一種競爭elisa試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法
【專利摘要】一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標(biāo)板；再將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標(biāo)板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標(biāo)板的板孔中，水浴后用PBST洗滌，再向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應(yīng)，測得各板孔的OD450值，計算各板孔的抑制率。本發(fā)明利用建立的cELISA方法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9和大腸桿菌O157高免陽性血清進行檢測，PI值均低于30%，可以有效地排除假陽性結(jié)果的發(fā)生。
【專利說明】—種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及對牛、羊的布魯氏菌病的一種檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌引起的一種重要的人獸共患病，反芻動物特別是牛和羊容易感染。根據(jù)抗原型和宿主類型將布魯氏菌分為6類，患病母畜一般癥狀是流產(chǎn)，雄性則引起不育等生殖障礙。近幾年在世界范圍內(nèi)布病呈現(xiàn)出反彈的趨勢，在中國，牛種布魯氏菌(B.abortus)和羊種布魯氏菌(B.melitensis)造成的危害尤為廣泛和嚴(yán)重,該病給畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生事業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，加強對布病的防控具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]對布病進行準(zhǔn)確診斷是防止該病蔓延的首要措施，常見的布病血清學(xué)診斷方法主要有凝集試驗、補體結(jié)合試驗(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和熒光偏振試驗(FPA)。由于牛種布魯氏菌和某些桿菌(最主要的是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌09、大腸桿菌0157)在脂多糖鏈(LPS)上存在共同的抗原位點，一般認為這些抗原位點屬于脂多糖上可溶的蛋白類物質(zhì)，因此血清學(xué)檢測中往往因為交叉反應(yīng)的存在而造成假陽性結(jié)果。相對而言，凝集試驗的特異性和敏感性均較低，在一些發(fā)達國家已停止使用。CFT雖然特異性和敏感性均比較高，但由于操作繁瑣，不適合常規(guī)檢驗，更不適合高通量檢測，往往只用于確診或作為其它診斷方法的仲裁。利用單克隆抗體(Mab)建立的檢測動物血清中抗體的競爭ELISA (cELISA)方法已然成為目前檢測布病的可靠方法之一。
[0004]目前為止，已制備針對位于脂多糖O鏈上(O-LPS)的A抗原、M抗原、C抗原和C/Y抗原的單克隆抗體；另一方面，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)某些特定的外膜蛋白也存在免疫原性，如0MP31等利用這些單克隆抗體建立的cELISA方法早已應(yīng)用于對布病的血清學(xué)檢測，但由于不同單抗靈敏度和特異性等因素的限定，以及交叉反應(yīng)的干擾，在實際檢測當(dāng)中往往會出現(xiàn)漏檢、錯檢的結(jié)果。事實上，經(jīng)本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，利用補體結(jié)合實驗(CFT)和已建立的cELISA方法在檢測臨床樣品時存在一定的不吻合率，特別是對一些介于陰性和陽性之間的疑似樣品的判定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提出一種能夠提高檢測準(zhǔn)確性的競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟:
1)將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標(biāo)板；
2)將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標(biāo)板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標(biāo)板的板孔中，37°C水浴I小時后，用PBST洗滌，再向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應(yīng)； 3)測得各板孔的0D450值；
4)由公式IOOX(1-OD陰性對照/OD待檢樣品)％分別計算各板孔的抑制率；
其中，ODb31wm為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和已知的陰性血清的D45tl值畑_#@為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的 OD45tl 值；
5)判定待檢血清樣品:抑制率>30%，則判定待檢血清樣品為陽性。
[0007]本發(fā)明采用單克隆抗體Bru_5C10建立的cELISA通過軟件的ROC分析給出的最佳臨界值PI=25%，此時特異性為96.3%，敏感度為99.1% ;為了提高檢測過程中的特異性，本發(fā)明選擇PI=30%作為臨界值，此時特異性為98.8%，敏感度為96.2%。
