一種河豚毒素檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種河豚毒素檢測試劑盒，所述河豚毒素檢測試劑盒包括以下成分：A、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；B、緩沖體系L；C、檢測液，所述檢測液各組分及其濃度為：pH7.4的PBS緩沖液0.01-0.03mol/L，疊氮鈉（防腐劑）0.1-0.3g/L，與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒：其中粒徑為30-50nm的膠乳顆粒0.1-0.2g/L，粒徑為60-90nm的膠乳顆粒0.2-0.4g/L，粒徑為120-200nm的膠乳顆粒0.6-0.8g/L；D、河豚毒素濃縮樣品提取液10×。本發(fā)明具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，可以同時進(jìn)行大批量樣本快速測定，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
【專利說明】一種河豚毒素檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，特別涉及一種河豚毒素檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)是飩魚類(俗稱河豚魚)及其它生物體內(nèi)含有的一種生物堿(氨基全氫喹唑啉型化合物)，是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一；其毒性比劇毒的氰化鈉還要高1250多倍，0.5mg即可致死。
[0003]申請?zhí)?00410036380.0的發(fā)明專利公開了一種河豚毒素的簡便快速的檢測方法。該方法用強(qiáng)堿處理河豚毒素，得到與河豚毒素等摩爾量的2-氨基-6-羥甲基-8-羥基喹啉與草酸鹽。利用草酸氧化酶將草酸鹽催化氧化成過氧化氫。之后通過顯色劑與過氧化氫反應(yīng)顯色，通過在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。該方法存在的缺陷是:操作復(fù)雜，檢測時間長，無法進(jìn)行大批量樣品的同時測定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種河豚毒素檢測試劑盒，具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，可以同時進(jìn)行大批量樣本快速測定，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種河豚毒素檢測試劑盒，所述河豚毒素檢測試劑盒包括以下成分:
A、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；
B、緩沖體系，所述緩沖體系各組分及其濃度為:pH7.4的PBS緩沖液0.01-0.03mol/L，溴化己二甲銨(反應(yīng)促進(jìn)劑)l_3g/L，疊氮鈉(防腐劑)0.1-0.5g/L，吐溫20 (表面活性劑)
0.5-1.5mol/L，檸檬酸 0.8-1.6 g/L，牛血清白蛋白 1-3 g/L ；
C、檢測液，所述檢測液各組分及其濃度為:pH7.4的PBS緩沖液0.01-0.03mol/L,疊氮鈉(防腐劑)0.1-0.3g/L，與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒:其中粒徑為30-50nm的膠乳顆粒0.1-0.2g/L，粒徑為60-90nm的膠乳顆粒0.2-0.4g/L，粒徑為120_200nm的膠乳顆粒 0.6-0.8 g/L ；
D、河豚毒素濃縮樣品提取液1X各組分及其濃度為:甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸銨 l_3g/L。
[0006]本發(fā)明的檢測原理為膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，具體為:河豚毒素濃縮樣品提取液稀釋至正常濃度提取樣品后得樣品提取液，緩沖體系中加入樣品提取液，然后加入檢測液，檢測液中與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒上的河豚毒素單克隆抗體與樣品提取液中河豚毒素特異性結(jié)合形成可溶性抗原抗體復(fù)合物，形成的濁度和樣品中河豚毒素的含量成正相關(guān)關(guān)系。
[0007]與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒分為小粒徑顆粒(30-50 nm)、中粒徑顆粒(60-90 nm)和大粒徑顆粒(120-200 nm)三部分，小粒徑顆粒比表面積大，交聯(lián)的河豚毒素單克隆抗體較多，增加了檢測的線性范圍。大粒徑顆粒較大，結(jié)合河豚毒素后容易顯現(xiàn)濁度，提高了檢測的靈敏度。中粒徑顆粒能保證檢測線性范圍的同時，還能增強(qiáng)濁度顯示，保證了檢測的穩(wěn)定性?？刂婆c河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒的含量異常重要，對于檢測起到了核心作用。大粒徑顆粒(120-200 nm)的濃度、中粒徑顆粒(60-90 nm)濃度較大容易顯現(xiàn)濁度，小粒徑顆粒濃度0.1-0.2g/L，保證了檢測的線性范圍，這樣檢測效果最佳。
