一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明采用優(yōu)化樣品處理方法及優(yōu)化檢測條件的UPLC-MS/MS建立了離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的定性檢測方法，同時此方法又可以對8種類固醇類性激素進行定量分析，可以實現(xiàn)一次樣品制備、一次進樣分析，同時完成定性和定量分析，可以比較全面地反映離體魚性腺內(nèi)類固醇類性激素的化學(xué)組成成分，并且定量分析結(jié)果中八種類固醇類性激素的回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，測定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。本發(fā)明的方法通過對多成分類固醇類性激素含量的測定可以比較全面地反映性激素在性腺中累積、傳遞和代謝過程，為準確評估魚類的發(fā)育時期提供依據(jù)。
【專利說明】一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雖然近年來鰻鱺的人工繁殖初見成果，但對于在其性腺發(fā)育過程中性腺組織中的性腺激素含量會在不同階段，并且隨著不同激素的注射而有所改變，尤其是雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、17 α -輕孕酮、17 α , 20 β - 二輕~4~孕烯_3_酮(DHP)、睪酮、表睪酮對鰻鱺的成熟和產(chǎn)卵有著重要的影響。
[0003]在過去30年中，有大量的研究證實，睪酮和DHP 二者相互協(xié)調(diào)，共同激發(fā)著鰻鱺精子的形成；魚類中，腦垂體分泌GtH，GtH含兩種糖蛋白促性性腺激素(即LH和FSH)，進而促進雄魚血液中DHP和睪酮的分泌來調(diào)控性腺的發(fā)育與成熟；而在雌魚中，這兩種激素會促進分泌形成雌二醇，雌二醇會進而刺激肝臟合成與分泌卵黃蛋白原；另一方面同樣會刺激濾泡顆粒細胞分泌DHP，DHP是誘導(dǎo)卵巢最后成熟與排卵的重要激素。Katsumi Tsukamoto等對捕獲的日本鰻鱺通過RIA和TLC法對它們進行血清類固醇激素的檢測，發(fā)現(xiàn)在日本鰻魚排卵期間，DHP約lng/ml，而在人工催熟的日本鰻魚的同一期間沒有檢測這種類固醇激素，同時在人工繁殖的日本鰻魚的卵黃發(fā)生的中后期檢測血清中雌二醇(雌留體類激素)含量為2-3ng/ml，睪酮(精子發(fā)生誘導(dǎo)類固醇)在捕獲的雄性鰻魚體內(nèi)的含量是很高的(2-5ng/ml)，含量類似與人工繁殖的成熟雄鰻中。因此，準確掌握鰻鱺性腺組織中性激素周期性的濃度變化是決定人工繁殖鰻鱺成功與否的關(guān)鍵。
[0004]由于類固醇類激素在離體魚類性腺中的濃度通常很低，而離體魚類性腺作為魚類組織中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的器官，不僅蛋白質(zhì)含量高，而且油脂含量高，干擾物質(zhì)多，類固醇類激素作為脂溶性的激素，在提取的過程中很容易損耗。因此，本發(fā)明的目的在于建立可靠、穩(wěn)定的定性定量分析方法，并通過有效的富集、分離和純化過程實現(xiàn)高靈敏度、高專屬性分析，為進一步研究類固醇類激素在魚類性腺內(nèi)的代謝及消耗過程奠定基礎(chǔ)，為人工繁殖魚類提供科學(xué)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種UPLC-MS/MS檢測離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的方法。所述方法能夠?qū)﹄x體魚類性腺內(nèi)八種類固醇類性激素:雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17 α -羥孕酮、雌酮、17 α , 20 β - 二羥基_4_孕烯-3-酮(DHP)進行同時分析檢測。本發(fā)明的方法通過對多成分類固醇類性激素含量的測定可以比較全面地反映性激素在性腺中累積、傳遞和代謝過程，為準確評估魚類的發(fā)育時期提供依據(jù)。
[0006]為實現(xiàn)上述及其他目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]—種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法，為采用UPLC-MS/MS定性或定量檢測離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素，包括以下步驟:
[0008](I)供試品溶液的制備:稱取離體魚類性腺組織，經(jīng)前處理，得供試品溶液；
[0009](2)對照品溶液的制備:稱取未成熟離體魚類性腺組織樣品，加入類固醇類性激素標準品溶液，經(jīng)和步驟(I)相同的前處理，得對照品溶液；
