一種信號放大技術(shù)電化學傳感器檢測dna的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種信號放大技術(shù)電化學傳感器制備方法及應(yīng)用。首先制備金-鉑納米粒子，并以硫堇為電化學試劑將其固定在金-鉑納米粒子表面，再將探針DNA通過固定在納米粒子表面，制得電化學探針。同時將發(fā)卡DNA自組裝在金電極表面得電化學傳感器。在電化學傳感器上加入目標DNA時，目標DNA與組裝在金電極表面表面上的發(fā)卡DNA部分互補配對打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)。然后另外一條發(fā)卡DNA鏈通過競爭作用取代目標鏈DNA，從而釋放目標鏈DNA。釋放的目標鏈則繼續(xù)打開電極表面的其他的發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA，如此的循環(huán)作用實現(xiàn)了目標鏈DNA的循環(huán)使用，結(jié)合制備的電化學探針，實現(xiàn)對目標DNA的測定。本發(fā)明的傳感器具有很高的選擇性和檢測靈敏度；金-鉑納米粒子為載體負載硫堇為探針具有電化學穩(wěn)定的優(yōu)勢?！緦＠f明】—種信號放大技術(shù)電化學傳感器檢測DNA的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于分析化學和電化學【
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】，涉及一種信號放大技術(shù)電化學傳感器制備方法及應(yīng)用。另外，本發(fā)明還涉及采用所述的電化學傳感器檢測DNA的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]檢測特定序列DNA在臨床診斷、基因治療以及其他生物醫(yī)學研究上是十分重要的。因此，建立高靈敏度快速檢測特定序列的DNA的方法是十分必要的。[0003]一般情況下，檢測DNA都是基于DNA雜交來實現(xiàn)的。為了讀出雜交反應(yīng)，通常的方法是對目標DNA的部分互補序列進行標記。一般采用熒光、電化學發(fā)光、化學發(fā)光物質(zhì)等標記目標DNA的部分互補序列制得DNA探針，根據(jù)雜交反應(yīng)后DNA探針的信號強度測定目標DNA的濃度。然而，由于生物體系中目標DNA的濃度極低，必須采用適當?shù)臋z測方法提高傳感器的靈敏度。因此，一些基于信號放大的DNA檢測方法得到T發(fā)展:酶切循環(huán)信號放大技術(shù)[HunX.,LiuF.,MeiZ.H.,et.al.,Signalamplifiedstrategybasedontarget-1nducedstrandreleasecouplingcleavageofnickingendonucleasefortheultrasensitivedetectionofochratoxinA,BiosensorsandBioelectronics,2013，39，145-151]，滾環(huán)放大技術(shù)[WenY.Q.，XuΥ.，MaoX.Η.，et.al.,DNAzyme-BasedRolling-CircleAmplificationDNAMachineforUltrasensitiveAnalysisofMicroRNAinDrosophilaLarva,Anal.Chem.2012,84,7664-7669]，聚合酶鏈反應(yīng)[HartmanM.R.,YangD.Y.,TranT.N.N.,et.al.,ThermostablebranchedDNAnanostructuresasmodularprimersforpolymerasechainreaction,AngewandteChemieInternationalEdition,2013,52,8699-8702]，環(huán)介導等溫擴增[DhamaΚ.,KarthikK.,ChakrabortyS.,et.al.,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA(LAMP):Anewdiagnostictoollightstheworldofdiagnosisofanimalandhumanpathogens:Areview,PakistanJournalofBiologicalSciences,2014,17,151-166]等。這些方法各有其優(yōu)點，能不同程度的滿足對DNA的檢測要求，但靈敏度不高。所以必須發(fā)展一種靈敏度高，簡單，穩(wěn)定的檢測方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種信號放大技術(shù)電化學傳感器制備方法及應(yīng)用。以及提供一種采用所述的電化學傳感器檢測DNA的方法。[0005]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:[0006]本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的:一種信號放大技術(shù)電化學傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟:[0007](I)金-鉬納米粒子的制備；[0008](2)電化學探針的制備；[0009](3)電化學傳感器的制備；[0010]本發(fā)明所述的金-鉬納米粒子的制備包括以下步驟:把制備和儲備金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用；在1000mL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰，然后快速加入5mL38.8mM的檸檬酸鈉(NaC6H5O7)，溶液變?yōu)榫萍t色時，向溶液中依次加入5mL4.0XIO^moir1的HPtCl6,lSmLlOgL—1的PVP，攪拌加熱至沸騰后繼續(xù)加熱2h。