[0008]作為優(yōu)選，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0009]作為優(yōu)選，與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒的制備方法如下:
(1)、在離心管內(nèi)分別加入150-180μ L納米膠乳顆粒，1200-1400yL pH 7.4
0.01-0.03mol/L PBS緩沖液，河豚毒素單克隆抗體3株，300-400 μ L EDAC水溶液，磁力攪拌3-5小時，4°C, 12000g離心60-80min,棄上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超聲振蕩l-2min；
(3)、步驟(2)處理后的沉淀用等體積PBS緩沖液重懸后加入淬滅劑0.2mol/L甘氨酸溶液 300-400 μ L,攪拌 20-30min ；
(4)、4°C，1000g離心60-80min，去掉上清液，沉淀用等體積PBS緩沖液重懸后得河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒。
[0010]納米I父乳顆粒為市售廣品，廣品為乳液狀，廣品中納米I父乳顆粒含量為20%(w/v);EDAC水溶液濃度為0.2g/ml。河豚毒素單克隆抗體有三株，三株河豚毒素單克隆抗體與河豚毒素有不同結(jié)合位點(diǎn)，這樣檢測的靈敏度、特異性更好。
[0011]用河豚毒素單克隆抗體和帶氨基的納米膠乳顆粒進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，優(yōu)化緩沖液的濃度、pH、離心參數(shù)、超聲條件控制等，得到了檢測性能佳的與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(2)所述的超聲振蕩期間，超聲I秒，間隔3-4秒。
[0013]作為優(yōu)選，所述納米膠乳顆粒的粒徑為30-50nm、60-90nm或120_200nm。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:具有快速、簡便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，可以同時進(jìn)行大批量樣本快速測定，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0016]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0017]本發(fā)明的三株河豚毒素單克隆抗體是按照現(xiàn)有技術(shù)記載:王健偉等，抗河豚毒素單克隆抗體的制備及其特性的初步研究，衛(wèi)生研究，1996年，9月第25卷第5期，308-311頁記載的方法獲得(1G3、4G3、6D9三株)。
[0018]實(shí)施例1:
一種河豚毒素檢測試劑盒，所述河豚毒素檢測試劑盒包括以下成分:
A、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品:O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0019]B、緩沖體系:所述緩沖體系各組分及其濃度為:pH 7.4的PBS緩沖液0.0lmol/L,溴化己二甲銨lg/L,疊氮鈉0.lg/L,吐溫20 0.5mol/L,朽1檬酸1.6 g/L,牛血清白蛋白Ig/L。
[0020]C、檢測液，所述檢測液各組分及其濃度為:pH 7.4的PBS緩沖液0.01mol/L,疊氮鈉0.lg/L,與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒:其中粒徑為30nm的膠乳顆粒0.lg/L,粒徑為60nm的膠乳顆粒0.2g/L，粒徑為120nm的膠乳顆粒0.6g/L。
[0021]與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒的制備方法如下:
(1)、在離心管內(nèi)分別加入150μI納米膠乳顆粒(市售，產(chǎn)品中納米膠乳顆粒含量為20% (w/v)，粒徑為30nm、60nm或120nm分別得到三種規(guī)格的與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒)，1200 μ I pH 7.4 0.01mol/L PBS緩沖液，河豚毒素單克隆抗體3株(1G3、4G3、6D9三株)，300 μ I EDAC水溶液(濃度為0.2g/ml )，磁力攪拌3小時，4°C，12000g離心60min,棄上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超聲振蕩lmin，超聲振蕩期間，超聲I秒，間隔3秒；
(3)、步驟(2)處理后的沉淀用等體積PBS緩沖液(pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖液)重懸后加入淬滅劑0.2mol/L甘氨酸溶液300 μ 1，攪拌20min ；