[0010](3)測定:采用UPLC-MS/MS分別對供試品溶液和對照品溶液進行定性或定量檢測。
[0011]較佳的，所述魚類為花鰻鱺魚或河鰻(日本鰻鱺)。
[0012]較佳的，所述類固醇類性激素選自雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17 α-羥孕酮、雌酮或17 α，20 β-二羥基-4-孕烯-3-酮(DHP)中的一種或多種。
[0013]較佳的，步驟(I)中，所述前處理，包括如下步驟:
[0014]I)將離體魚類性腺組織樣品，加入勻漿介質(zhì)，勻漿，得勻漿液；
[0015]2)將所得勻漿液超聲，離心，冷凍；
[0016]3)將所得冷凍后的樣品，離心，取上清液進行過濾，將所得過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加步驟I)中所用勻漿介質(zhì)溶解，靜置；
[0017]4)離心，取上清液進行過濾，得續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0018]較佳的，步驟I)中，所述勻漿介質(zhì)為乙腈、甲醇中的任一種。
[0019]較佳的，步驟I)中，每Ig的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì)8_15ml。更佳的，每Ig的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì)10-15ml。
[0020]所述離體魚類性腺組織樣品稱取時，應(yīng)當(dāng)精密稱取。
[0021]所述甲醇為100%甲醇。
[0022]較佳的，步驟I)中，勻漿時可采用兩步勻漿法，亦即，第一步:每Ig的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì)4-6ml，以5000-10000RPM速度勻漿3_8min，得一次勻漿液；第二步:分離所得一次勻漿液，得一次勻漿液上清液和剩余沉淀，向每Ig剩余沉淀中加入4-6ml的勻漿介質(zhì)，以5000-10000RPM速度勻漿3-8min得二次勻漿液，用勻漿介質(zhì)清洗勻漿機刀頭得勻漿機刀頭清洗液，最后合并一次勻漿液上清液、二次勻漿液和勻漿機刀頭清洗液。
[0023]較佳的，所述兩步勻漿法中，第一步中，每Ig的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì) 4-5ml，以 5000-10000RPM 速度勻漿 3_5min。
[0024]較佳的，所述兩步勻漿法中，第二步中，每Ig的剩余沉淀中加入4_5ml的勻漿介質(zhì)，以 5000-10000RPM 速度勻漿 3_5min。
[0025]較佳的，步驟2)中，超聲時間為5-10min。更佳的，超聲時間為5min。
[0026]較佳的，步驟2)中，所述離心為:在0-4°C下，3000-5000RMP離心3-8min ;更佳的，所述離心為:在CTC下,4000RMP離心5min。
[0027]較佳的，步驟2)中，所述冷凍為:-20°C?_40°C下冷卻2_8h ;更佳的，所述冷凍為在-40°C下冷凍4—6h。
[0028]較佳的，步驟3)中，離心為:在0-4°C的下，以3000-5000RMP離心3-5min ;更佳的，所述離心為:在0°C下，以4000RMP離心4min。
[0029]較佳的，步驟3)中，過濾是指通過脫脂棉進行過濾。
[0030]較佳的，步驟3)中，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的溫度為35_50°C ;更佳為40°C。[0031]較佳的，步驟4)中，所述過濾是指:取上清液過濾膜，放棄初濾液后，即得續(xù)濾液。
[0032]較佳的，步驟I)、2)中，采用D-SPE試管⑵；產(chǎn)品信息為:Supertech Q R1A，cat.#55250-1Αο
[0033]較佳的，步驟3)中，加勻漿介質(zhì)后轉(zhuǎn)移至D-SPE試管(3);產(chǎn)品信息為=SupertechQMl, cat.#55260-1Βο
[0034]較佳的，步驟⑵中，類固醇類性激素標準品溶液的配制方法為:分別精密稱取類固醇類性激素標準品適量，加與步驟(I)相同的勻漿介質(zhì)溶解，得標準品溶液，使標準品溶液中每種類固醇類激素的濃度均相同。更佳的，標準品溶液中每種類固醇類激素的濃度均為 lOOppm。
[0035]較佳的，步驟⑵中，17 α-羥孕酮購自TRC公司，雌三醇購自Fluka公司，其余標準品均購自sigma-aldrich公司。
[0036]較佳的，雌二醇的CAS號為50-28-2 ;雌三醇的CAS號為50_27_1 ;睪酮的CAS號為58-22-0 ;表睪酮的CAS號為481-30-1 ;孕酮的CAS號為57-83-0 ; 17 α -羥孕酮的CAS號為68-96-2 ;雌酮的 CAS 號為 53-16-7 ;17 α，20 β - 二羥基 ~4~ 孕烯-3-酮(DHP)的 CAS 號為1662-06-2。