溶液由酒紅色變?yōu)樽睾稚?，制得AuOPtNPs(金-鉬納米粒子)，轉(zhuǎn)移至棕色瓶，4°C儲存?zhèn)溆?。[0011]本發(fā)明所述的電化學探針的制備包括以下步驟:首先，取2mL的離心管，加入10μLDNAl和10μLρΗ8.2，50mM的Tris-HCl緩沖溶液，10μLTCEP反應(yīng)lh，用以活化巰基；然后，另取2mL離心管依次加入ImL金-鉬納米粒子和1000μL硫堇溶液反應(yīng)0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上；將吸附了硫堇的金-鉬納米粒子加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應(yīng)16h。使巰基DNAl與金-鉬納米粒子連接起來；最后在15000轉(zhuǎn)速下,離心30min,得到紅色沉淀，并用IOmM,pH8.0的磷酸緩沖溶液洗漆三次,分散在IOmM,PH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針，4°C避光保存。[0012]本發(fā)明所述的電化學傳感器的制備包括以下步驟:[0013]1.金電極的預(yù)處理[0014]金電極經(jīng)0.05μπι的α-Α1203拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹干；采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3[Fe(CN)6]溶液中，設(shè)置電壓為O~0.8V，對金電極進行循環(huán)伏安(CV)掃描；若氧化還原電流峰在O~1000mV內(nèi)，則已說明電極表面已被處理好。否則重新處理，直至符合要求為止；測完后，用二次水沖洗電極，吹干電極表面，備用。[0015]2.金納米粒子修飾金電極制備[0016]首先取10μLAuNPs(直徑15nm)滴涂在金電極表面,得金納米粒子修飾金電極(AuNPs/GE)，置于避光處自然晾干。[0017]3.發(fā)卡DNA的預(yù)處理[0018]取一定量的KT6M的巰基DNA4(或DNA3)于2mL離心管中，置于95°C恒溫水浴槽中加熱5min，取出后立即置于冰水中冷卻Imin即得到發(fā)卡DNA。[0019]4.電化學傳感器的制備[0020]取10μL上述發(fā)卡DNA3滴涂在AuNPs/GE表面，4°C自組裝24h;接著取10μLKT4M的巰基乙醇滴于電極表面，反應(yīng)30min，然后用IOmM的磷酸緩沖溶液沖洗兩次，即得電化學傳感器。[0021]一種利用上述方法制備的電化學傳感器檢測DNA含量的方法，包括如下步驟:[0022](I)再取10μL目標DNA2滴加到電化學傳感器的電極表面，37°C下孵育2h后，再取10μL發(fā)卡DNA4滴加到電極表面。37°C下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸緩沖溶液沖洗兩次。最后，取10μL制備的電化學探針滴加到電極表面，繼續(xù)孵育lh。[0023](2)將電極體系插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中，以上述所得金電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極測電信號(Ip/A)，進行DNA的測定[0024]發(fā)明考察了電極表面滴加發(fā)卡DNA4后，反應(yīng)時間(Time/h)對電流強度的影響。如圖2所示，氧化峰電流首先隨著反應(yīng)時間的增加而增加，當時間達到4h時，峰電流不再增加，而呈現(xiàn)出保持不變的趨勢。選擇的最優(yōu)反應(yīng)時間是4h。[0025]也考察了電化學探針在電極上吸附時間對電流強度的影響，如圖3所示，在10到60min內(nèi)，峰電流隨著吸附時間的增加而增加。當吸附時間繼續(xù)增加時，峰電流基本不再變化。因此，以60min為最優(yōu)的吸附時間。本發(fā)明的顯著效果[0026]本發(fā)明研究了不同濃度DNA2與電化學信號強度之間的關(guān)系，得到了檢測DNA2的標準曲線，線性范圍及線性方程。[0027]在最優(yōu)的條件下，目標DNA2的濃度在3.0X10-14~2.0XKT12M范圍內(nèi)與電流強度呈一定的線性關(guān)系，其線性回歸方程是Ip=6.6X105C+1.0X10_8(IP是電化學信號強度；C是DNA2的濃度，η=9)(圖4)，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9991，檢測限是0.9X10-15Μ(3σ)。[0028]用同5根電極對濃度為2.0X10_13Μ目標物DNA2分別進行17次測定誤差分別為2.9%,2.6%,2.7%,2.9%,2.5%,在測定過程中電極表面均無脫落現(xiàn)象。以金納米粒子為載體負載硫堇為探針對2.0X10_13Μ目標物DNA2分別進行17次測定誤差分別為9.3%、7.9%,7.7%,3.2%,5.7%的，在測定過程中4根電極表面有脫落現(xiàn)象。表明以金-鉬納米粒子為載體負載硫堇為探針具有穩(wěn)定性高的特點。【專利附圖】【附圖說明】[0029]圖1.信號放大技術(shù)測定目標物原理圖。[0030]圖2.電極表面滴加發(fā)卡DNA4后，反應(yīng)時間對電流強度的影響。[0031]圖3.電化學探針在電極上吸附時間對電流強度的影響。[0032]圖4.電流強度與目標物濃度關(guān)系圖。【具體實施方式】[0033]下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。[0034]實例:信號放大技術(shù)電化學傳感器檢測DNA的方法[0035]1.