[0008]本發(fā)明利用建立的cELISA方法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌09和大腸桿菌0157高免陽性血清進行檢測，PI值均低于30%，說明本發(fā)明可以有效地排除假陽性結(jié)果的發(fā)生。
[0009]為了建立更準(zhǔn)確的檢測布病的cELISA方法，本發(fā)明利用滅活的牛種布魯氏菌2308免疫小鼠，通過細胞融合技術(shù)獲得I株對牛種布魯氏菌有良好反應(yīng)性的單克隆抗體，命名為單克隆抗體bru-5C10。本發(fā)明的單克隆抗體bru-5C10為雜交瘤細胞株bru_5C10分泌獲得。
[0010]本發(fā)明的單克隆抗體bru-5C10，于2014年5月7日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC N0.9219，
生物材料:Bru-5C10，分類命名:雜交瘤細胞株。
[0011]另外，將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99按1.75μδ/孔溶于ρΗ=9.6的碳酸鹽緩沖液中，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標(biāo)版中，4°C孵育12h，棄去酶標(biāo)板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標(biāo)版中，封閉后于37°C放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標(biāo)板。該酶標(biāo)板包被抗原的獲得采用超聲裂解法，相對于熱酚法降低了繁瑣度并保證了有效性；其中包被過程中，各條件的選擇都采用控制單一變量原則經(jīng)實驗分析得出，保證了最佳反應(yīng)性。
[0012]所述超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99的方法是:用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(簡稱:TSA，由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化鈉、瓊脂等組成)上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80°C水浴滅活2h后調(diào)節(jié)菌液濁度，使其濁度約為lX101(lCFU/ml ;然后以頻率為30HZ的超聲裂解破碎菌體3?4次，15min/次。
[0013]本研究所建立的檢測牛布氏桿菌病的cELISA方法，通過對320份臨床牛血清樣品的檢測并與商品化布病cELISA試劑盒(Svanova公司)比較，結(jié)果顯示兩者的符合率為95.6%，且經(jīng)第三方實驗(補體結(jié)合實驗)驗證不吻合樣品，本研究所建立的方法有更高的符合率。其意義在于本方法對布氏桿菌病的血清學(xué)檢測特異性更強，敏感性更好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為單抗Bru_5C10的免疫印跡試驗圖。
【具體實施方式】
[0015]一、通過細胞融合技術(shù)獲得對牛種布魯氏菌有良好反應(yīng)性的單克隆抗體bru-5C10:取經(jīng)過常規(guī)免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按照標(biāo)準(zhǔn)程序進行細胞融合。收集雜交瘤細胞上清，用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗法(iELISA)篩選與牛種布魯氏菌A99粗提的LPS具有強反應(yīng)，而與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌09粗提的LPS無反應(yīng)的陽性雜交瘤細胞株。按照有限稀釋法進行2次亞克隆獲得單克隆抗體bru-5C10。
[0016]二、單克隆抗體bru_5C10的保存證明信息:
保藏號CGMCC N0.9219，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日:2014年5月7日。生物材料:Bru-5C10，分類命名:雜交瘤細胞株。
[0017]三、制作牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標(biāo)板:
用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(簡稱:TSA。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化鈉、瓊脂等組成)上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80°C水浴滅活2h，調(diào)節(jié)菌液濁度，使其濁度約為I X 1010CFU/ml ;然后再利用超聲裂解破碎菌體:超聲頻率為30HZ，15min/次，進行3~4次。
[0018]將超聲裂解處理過的牛種布魯氏菌A99按1.75μδ/孔溶于ρΗ=9.6的碳酸鹽緩沖液中，100μΙ/孔加入酶標(biāo)版中，4°C孵育12h。棄去酶標(biāo)板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，100μΙ/孔加入酶標(biāo)版中，封閉后于37°C放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標(biāo)板。
[0019]四、檢測試驗:
以PBST為緩沖液， 將待檢樣本稀釋20倍，待用。
[0020]以PBST為緩沖液，分別將牛的陰性血清和陽性血清稀釋20倍，待用。
[0021]向包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標(biāo)板的各孔分別加入50μ1稀釋后的待檢樣品和50μ1用PBST按照1:4000進行稀釋的單克隆抗體Bru_5C10。