[0037]較佳的，步驟(3)中，所述定性方法為:采用UPLC-MS/MS在相同色譜條件下分別測定供試品溶液和對照品溶液，將獲得的供試品溶液的色譜圖，與對照品溶液的色譜圖進行比較，根據(jù)相對保留時間和特征碎片離子峰的荷質(zhì)比m/z，確認供試品溶液中類固醇類性激素的特征峰，從而對供試品溶液中類固醇類性激素成分進行定性。
[0038]較佳的，所述步驟(3)中，所述定量方法為:采用UPLC-MS/MS在相同色譜條件下分別測定供試品溶液和對照品溶液，獲得供試品溶液和對照品溶液的類固醇類性激素色譜圖及其峰面積，按照內(nèi)標法計算供試品溶液中種類固醇類性激素的含量。
[0039]較佳的，所述內(nèi)標法是指:分別移取一系列不同體積的類固醇類性激素標準品溶液分別加入到未成熟離體魚類性腺組織樣品中，經(jīng)與制備供試品溶液時相同的前處理，得一系列不同濃度的對照品溶液。采用UPLC進樣分析，獲得對照品溶液中類固醇類性激素含量與峰面積的線性關(guān)系，以每一種類固醇類性激素色譜峰面積對應(yīng)其相應(yīng)的含量，繪制相應(yīng)的標準工作曲線，計算得到各標準工作曲線的回歸方程。再將供試品溶液采用UPLC檢測，將獲得的供試品溶液中類固醇類性激素的色譜峰面積，分別代入相應(yīng)的標準工作曲線的回歸方程中，計算可得到相應(yīng)類固醇類性激素的含量。
[0040]較佳的，類固醇類性激素標準品溶液的配置方法為:分別精密稱取類固醇類性激素標準品適量，加與步驟(I)相同的勻漿介質(zhì)溶解，得標準品溶液，使標準品溶液中每種類固醇類激素的濃度均相同。更佳的，標準品溶液中每種類固醇類激素的濃度均為lOOppm。
[0041]較佳的，步驟(3)中，UPLC所用色譜柱為 xBridge_C18 (IOOmmX 2.1mm, 5 μ m)。
[0042]較佳的，柱溫為30?50°C，優(yōu)選40V。
[0043]較佳的，流速為0.25 ?0.4ml/min,優(yōu)選 0.30mL/min。
[0044]較佳的，流動相中，A相為0.1%甲酸水溶液(體積百分含量)，B相為0.25mol/L的乙酸銨水溶液，A相與B相的體積比為95:5-0:100。
[0045]較佳的，分析時間為12min，梯度洗脫。
[0046]進一步的，所述梯度洗脫以流動相A相與B相體積比為95:5_0:100梯度變化洗脫。
[0047]優(yōu)選的，所述梯度洗脫的具體程序為:
[0048]O ?IOmin, A 相:B 相體積比為 95:5_0:100 ；
[0049]10 ?12min, A 相:B 相體積比為 O:100-95:5。
[0050]較佳的，步驟(3)中，MS/MS的色譜條件為:睪酮、表睪酮、孕酮、17α -羥孕酮、DHP均采用正離子模式掃描，雌酮、雌二醇、雌三醇均采用負離子模式掃描。
[0051]本發(fā)明的有益效果為:
[0052](I)如上所述，本發(fā)明采用優(yōu)化樣品處理方法及優(yōu)化檢測條件的UPLC-MS/MS建立了離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的定性檢測方法，同時此方法又可以對8種類固醇類性激素進行定量分析，可以實現(xiàn)一次樣品制備、一次進樣分析，同時完成定性和定量分析。
[0053](2)由于類固醇類激素在離體魚類性腺中的濃度通常很低，而離體魚類性腺作為魚類組織中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的器官，不僅蛋白質(zhì)含量高，而且油脂含量高，干擾物質(zhì)多，類固醇類激素作為脂溶性的激素，在提取的過程中很容易損耗。本發(fā)明的特殊設(shè)計的前處理過程實現(xiàn)了對離體魚性腺組織內(nèi)的類固醇類激素的有效富集、分離和純化，為實現(xiàn)高靈敏度、高專屬性分析奠定基礎(chǔ)。
[0054](3)為了簡化流動相的配制和保護色譜柱，在不影響分離的前提下，我們試驗得到了理想的流動相系統(tǒng):0.lv/v%甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸銨水溶液系統(tǒng)，這種流動相系統(tǒng)在梯度洗脫條件下能使被分離化合物保持較好的分離度和峰形。
[0055](4)本發(fā)明通過對類固醇類性激素的定性和定量分析，可以比較全面的反映離體魚性腺內(nèi)類固醇類性激素的化學(xué)組成成分，并且定量分析結(jié)果中種類固醇類性激素的回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，測定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。本發(fā)明的方法通過對多成分類固醇類性激素含量的測定可以比較全面的反映性激素在性腺中累積、傳遞和代謝過程，為準確評估魚類的發(fā)育時期提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1:圖中I列、2列、3列所示分別為空白對照品組溶液的離子流色譜圖、對照品組溶液的離子流色譜圖、供試品組溶液的離子流色譜圖；具體的:A行代表可的松(一種應(yīng)激反應(yīng)激素)定性離子流色譜圖，B行代表可的松定量離子流色譜圖；(:行代表雌三醇定性離子流色譜圖；D行代表雌三醇定量離子流色譜圖；E行代表雌二醇定性離子流色譜圖，F(xiàn)行代表雌二醇定量離子流色譜圖；G行代表雌酮定性離子流色譜圖，H行代表雌酮定量離子流色譜圖；1行代表DHP定性離子流色譜圖，J行代表DHP定量離子流色譜圖；K行代表17 α -羥孕酮定性離子流色譜圖，L行代表17 α -羥孕酮定量離子流色譜圖；Μ行代表孕酮定性離子流色譜圖，N行代表孕酮定量離子流色譜圖；0行保留時間靠前的峰代表睪酮定性離子流色譜圖，保留時間靠后的峰代表表睪酮定性離子流色譜圖，P行保留時間靠前的峰代表睪酮定量離子流色譜圖，保留時間靠后的峰代表表睪酮定量離子流色譜圖。
