024]其中，上述步驟2) PBS磷酸緩沖液的配制方法如下:配制A液:A液的組成是濃度為20mM，NaH2PO4.2Η20溶液；配制B液:Β液的組成是濃度為44.8mM, NaH2PO4.Η20溶液；PBS磷酸緩沖液的配制方法是將配置好的38ml的A液和62ml的B液混合均勻配制而成。
[0025]其中，上述步驟3)中KJFe(CN)6]溶液加入量為1ml，K4 [Fe (CN)6]溶液加入量為lml，10%WTriton-100(曲拉通)加入量為lml，PBS磷酸緩沖液加入量為77ml。
[0026]上述的一種新的Gus染色液配制方法配制得到的新的Gus染色液。
[0027]上述的新的Gus染色液在轉(zhuǎn)基因植物染色中的應(yīng)用。
[0028]上述的應(yīng)用，將轉(zhuǎn)基因材料的需要檢測的組織浸泡于Gus染色液中，置于37°C的溫度下放置1-2小時(shí)，使染液充分滲入到組織的內(nèi)部，然后脫色，倒出Gus染色液，用無水乙醇沖洗植物材料2-3次，再用70%的乙醇脫色24小時(shí)，期間更換乙醇2-3次；脫色完成以后拍照即可。
[0029]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0030]1、配制過程相對簡單，操作容易。
[0031]2、所用試劑都為無毒無害試劑，不會(huì)對人體造成傷害，不會(huì)污染環(huán)境。
[0032]3、配制得到的染色液染色效果好，通常染色I(xiàn)小時(shí)就能夠顯色，不需要想其他染色液過夜染色，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間。
[0033]4、染色時(shí)所用染色液較少，一般情況下能夠浸沒植物就能夠完全染色。
[0034]5、染色液可以回收利用3-4次，而且不影響染色效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因番茄葉片的新的Gus染色液染色圖；左邊的是轉(zhuǎn)基因煙草植株整株染色后的圖，染色后為天藍(lán)色；右邊的為轉(zhuǎn)基因番茄葉片染色后的圖，染色后為深藍(lán)色；
[0036]圖2不同配方的轉(zhuǎn)基因番茄Gus染色液染色效果；左上為本發(fā)明【背景技術(shù)】中的配方一染色后的，基本沒有染上色；左下為本發(fā)明【背景技術(shù)】中的配方二染色后的，基本沒有染上色；中上、中下、右上、右下為本發(fā)明的新的Gus染色液染色后，染色為深藍(lán)色；效果明顯。

【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例:以配制100毫升x-gluc為例
[0038]配制過程中定容所用容器為10mL毫升容量瓶。保存溶液用的容器均為10mL毫升的三角瓶，所有溶液配制好以后都要用封口膜封住三角瓶瓶口。
[0039]第一步:準(zhǔn)備工作
[0040]1.配制K3 [Fe (CN)6]鐵氰化鉀溶液:要求濃度50mM ；
[0041]具體方法:稱取1.647g (克)定容至10mL毫升無菌去離子水中。
[0042]2.配制K4 [Fe (CN)6]亞鐵氰化鉀:要求濃度50mM。
[0043]具體方法:稱取2.112g (克)定容至10mL (毫升)無菌去離子水。
[0044]3.配制PBS磷酸緩沖液:
[0045]首先配制A液:A液的組成是NaH2PO4.2H20 二水合磷酸二氫鈉，稱取3.12g (克)定容至10mL毫升無菌去離子水。
[0046]其次配制B液:B液的組成是NaH2PO4 -H2O 一水合磷酸氫二鈉，稱取7.17g (克)定容至10mL毫升無菌去離子水。
[0047]最后配制PBS磷酸緩沖液:PBS磷酸緩沖液的配制方法是將以上配置好的A液38mL (毫升)和B液62mL (毫升)混合均勻配制成10mL (毫升)PBS (磷酸緩沖液)。
[0048]以上過程中所有的溶液都需要現(xiàn)配現(xiàn)用，為了不造成溶液和藥品的浪費(fèi)，配制時(shí)可以根據(jù)自己的需要縮小或者擴(kuò)大溶液配制量。
[0049]染色液的配制方法:
[0050]首先將100毫克X — Gluc (5-溴_4_氯_3_吲哚-β -葡萄糖苷酸酯)溶于1mL (毫升)甲醇，完全溶解以后，按順序依次加入:
[0051 ] (I)K3 [Fe (CN) 6]鐵氰化鉀 ImL 毫升；
[0052](2) K4 [Fe (CN) 6]亞鐵氰化鉀 ImL 毫升；
[0053](3)甲醇 1mL 毫升；
[0054](4) 10% 的 Tri ton-100 (曲拉通)ImL 毫升；
[0055](5) PBS磷酸緩沖液77mL毫升；
[0056]最后,染色液配制完成。
[0057]配制完成的染色液如果短時(shí)間內(nèi)用不完，可以分裝成1mL毫升的小管，儲存于-20°C冰箱中，這樣染色液可以保存2-3年不變質(zhì)。下次用之前可在30°C _37°C的溫浴條件下解凍備用，反復(fù)凍融也不會(huì)影響染色效果。
[0058]染色過程:將轉(zhuǎn)基因材料的需要檢測的組織浸泡于Gus染色液中，置于37°C的溫度下放置1-2小時(shí)，使染液充分滲入到組織的內(nèi)部，此時(shí)可以看到植物材料上有藍(lán)色顯示，為了藍(lán)色看的更加清晰，需要脫除植物材料原有的顏色。接下來的步驟是脫色。倒出Gus染色液，用無水乙醇沖洗植物材料2-3次，再用70%的乙醇脫色大約24小時(shí)，期間更換乙醇
2-3次。脫色完成以后拍照。參見圖1或圖2。
[0059]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種新的Gus染色液配制方法，其特征在于，包括以下步驟:
1)K3 [Fe (CN)6]溶液和 K4 [Fe (CN)6]溶液的配制； 2)PBS磷酸緩沖液的配制: 3)染色液的配制方法:將5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯溶于甲醇，完全溶解以后，按順序依次加入=K3 [Fe (CN)6]溶液、K4 [Fe (CN)6]溶液、甲醇、10 %的Triton-1OO (曲拉通)、PBS磷酸緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的Gus染色液配制方法，其特征在于，所述步驟I)中的KJFe(CN)6]溶液的濃度為50禮，所述1(4%妳)6]溶液濃度為50mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的Gus染色液配制方法，其特征在于，所述步驟2)PBS磷酸緩沖液的配制方法如下:配制A液:A液的組成是濃度為20mM，NaH2PO4.2H20溶液；配制B液:B液的組成是濃度為44.8mM, NaH2PO4 -H2O溶液；PBS磷酸緩沖液的配制方法是將配置好的38ml的A液和62ml的B液混合均勻配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的Gus染色液配制方法，其特征在于，所述步驟3)中K3[Fe (CN)6]溶液加入量為1ml，K4[Fe (CN)6]溶液加入量為1ml，10%的Triton-100 (曲拉通)加入量為1ml，PBS磷酸緩沖液加入量為77ml。
5.權(quán)利要求1所述的一種新的Gus染色液配制方法配制得到的新的Gus染色液。
6.權(quán)利要求5所述的新的Gus染色液在轉(zhuǎn)基因植物染色中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將轉(zhuǎn)基因材料的需要檢測的組織浸泡于Gus染色液中，置于37°C的溫度下放置1-2小時(shí)，使染液充分滲入到組織的內(nèi)部，然后脫色，倒出Gus染色液，用無水乙醇沖洗植物材料2-3次，再用70%的乙醇脫色24小時(shí)，期間更換乙醇2-3次；脫色完成以后拍照即可。
【文檔編號】G01N1/30GK104075927SQ201410243265
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】王媛花, 顏志明 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院