一種用于β-HCG檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于β-HCG檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，其選用抗β-HCG單克隆抗體作為包被抗體，用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1－10ug/ml作為包被液；配對抗β-HCG單克隆抗體用鑭系元素離子標(biāo)記作為標(biāo)記抗體；實(shí)驗(yàn)時用反應(yīng)緩沖液按1∶20稀釋使用；在包被抗體的反應(yīng)板上，每孔依次加入25ul的β-HCG的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、以及稀釋的標(biāo)記抗體，孵育后進(jìn)行熒光檢測。本發(fā)明還提供相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明具有較高的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性；且分析系統(tǒng)高度自動化，可提高臨床檢驗(yàn)結(jié)果的速度，可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。
【專利說明】—種用于β _HCG檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑
合
Si
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于β -HCG檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，屬于時間分辨免疫熒光分析法檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人絨毛膜促性腺激素(HCG)在人體內(nèi)以多種形式存在，其中游離β亞基是HCG在新陳代謝過程中β亞基的44-45位置肽連接處斷開所形成，是一種應(yīng)用于產(chǎn)前篩查的血清標(biāo)志物。妊娠期母血清中β-HCG水平呈雙峰曲線，第I峰于妊娠12周前后，15周后出現(xiàn)生理性下降，20?32周維持低而平穩(wěn)水平，26周達(dá)最低。第2峰于妊娠37周，明顯低于第I峰，至妊娠足月時稍有下降。在妊娠11周內(nèi)，血清β-HCG的含量與孕齡密切相關(guān)，隨妊娠進(jìn)展呈直線上升，孕齡每增加I天，β -HCG平均增加1.53IU/ml，分娩后急劇下降，產(chǎn)后4天降至lIU/ml，產(chǎn)后9天基本消失。
[0003]1987年Bargot發(fā)現(xiàn)懷有唐氏綜合癥(DS)胎兒的孕婦血清中的hCG的水平是正常孕婦的2倍。以孕婦年齡再結(jié)合血清中hCG等指標(biāo)檢測，DS的篩查率可達(dá)到63%。1988年，倫敦Bartholomews醫(yī)院Wald提出AFP、β _HCG、uE3三聯(lián)的篩查方法，得到廣泛應(yīng)用，一直用到至今。胎兒患唐氏綜合癥時，胎盤重量低于正常水平，組織器官發(fā)育不全，肝臟、胎盤的功能不良，因此孕婦血清中hCG濃度下降要比懷正常胎兒的孕婦晚3周左右，致使孕中期(約20周左右)母血清中的hCG濃度呈高水平狀態(tài)，懷唐氏綜合癥兒孕婦血清中β-HCG濃度比正常孕婦至少高2倍(一般> 2.5Μ0Μ)。因此，孕婦血清中β -HCG濃度可以作為篩選孕婦所懷胎兒是否患有唐氏綜合癥的一個輔助指標(biāo)。
[0004]目前血清的β-HCG檢測主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示蹤劑性狀的限制，ELISA的靈敏度不高，檢測范圍有限，IRMA試劑盒受同位素半衰期的影響，有效期短，此外還有一定的放射性污染。時間分辨免疫熒光分析(time-resolvedf luoroimmunoassay, TRFIA)利用具有獨(dú)特突光特性的鑭系元素,代替酶、同位素等,做為發(fā)光免疫分析中的一種重要方法，具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染等許多優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于β -HCG檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作煩瑣及污染環(huán)境等技術(shù)問題。本發(fā)明采用銪標(biāo)記技術(shù)，提供銪標(biāo)記試劑盒，以提高方法的靈敏度及穩(wěn)定性。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:在進(jìn)行時間分辨免疫熒光分析檢測法前需完β -HCG成下列準(zhǔn)備工作:
首先制備包被板，所用的包被板為特異性抗體包被的板，β -HCG包被板條的制備包括以下步驟: (1)將純化的B-HCG單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得β-HCG單克隆抗體包被板條；
(2)將β-HCG單克隆抗體包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。
[0007]其次是β -HCG銪標(biāo)記的制備，包括以下步驟:
(1)取待標(biāo)記抗體加入透析袋中，放入配制好的PH9.5的碳酸鹽緩沖液中，室溫透析過夜(其間多次換透析液)；
(2)次日，取出抗體，稀釋至0.2-5 ug/mL，按質(zhì)量比為2: I的比例(DTTA-Eu:抗體)邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振蕩過夜，然后在黑暗中靜置48小時；
(3)標(biāo)記好的抗體與游離DTTA-Eu通過SephadexG50色譜柱(I X 30cm)分離,分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；分離所用洗脫液為PH7.8 50mmol/L Tris-HCl緩沖液。
[0008](4)用小試管依次分段接受流出物，用分光光度計，在280nm處測吸光度，同時測熒光強(qiáng)度，計算出Eu標(biāo)抗體濃度；