【具體實施方式】
[0057]下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。[0058]以下實施例中采用的材料、試劑和儀器如下:
[0059]甲醇、甲酸(分析純，國藥集團)；乙腈(色譜純，美國天地試劑公司)；雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17 α-羥孕酮、雌酮、17 α，20β-二羥基-4-孕甾烯-3-酮(DHP)(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)；具塞錐形瓶、移液管及其相關(guān)玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司)；色譜柱:xBridge-C18 (250mmX 4.6mm，5 μ m)(沃特世科技有限公司)；超聲萃取儀(寧波新芝生物有限責(zé)任公司)；WaterS超高效液相系統(tǒng)(ACQUITYUPLC)和三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(XEVO-TQ) ；PL2002型電子天平；均質(zhì)儀(Polytron，PT2000, Switerland);冷凍離心機(Type3K-18, Sigma, Germany) ;Heidolph 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(He1-VAP Value HB) ;Heidolph振動器(Multi Reax);三洋_40°C超低溫冰箱；水由純水儀(Millipore,法國)純化得到。
[0060]實施例1離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的定性測定
[0061]I實驗部分
[0062]1.1樣品前處理
[0063](I)供試品溶液的制備:
[0064]精密稱定5.0g的離體花鰻鱺魚性腺組織樣品于50mL D-SPE試管(2) (SupertechQ RlA, cat.#55250-1Α)，精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度勻漿2?4min，分離上清液與剩余沉淀；然后再向沉淀中精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度勻漿2?4min，合并兩次勻漿的上清液與沉淀至試管(2)中；隨后用吸管吸取乙腈清洗刀頭，用同一試管(2)下方收集，直至液面到達50mL刻度線；將試管(2)充分混勻震蕩，并超聲5min ；以4000RMP離心5min，再將試管放置于_40°C冰箱的金屬試管套中冷凍4_6h ;將冷凍好的樣品在0°C下4000RMP離心4min，從離心好的試管中液體立即取40mL，并通過脫脂棉過濾至到雞心瓶，在40°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干；取0.75mL, 70 %乙腈洗滌雞心瓶，并轉(zhuǎn)移至D-SPE試管(3)(Supertech QMl, cat.#55260_1B)，再用0.75mL，70 %乙腈重復(fù)洗滌一次，并轉(zhuǎn)移至同一D-SPE試管(3)，充分混勻后，以靜止2min，以4000RMP離心3min，取ImL上清液經(jīng)微孔濾膜(0.22μπι，特富龍)過濾，取續(xù)濾液至1.5mL進樣瓶中，作為供試品溶液，用于分析測定。
[0065](2)對照品溶液的制備:
[0066]首先，配制類固醇類性激素標準品溶液:分別精密稱取雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17 α-羥孕酮、雌酮、17 α，20 β-二羥基-4-孕烯-3-酮(DHP)標準品適量，力口乙腈溶解并定容，搖勻，得到標準品溶液，使標準品溶液中每一種類固醇類激素的濃度均為lppm，之后經(jīng)過稀釋，使標準品中的每一種類固醇類激素的濃度均為lOOppb。
[0067]精密稱定5.0g的未成熟離體花鰻鱺魚性腺組織樣品于不同的50mL D-SPE試管