實驗部分[0036]1.1儀器與試劑[0037]CHI660B電化學工作站(上海辰華儀器公司)；Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(上海市安亭科學儀器廠)；PHS-3D型酸度計(上海雷磁儀器廠)；采用三電極系統(tǒng):金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。[0038]Na2HPO4.12H20,天津市紅巖化學試劑廠；三(2_羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride),氯金酸(HAuCl4),梓樣酸三鈉(Na3C6H5O7)均購于天津市博迪化工有限公司；鐵氰化鉀:K3[Fe(CN)6]，天津市博迪化工有限公司；亞鐵氰化鉀:K4[Fe(CN)6].3H20，天津市廣成化學試劑有限公司；氧化鋁粉末:C1-Al2O3，硫堇(Th)購自上海阿拉丁試劑公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)天津市廣成化學試劑有限公司。[0039]所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下。[0040]優(yōu)選的DNAl部分序列為:5'-TTTTTTATTCGATCCGGTGCTCTTATGCCC-HS-3'[0041]優(yōu)選的DNA2部分序列為:5’-CAATAACTACCGGGCATTACTGGCCTT-3’[0042]優(yōu)選的DNA3部分序列為:5’-SH-C6-AAAGCCAGTAATGCCCGGTAGTTATTCCATCGTGTACAATAACTACCGGGCATAAGAGCACCCTTGTAC-3’[0043]優(yōu)選的DNA4部分序列為:5’_TAGTTATTGTACACGATGGMTAACTACCGGGCATCCATCGTGTAC-3，。[0044]1.2實驗步驟[0045]1.2.1金-鉬納米粒子的制備[0046]把制備和儲備金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。在1000mL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入5mL38.8mM的檸檬酸鈉(NaC6H5O7),溶液變?yōu)榫萍t色時，向溶液中依次加入5mL4.0XIO-3Iii0IL-1的HPtCl6,lSmLlOgL—1的PVP，攪拌加熱至沸騰后繼續(xù)加熱2h。溶液由酒紅色變?yōu)樽睾稚?，制得AuOPtNPs，轉(zhuǎn)移至棕色瓶，4°C儲存?zhèn)溆?。[0047]1.2.2電化學探針的制備[0048]首先，取2mL的離心管，加入10μLKT5M的DNAl和10μLρΗ8.2，50mM的Tris-HCl緩沖溶液，?ομLlOmM的TCEP反應(yīng)lh，用以活化巰基。然后，另取2mL離心管依次加入ImLAuiPtNPs和1000μLlO-4M的硫堇，溶液反應(yīng)0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上。將吸附了硫堇的Au@PtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應(yīng)16h。使巰基DNAl與AuOPtNPs連接起來。最后在15000轉(zhuǎn)速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用10mM，pH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在lOmM，pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針，4°C避光保存。[0049]1.2.3電化學傳感器的制備[0050]金電極的預(yù)處理[0051]金電極經(jīng)0.05μm的a-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹干。采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3[Fe(CN)6]溶液中，設(shè)置電壓為O~0.8V，對金電極進行循環(huán)伏安(CV)掃描。若氧化還原電流峰在O~1000mV內(nèi)，則已說明電極表面已被處理好。否則重新處理，直至符合要求為止。測完后，用二次水沖洗電極，吹干電極表面，備用。首先取10μL制備的AuNPs滴涂在金電極表面，得金納米粒子修飾金電極(AuNPs/GE)，置于避光處自然晾干。[0052]發(fā)卡DNA的預(yù)處理[0053]取一定量的10-6Μ的巰基DNA4(或DNA3)于2mL離心管中，置于95°C恒溫水浴槽中加熱5min，取出后立即置于冰水中冷卻Imin即得到發(fā)卡DNA。[0054]電化學傳感器的制備[0055]取10μL上述發(fā)卡DNA3滴涂在AuNPs/GE表面，4°C自組裝24h，接著取10μLKT4M的巰基乙醇封閉，待電極干后用IOmM的磷酸緩沖溶液沖洗兩次，得電化學傳感器。[0056]電化學測定目標DNA[0057]設(shè)計一組濃度梯度的目標DNA2，分別滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h后，取10μL發(fā)卡DNA4滴加到電極表面，37°C下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸緩沖溶液沖洗兩次。最后，取IOyL制備的電化學探針滴加到電極表面，繼續(xù)孵育lh。然后利用循環(huán)伏安法或DPV測得電流強度，根據(jù)目標DNA2濃度與電流強度關(guān)系作圖得標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算線性回歸方程。