(5)用0.22um的濾器過濾；
(6)加入0.5% BSA，2-8°C保存。
[0009]β -HCG時間分辨免疫熒光分析法，包括下列步驟:
①固相抗體制備:將抗β-HCG單克隆抗體用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至l-10ug/mL作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉；
②鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備:選用配對抗β-HCG單克隆抗體用鑭系元素離子標(biāo)記；
③在步驟①制得的具有固相抗體的反應(yīng)板上，每孔加入β-HCG標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，以及用反應(yīng)緩沖液稀釋的標(biāo)記抗體進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行熒光測定。
[0010]步驟①中包被液中單克隆抗體的濃度為l-10ug/mL，步驟②中標(biāo)記抗體用反應(yīng)緩沖液以體積比為1: 20稀釋。步驟②中的鑭系元素離子優(yōu)選為Eu3+。步驟③中的反應(yīng)緩沖液為 PH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl,內(nèi)含 0.9% NaCl, I % BSA, 0.05%牛 IgG，20uM DTPA,0.08% Tween20和0.1% NaN3 ;且該步驟③在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成。所用增強(qiáng)液為熒光增強(qiáng)液。
[0011]β -HCG定量檢測試劑盒,其特征是試劑盒包括:包被抗體的緩沖液、封閉液、反應(yīng)緩沖液、洗液、增強(qiáng)液，以及作為包被抗體的抗β -HCG單克隆抗體，鑭系元素離子標(biāo)記的抗β -HCG單克隆抗體和β -HCG標(biāo)準(zhǔn)品。
[0012]所述β -HCG標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:先分別將β -HCG凍干抗原溶解并稀釋至所需的最高濃度，再采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度，獲得β -HCG標(biāo)準(zhǔn)品。
[0013]標(biāo)準(zhǔn)品為用含6% BSA，4%蔗糖，0.1% NaN3, 50mmol/L Tris-HCl緩沖液將泌乳素蛋白配制成標(biāo)準(zhǔn)品。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明使用雙抗體夾心法，反應(yīng)步驟包括:試劑準(zhǔn)備、加樣反應(yīng)、洗滌拍干、加增強(qiáng)液、測熒光值，分析靈敏度高(0.3 IU/L)，檢測時間短，特異性好，與干擾物質(zhì)的交叉反應(yīng)小。
[0015]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明的反應(yīng)原理圖
本發(fā)明采用雙抗體夾心一步法?？谷甩?HCG單抗包被于96孔熒免板，校準(zhǔn)品或樣品中的β-HCG與包被單抗及銪離子(Eu3+)標(biāo)記的單抗于微孔內(nèi)表面發(fā)生免疫反應(yīng)，微孔表面的夾心免疫復(fù)合物與游離標(biāo)記單抗通過洗滌分離。微孔表面免疫復(fù)合物中的Eu3+被熒光增強(qiáng)液解離后形成穩(wěn)定的熒光配合物，熒光強(qiáng)度與校準(zhǔn)品或樣品中的β -HCG濃度呈正比例，通過劑量-反應(yīng)曲線可得出樣品中β-HCG濃度。
[0016]【具體實(shí)施方式】:
下面參照圖1通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0017]實(shí)施例1:進(jìn)行時間分辨免疫熒光分析檢測法前需完β -HCG成下列準(zhǔn)備工作: 首先制備包被板，所用的包被板為特異性抗體包被的板，β -HCG包被板條的制備包括
以下步驟:
(1)將純化的β-HCG單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得β -HCG單克隆抗體包被板條；
(2)將β-HCG單克隆抗體包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。
[0018]其次是β -HCG銪標(biāo)記的制備，包括以下步驟:
(1)取待標(biāo)記抗體加入透析袋中，放入配制好的pH9.5的碳酸鹽緩沖液中，室溫透析過夜(其間多次換透析液)；
(2)次日，取出抗體，稀釋至0.2-5ug/mL，按質(zhì)量比為2: I的比例(DTTA-Eu:抗體)邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振蕩過夜，然后在黑暗中靜置48小時；
(3)標(biāo)記好的抗體與游離DTTA-Eu通過SephadexG50色譜柱(I X 30cm)分離,分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；分離所用洗脫液為PH7.8 50mmol/L Tris-HCl緩沖液。
[0019](4)用小試管依次分段接受流出物，用分光光度計，在280nm處測吸光度，同時測熒光強(qiáng)度，計算出Eu標(biāo)抗體濃度；
(5)用0.22um的濾器過濾；
(6)加入0.5% BSA，2-8°C保存。
[0020]實(shí)施例2:3-HCG測定
1、標(biāo)準(zhǔn)品配制
用含 6% BSA，4%糖，0.1% NaN3,50mmol/L Tris-HCl 緩沖液將 β-HCG 蛋白配制成 O、
2、10、50、250、500 IU/mL標(biāo)準(zhǔn)液，以國家β-HCG標(biāo)準(zhǔn)品校正。分裝，于+2?+8°C保存。
[0021]2、操作步驟 I)試劑的準(zhǔn)備