(2)(Supertech Q RlA, cat.#55250_1A),分別向六個(2)試管中加入已配制好的類固醇類性激素標準品溶液50ul、IOOul、250ul、500ul、IOOOul、2000ul，經(jīng)和供試品溶液相同的前處理，得一系列每種類固醇類性激素濃度分別為1.00,2.00,5.00，10.00,20.00,40.00ng/g的對照品溶液；
[0068](3)空白對照品溶液的制備:
[0069]精密稱定5.0g的未成熟離體花鰻鱺魚性腺組織樣品，經(jīng)和供試品溶液相同的前處理，得空白對照品溶液。
[0070]1.2色譜條件[0071]UPLC 的色譜條件為:色譜柱:xfcidge-C18 (IOOmmX 2.1mm, 5 μ m);柱溫:40°C ;流速:0.30mL/min ;進樣量:10 μ I ;流動相:0.lv/v%甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸銨水溶液，其中，A相為0.lv/v%甲酸水溶液，0.25mol/L乙酸銨水溶液；分析時間:12min ;梯度洗脫。梯度洗脫的具體程序為:
【權(quán)利要求】
1.一種離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素的檢測方法，為采用UPLC-MS/MS定性或定量檢測離體魚類性腺內(nèi)類固醇類性激素，包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:稱取離體魚類性腺組織，經(jīng)前處理，得供試品溶液； (2)對照品溶液的制備:稱取未成熟離體魚類性腺組織樣品，加入類固醇類性激素標準品溶液，經(jīng)和步驟(1)相同的前處理，得對照品溶液； (3)測定:采用UPLC-MS/MS分別對供試品溶液和對照品溶液進行定性或定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述類固醇類性激素選自雌二醇、雌三醇、睪酮、表睪酮、孕酮、17 α -輕孕酮、雌酮或17 α，20 β - 二羥基_4_孕烯_3_酮中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，所述前處理，包括如下步驟: 1)將離體魚類性腺組織樣品，加入勻漿介質(zhì)，勻漿，得勻漿液； 2)將所得勻漿液超聲，離心，冷凍； 3)將所得冷凍后的樣品，離心，取上清液進行過濾，將所得過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加步驟I)中所用勻漿介質(zhì)溶解，靜置； 4)離心，取上清液進行過濾，得續(xù)濾液作為供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)中，所述勻漿介質(zhì)為乙腈、甲醇中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)中，每Ig的離體魚類性腺組織樣品中加入勻衆(zhòng)介質(zhì)8-15ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)中，勻漿時可采用兩步勻漿法，亦即，第一步:每Ig的離體魚類性腺組織樣品中加入勻漿介質(zhì)4-6ml，以5000-10000RPM速度勻漿3-8min，得一次勻漿液；第二步:分離所得一次勻漿液，得一次勻漿液上清液和剩余沉淀，向每Ig剩余沉淀中加入4-6ml的勻漿介質(zhì)，以5000-10000RPM速度勻漿3_8min得二次勻漿液，用勻漿介質(zhì)清洗勻漿機刀頭得勻漿機刀頭清洗液，最后合并一次勻漿液上清液、二次勻漿液和勻漿機刀頭清洗液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中，超聲時間為5-10min;所述離心為:在0-4°C下，3000-5000RMP離心3_8min ;所述冷凍為:_20°C~_40°C下冷卻2-8h。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟3)中，離心為:在0-4°C的下，以3000-5000RMP離心3_5min ;所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的溫度為35_50°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟3)中，UPLC所用色譜柱為xBridge-C18 ;UPLC所用流動相中，A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.25mol/L的乙酸銨水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，MS/MS的色譜條件為:睪酮、表睪酮、孕酮、17 α -羥孕酮和DHP均采用正離子模式掃描，雌酮、雌二醇和雌三醇均采用負離子模式掃描。
【文檔編號】G01N30/88GK104020240SQ201410255297
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】林靜, 劉利平, 湛嘉 申請人:上海海洋大學(xué)