[0022]同時取標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽性血清作為陰陽對照組，向包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標(biāo)板的A1-A2孔中分別加入50μ1稀釋后的陰性血清和50μ1工作濃度的單克隆抗體bru-5C10，向包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標(biāo)板的A3-A4孔中分別加入50μ1稀釋后的陽性血清和50μ1工作濃度的單克隆抗體bru-5C10。
[0023]分別將各孔中的體系充分混勻后，將酶標(biāo)板在37°C孵育30min后，再分別以PBST洗滌4次。再向每孔加入100μΙ HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育30min后，以PBST洗滌5次。然后加入底物顯色液室溫作用IOmin,以2M硫酸終止。
[0024]分別讀取各孔的0D450值。
[0025]OD83ft5iwS加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru_5C10和已知的陰性血清的板孔的OD45tl值加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的OD45tl值。
[0026]并根據(jù)公式100 X (1-0D陰性對照/OD待檢樣品)%分別計算抑制率(PI)。
[0027]計算結(jié)果:已知的陽性血清相應(yīng)的抑制率(PI)≥30%,已知的陰性血清相應(yīng)的抑制率(PI) < 30%。
[0028]以此為標(biāo)準(zhǔn)，將待檢樣本各孔的抑制率(PI)進行加合后求平均值，如平均值為^ 30%，則待檢樣本為陽性；如平均值為< 30%，則待檢樣本為陰性。
[0029]五、cELISA的重復(fù)性:經(jīng)重復(fù)性實驗結(jié)果證明，本發(fā)明所建立的cELISA批內(nèi)重復(fù)性的平均變異系數(shù)為2.2% ;批間重復(fù)性的平均變異系數(shù)為5.9%，表明該cELISA方法具有良好的可重復(fù)性。
[0030]六、試劑盒中的單克隆抗體與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌09、大腸桿菌0157沒有交叉反應(yīng)。
[0031]如圖1的單抗Bru_5C10的免疫印跡試驗圖所示，其中:
I顯示了牛種布魯氏菌S2308超聲裂解后的上清液與單抗Bru-5C10反應(yīng)結(jié)果；
2顯示了牛種布魯氏菌A99超聲裂解后上清液與單抗Bru-5C10反應(yīng)結(jié)果；
3顯示了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌09超聲裂解后上清液與單抗Bru-5C10反應(yīng)結(jié)果；
4顯示了大腸桿菌0157超聲裂解后上清液與單抗Bru-5C10反應(yīng)結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99包被ELISA酶標(biāo)板； 2)將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品加入酶標(biāo)板的板孔中；并同時分別將抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10分別和已知的陰、陽性血清加入酶標(biāo)板的板孔中，37°C水浴后，用PBST洗滌，向各板孔中分別加入抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體，孵育洗滌后，進行顯色反應(yīng)； 3)測得各板孔的OD45tl值； 4)由公式100X(1-OD陰性對照/OD待檢樣品)％分別計算各板孔的抑制率； 其中，ODPj3ft5iw為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和已知的陰性血清的板孔的OD45tl值；00#|&#@為加入了抗布魯氏菌特異單克隆抗體bru-5C10和稀釋的待檢血清樣品的板孔的OD45tl值； 5)判定待檢血清樣品:抑制率>30%，則判定待檢血清樣品為陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于單克隆抗體bru-5C10為雜交瘤細胞株bru-5C10分泌獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于將超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99按1.75μδ/孔溶于pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標(biāo)版中，4°C孵育12h，棄去酶標(biāo)板中的液體后，用PBST配制的5%脫脂乳，ΙΟΟμΙ/孔加入酶標(biāo)版中，封閉后于37°C放置，3h后棄去封閉液，再用PBST洗滌2次，即得包被牛種布魯氏菌A99的ELISA酶標(biāo)板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述競爭ELISA試劑盒檢測牛布氏桿菌病的方法，其特征在于所述超聲裂解處理的牛種布魯氏菌A99的方法是:用生理鹽水洗下在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上生長的牛種布魯氏菌S2308，置于80°C水浴滅活2h后調(diào)節(jié)菌液濁度，使其濁度約為I X 1010CFU/ml ;然后以頻率為30HZ的超聲裂解破碎菌體3?4次，15min/次。
【文檔編號】G01N33/577GK103995123SQ201410266781
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】秦愛建, 王志明, 丁家波, 邵紅霞, 錢琨, 馮忠武 申請人:揚州大學(xué)