a)洗滌液:將40mL濃縮洗液和960mL去離子水在干凈的洗液瓶中混合，作為工作洗滌液備用。
[0022]b)銪標(biāo)記:使用前一小時內(nèi)，用分析緩沖液按1: 20稀釋銪標(biāo)記物。反應(yīng)緩沖液為 pH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl，內(nèi)含 0.9% NaCl, I % BSA, 0.05%牛 IgG，20uM DTPA，0.08%Tween20 和 0.1% NaN3。
[0023]c)將試劑盒分析緩沖液、待測樣品、校準(zhǔn)品和和所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條平衡至室溫(20 ?25°C )。
[0024]2)吸取25 μ I的校準(zhǔn)品或樣品，按順序加入相應(yīng)微孔底部。
[0025]3)在各微孔內(nèi)加入100 μ I己稀釋的銪標(biāo)記溶液，室溫下于慢檔振動30分鐘。
[0026]4)洗板6次，將板條在潔凈的吸水紙上拍干。
[0027]5)在每個微孔內(nèi)加入200 μ I的增強(qiáng)液，室溫下于慢檔振動5分鐘。[0028]6)用時間分辨熒光測定儀檢測。
[0029]通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線計算β -HCG試劑盒的靈敏度達(dá)到了 0.3 IU/L
3、特異性
β -HCG 試劑盒檢測 500uU/ml hTSH, 250U/L hLH, 250U/L hFSH, β -HCG 表觀值均低于 2.0
U/L。
【權(quán)利要求】
1.一種用于β-HCG檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，其特征是:所述分析法包括下列步驟: ①固相抗體制備:將抗β人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)單克隆抗體用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1-lOug/mL 作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉； ②鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備:選用配對抗β-HCG單克隆抗體用鑭系元素離子標(biāo)記； ③在步驟①制得的具有固相抗體的反應(yīng)板上，每孔加入β-HCG標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，以及用反應(yīng)緩沖液稀釋的標(biāo)記抗體進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行熒光測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述β-HCG時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟②中的鑭系元素離子為Eu3+。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述β-HCG時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟③中的反應(yīng)緩沖液為 PH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl,內(nèi)含 0.9% NaCl, I % BSA, 0.05%牛 IgG，200uM DTPA,0.05% Tween20和0.1% NaN3 ;且該步驟③在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成。
4.如權(quán)利要求1所述的β-HCG時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟②中鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備是采用如下方法進(jìn)行: (1)取待標(biāo)記抗體加入透析袋中，放入配制好的PH9.5的碳酸鹽緩沖液中，室溫透析過夜，其間多次換透析液； (2)次日，取出抗體，稀釋至0.2-5 ug/mL,DTTA-Eu:抗體按質(zhì)量比為2: I的比例邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振蕩過夜，然后在黑暗中靜置48小時； (3)標(biāo)記好的抗體與游離DTTA-Eu通過IX 30cm的Sephadex G50色譜柱分離，分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；分離所用洗脫液為PH7.8 50mmol/L Tris-HCl緩沖液； (4)用小試管依次分段接受流出物，用分光光度計，在280nm處測吸光度，同時測熒光強(qiáng)度，計算出Eu++標(biāo)抗體濃度； (5)用0.22um的濾器過濾； (6)加入0.5% BSA，2-8°C保存。
5.一種β-HCG定量檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括:包被抗體的緩沖液、封閉液、反應(yīng)緩沖液、洗液、增強(qiáng)液，以及作為包被抗體的抗β -HCG單克隆抗體，鑭系元素離子標(biāo)記的抗β -HCG單克隆抗體和β -HCG標(biāo)準(zhǔn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種β-HCG定量檢測試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)品為用含6%BSA，4%蔗糖，0.1% NaN3,50mmol/L Tris-HCl緩沖液將β -HCG蛋白配制成標(biāo)準(zhǔn)品。
【文檔編號】G01N33/531GK104034906SQ201410284459
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】李永鋒, 陳國勇, 傅汝毅, 陶玲云, 藍(lán)文苑 申請人:廣西博士海意信息科技有限公司