(4)、4°C，1000g離心60min，去掉上清液，沉淀用等體積PBS緩沖液(pH7.4、
0.01mol/L的PBS緩沖液)重懸后得河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒。
[0022]D、河豚毒素濃縮樣品提取液10X各組分及其濃度為:甲醇10g/L，乙酸2g/L，乙酸銨 3g/L。
[0023]實(shí)施例2:
一種河豚毒素檢測試劑盒，所述河豚毒素檢測試劑盒包括以下成分:
A、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品:O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0024]B、緩沖體系:所述緩沖體系各組分及其濃度為:pH 7.4的PBS緩沖液0.03mol/L，溴化己二甲銨3g/L，疊氮鈉0.5g/L，吐溫20 1.5mol/L，檸檬酸0.8g/L，牛血清白蛋白3g/L。
[0025]C、檢測液，所述檢測液各組分及其濃度為:pH 7.4的PBS緩沖液0.03mol/L,疊氮鈉0.3g/L，與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒:其中粒徑為50nm的膠乳顆粒0.2g/L，粒徑為90nm的膠乳顆粒0.4g/L，粒徑為200nm的膠乳顆粒0.8 g/L。
[0026]與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒的制備方法如下:
(1)、在離心管內(nèi)分別加入180μI納米膠乳顆粒(市售，產(chǎn)品中納米膠乳顆粒含量為20% (w/v)，粒徑為50nm、90nm或200nm分別得到三種規(guī)格的與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒)，1400 μ I pH 7.4 0.03mol/L PBS緩沖液，河豚毒素單克隆抗體3株，400 μ IEDAC水溶液(濃度為0.2g/ml)，磁力攪拌5小時，4°C,12000g離心80min，棄上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超聲振蕩2min，超聲振蕩期間，超聲I秒，間隔4秒；
(3)、步驟(2)處理后的沉淀用等體積PBS緩沖液(pH7.4、0.03mol/L的PBS緩沖液)重懸后加入淬滅劑0.2mol/L甘氨酸溶液400 μ 1，攪拌30min ；
(4)、4°C，1000g離心80min，去掉上清液，沉淀用等體積PBS緩沖液(pH7.4、
0.03mol/L的PBS緩沖液)重懸后得河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒。
[0027]D、河豚毒素濃縮樣品提取液10X各組分及其濃度為:甲醇15g/L，乙酸5g/L，乙酸銨 Ig/Lο
[0028]實(shí)施例3:
一種河豚毒素檢測試劑盒，所述河豚毒素檢測試劑盒包括以下成分:
A、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品:O μ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L,100 μ g/L。
[0029]B、緩沖體系:所述緩沖體系各組分及其濃度為:pH 7.4的PBS緩沖液0.02mol/L,溴化己二甲銨2g/L,疊氮鈉0.3g/L,吐溫20 lmol/L,朽1檬酸lg/L,牛血清白蛋白2 g/L。
[0030]C、檢測液，所述檢測液各組分及其濃度為:pH 7.4的PBS緩沖液0.02mol/L,疊氮鈉0.2g/L，與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒:其中粒徑為40nm的膠乳顆粒0.15g/L，粒徑為70nm的膠乳顆粒0.3g/L，粒徑為160nm的膠乳顆粒0.7 g/L。
[0031]與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒的制備方法如下:
(1)、在離心管內(nèi)分別加入170μI納米膠乳顆粒(市售，產(chǎn)品中納米膠乳顆粒含量為20% (w/v)，粒徑為40nm、70nm或160nm分別得到三種規(guī)格的與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒)，1300μ I pH 7.4 0.02mol/L PBS緩沖液，河豚毒素單克隆抗體3株，350 μ IEDAC水溶液(濃度為0.2g/ml)，磁力攪拌4小時，4°C,12000g離心70min，棄上清液；
(2)、沉淀置于冰浴中，超聲振蕩1.5min，超聲振蕩期間，超聲I秒，間隔3秒；
(3)、步驟(2)處理后的沉淀用等體積PBS緩沖液(pH7.4、0.02mol/L的PBS緩沖液)重懸后加入淬滅劑0.2mol/L甘氨酸溶液350 μ 1，攪拌25min ；
(4)、4°C，1000g離心70min，去掉上清液，沉淀用等體積PBS緩沖液(pH7.4、
0.02mol/L的PBS緩沖液)重懸后得河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒。
[0032]D、河豚毒素濃縮樣品提取液1X各組分及其濃度為:甲醇12g/L，乙酸3g/L，乙酸銨 2g/L。