[0058]將含目標DNA2的樣品滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h后，取10μL發(fā)卡DNA4滴加到電極表面，37°C下孵育4h，然后用lOmM，pH8.0的磷酸緩沖溶液沖洗兩次。最后，取1yL制備的電化學探針滴加到電極表面，繼續(xù)孵育lh。然后利用循環(huán)伏安法或DPV測得電流強度，根據(jù)電流強度，再利用線性回歸方程計算樣品中目標DNA2含量。[0059]并采用標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為97.0-106.0%，測定結(jié)果見表1，本發(fā)明的方法在目標DNA檢測中具有精密度高的特點。[0060]本發(fā)明是基于目標DNA的循環(huán)利用機制研制了一種高靈敏檢測DNA的新型電化學傳感器。研制的傳感器具有如下優(yōu)勢:金-鉬納米粒子為載體負載硫堇為探針克服了探針易脫落和電化學信號不穩(wěn)定的缺陷；目標DNA的循環(huán)使信號得到放大，設(shè)計的電化學傳感器具有高穩(wěn)定性、高靈敏度特點。因此，所設(shè)計的電化學傳感器在構(gòu)建檢測DNA的研究方法中體現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。表1.含目標DNA2樣品分析測定結(jié)果【權(quán)利要求】1.一種信號放大技術(shù)電化學傳感器檢測DNA的方法，包括以下步驟:(1)電化學探針制備方法其特征在于:(a)取2mL的離心管，加入2~30μLDNAl和2~30μLρΗ8.2的50mM的Tris-HCl緩沖溶液和10μLTCEP反應(yīng)lh，用以活化巰基；然后，另取2mL離心管依次加入ImL金-鉬納米粒子和100~2000μL硫堇溶液反應(yīng)0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上；(b)將吸附了硫堇的金-鉬納米粒子加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應(yīng)16h,使巰基DNAl與金-鉬納米粒子連接起來；最后在15000轉(zhuǎn)速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用lOmM，pH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在ImLlOmM的pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針；(2)金電極的預(yù)處理:金電極經(jīng)0.24!11，0.034111，0.054111的a-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5min，用高純氮氣吹干備用；(3)金納米粒子修飾金電極制備:首先取2~30μLAuNPs溶液滴涂在金電極表面，得金納米粒子修飾金電極(AuNPs/GE)，置于避光處自然晾干；(4)發(fā)卡DNA的預(yù)處理:取一定量的1.0XKT4M~1.0X10-7Μ的巰基DNA4(或DNA3)于2mL離心管中，置于95°C恒溫水浴槽中加熱5min，取出后立即置于冰水中冷卻Imin即得到發(fā)卡DNA；(5)電化學傳感器的制備:取2~30μL上述預(yù)處理后的發(fā)卡DNA3滴涂在AuNPs/GE表面，4°C自組裝24h;接著取IOyLlO-4M的巰基乙醇滴于電極表面，反應(yīng)30min，然后用IOmM的磷酸緩沖溶液沖洗兩次，即得電化學傳感器；(6)標準曲線的繪制:取一組濃度梯度的目標DNA2，分別滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h后，取101^發(fā)卡0嫩4滴加到電極表面，371:下孵育411，然后用10mM，pH8.0的磷酸緩沖溶液沖洗兩次；最后，取10μL制備的電化學探針滴加到電極表面，繼續(xù)孵育Ih；然后利用循環(huán)伏安法或DPV測得電流強度，根據(jù)目標物濃度與電流強度的關(guān)系作圖得標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算線性回歸方程；(7)樣品測定:將含目標DNA2的樣品滴加到電化學傳感器上，37°C下孵育2h后，取10μL發(fā)卡DNA4滴加到電極表面，37°C下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸緩沖溶液沖洗兩次；最后，取10μL制備的電化學探針滴加到電極表面，繼續(xù)孵育Ih;然后利用循環(huán)伏安法或DPV測得電流強度，根據(jù)電流強度，再利用線性回歸方程計算樣品中目標DNA2含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1的測定目標DNA的方法，其特征在于所述的DNA序列如下:所述的DNAl的部分序列為:5'-TTTTTTATTCGATCCGGTGCTCTTATGCCC-HS-3'；所述的DNA2的部分序列為:5’-CAATAACTACCGGGCATTACTGGCCTT-3’；所述的DNA3的部分序列為:5’-SH-C6-AAAGCCAGTAATGCCCGGTAGTTATTCCATCGTGTACAATAACTACCGGGCATAAGAGCACCCTTGTAC-3’；所述的DNA4的部分序列為:5’-TAGTTATTGTACACGATGGAATAACTACCGGGCATCCATCGTGTAC-3，；3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學傳感器在檢測DNA含量中的應(yīng)用。【文檔編號】G01N27/26GK104020198SQ201410272431【公開日】2014年9月3日申請日期:2014年6月18日優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日【發(fā)明者】混旭,柏莉,劉芳,徐長旺申請人:青島科技大學