[0033]本發(fā)明的試劑盒產(chǎn)品具體規(guī)格如下:
組份名稱I劑量標(biāo)準(zhǔn)品X7瓶*_Iml/瓶緩沖體系_50ml
檢測液_15ml
河豚毒素濃縮樣品提取液1X |50ml
本發(fā)明的試劑盒產(chǎn)品:貯藏條件:保存試劑盒于2~8V ;保存期:該產(chǎn)品有效期為12個月。
[0034]河豚毒素濃縮樣品提取液1X使用時:用去離子水將河豚毒素濃縮樣品提取液1X按1:9體積比進(jìn)行稀釋，即:1份河豚毒素濃縮樣品提取液+9份去離子水，配好的樣品提取液在4°C環(huán)境可保存一個月。
[0035]樣品提取方法為:
河豚魚冷凍樣品，裝于密封塑料袋中于流水下急速解凍，整體魚用蒸餾水清洗后，用濾紙吸干，然后將魚分解成肌肉、肝臟、腸道、皮膚、卵巢(雄性為精束)等部分，用蒸餾水洗去血污，再用濾紙吸干，分別將解剖后取得的樣品剪碎，充分均質(zhì)。稱取上述均質(zhì)樣品1.0 g土 0.02g于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入樣品提取液ImL,潤流混合3min ;于4000印111,離心1min,取50 μ L分析。
[0036]樣本中的河豚毒素與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合，相鄰的膠乳顆粒彼此交聯(lián)，使測量溶液濁度增加，根據(jù)500nm處吸光度的增加，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可計算出樣本中河豚毒素的含量。
[0037]本發(fā)明的性能評價:
性能特征:線性范圍:2-100 Ug /L ;分析靈敏度:Λ A彡0.005/20 μ g/L ;測量精密度:CV ( 7.0% ;批間差彡10.0% ;穩(wěn)定性:12個月。可以大批量同時測定。
[0038]以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權(quán)利要求】
1.一種河豚毒素檢測試劑盒，其特征在于:所述河豚毒素檢測試劑盒包括以下成分: A、已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品； B、緩沖體系，所述緩沖體系各組分及其濃度為:pH7.4的PBS緩沖液0.01-0.03mol/L，溴化己二甲銨 l_3g/L，疊氮鈉 0.1-0.5g/L，吐溫 20 0.5-1.5mol/L，檸檬酸 0.8-1.6 g/L，牛血清白蛋白1-3 g/L ； C、檢測液，所述檢測液各組分及其濃度為:pH7.4的PBS緩沖液0.01-0.03mol/L,疊氮鈉0.1-0.3g/L，與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒:其中粒徑為30-50nm的膠乳顆粒0.1-0.2g/L，粒徑為60-90nm的膠乳顆粒0.2-0.4g/L，粒徑為120_200nm的膠乳顆粒0.6-0.8 g/L ； D、河豚毒素濃縮樣品提取液1X各組分及其濃度為:甲醇10-15g/L，乙酸2-5g/L，乙酸銨 l_3g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種河豚毒素檢測試劑盒，其特征在于:標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為Oμ g/L, 2 μ g/L, 5 μ g/L, 15 μ g/L, 25 μ g/L, 50 μ g/L, 100 μ g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種河豚毒素檢測試劑盒，其特征在于:與河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒的制備方法如下: (1)、在離心管內(nèi)分別加入150-180yL納米膠乳顆粒，1200-1400 μ L pH 7.40.01-0.03mol/L PBS緩沖液，河豚毒素單克隆抗體3株，300-400 μ L EDAC水溶液，磁力攪拌3-5小時，4°C, 12000g離心60-80min,棄上清液； (2)、沉淀置于冰浴中，超聲振蕩l-2min； (3)、步驟(2)處理后的沉淀用等體積PBS緩沖液重懸后加入淬滅劑0.2mol/L甘氨酸溶液 300-400 μ L,攪拌 20-30min ； (4)、4°C，1000g離心60-80min，去掉上清液，沉淀用等體積PBS緩沖液重懸后得河豚毒素單克隆抗體交聯(lián)的膠乳顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種河豚毒素檢測試劑盒，其特征在于:步驟(2)所述的超聲振蕩期間，超聲I秒，間隔3-4秒。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種河豚毒素檢測試劑盒，其特征在于:所述納米膠乳顆粒的粒徑為 30-50nm、60-90nm 或 120_200nm。
【文檔編號】G01N33/577GK104133063SQ201410251894
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】張小軍, 嚴(yán)忠雍, 梅光明, 龍舉 申請人:浙江省海洋水產(chǎn)研究所