一種血漿hsp70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，屬于體外臨床檢驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)領(lǐng)域。該試劑盒包括血漿HSP70抗體檢測(cè)反應(yīng)板，反應(yīng)板包被有重組HSP70抗原。血漿HSP70抗體定量檢測(cè)試劑盒，還包括：酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液。本發(fā)明可以專一的定量檢測(cè)出血漿HSP70抗體的含量，與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相比，本發(fā)明不僅保留了ELISA技術(shù)的高度特異性，檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和操作的簡(jiǎn)便性，同時(shí)采用的化學(xué)發(fā)光法提高了檢測(cè)的靈敏度。
【專利說明】一種血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于體外臨床檢驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于定量檢測(cè)血漿HSP70抗體的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]熱休克蛋白家族(HSPs)是一類高度保守的蛋白，HSP70是熱休克蛋白家族中的重要成員，其分為誘導(dǎo)型的組成型的。當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境中多種不良因素刺激時(shí)，誘導(dǎo)型的HSP70蛋白表達(dá)升高。HSP70蛋白對(duì)細(xì)胞損傷的修復(fù)、存活和維持正常的細(xì)胞功能是必需的。在環(huán)境刺激、病原菌感染、疾病引起細(xì)胞應(yīng)激損傷中發(fā)揮分子伴侶作用，阻止蛋白聚集，促進(jìn)損傷蛋白的重新折疊。在大多數(shù)的哺乳動(dòng)物，只有在應(yīng)激條件下誘導(dǎo)型HSP70表達(dá)，而且顯著的細(xì)胞和機(jī)體應(yīng)激后才能檢測(cè)到，但是在人和靈長類，誘導(dǎo)型的HSP70有一個(gè)基準(zhǔn)值，在一些特殊條件下如過熱、化學(xué)有毒物質(zhì)暴露、缺氧、缺血、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、細(xì)菌和病毒引起的感染，動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中，生物體的HSP70表達(dá)顯著升高；在正常老化過程，精子發(fā)生，月經(jīng)，運(yùn)動(dòng)練習(xí)等正常生理過程中，生物體的HSP70表達(dá)也顯著升高，提示其在這些過程中可能發(fā)揮重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)在很多疾病的發(fā)生、形成、預(yù)后過程中Hsps的自身抗體顯著改變，提示HSP70抗體在這些過程中可能具有重要作用。一般認(rèn)為誘導(dǎo)型的HSP70是細(xì)胞內(nèi)的蛋白，但是研究發(fā)現(xiàn)在正常人的外周循環(huán)和一些疾病狀態(tài)下能夠檢測(cè)到可溶性的HSP70和HSP70抗體，細(xì)胞內(nèi)的HSP70能夠釋放到細(xì)胞外，引起機(jī)體產(chǎn)生HSP70抗體。近來的研究發(fā)現(xiàn)在各種風(fēng)濕性疾病和自身免疫性疾病，HSP70能夠被機(jī)體識(shí)別，產(chǎn)生自身抗體；人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HSP70抗體與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。所以建立快速、可靠的檢測(cè)血中HSP70抗體的方法，將為多種疾病的監(jiān)控提供重要的手段?，F(xiàn)在檢測(cè)HSP70抗體的方法主要有Western Blotting、Elisa方法。各種方法互相印證，同時(shí)又存在檢測(cè)靈敏度、專業(yè)性、設(shè)備設(shè)施條件及成本的影響。目前，以血清學(xué)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附吸附測(cè)定(Elisa)是被廣泛接受和推廣的方法。
[0003]與目前常用的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)方法相比，化學(xué)發(fā)光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫的操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。檢測(cè)過程中不使用有害的試劑，試劑保持期長，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。在化學(xué)發(fā)光免疫分析中包含兩個(gè)部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)的基本原理是ELISA?？乖蚩贵w結(jié)合到某種固相載體表面，待測(cè)樣品中的抗體或抗原按一定程序與結(jié)合到固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物。再加入酶標(biāo)的抗原或抗體與其反應(yīng)，底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物，通過分析有色產(chǎn)物檢測(cè)待測(cè)樣本中物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)的原理在于免疫反應(yīng)中的酶作用于發(fā)光底物。發(fā)光底物在酶的作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，可同時(shí)發(fā)射出光子。利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器即可測(cè)量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測(cè)物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為快速、高效的定性、定量檢測(cè)血漿HSP70抗體，本發(fā)明提供一種用于定性、定量檢測(cè)血漿HSP70抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析定量檢測(cè)試劑盒。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)板，酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗漆液，所述的反應(yīng)板包被有重組HSP7O蛋白抗原。
[0006]所述的校準(zhǔn)品以血漿HSP70抗體純品配制，濃度為500ng/ml。
[0007]所述的質(zhì)控品以血漿HSP70抗體純品配制，由質(zhì)控品I和質(zhì)控品II兩部分組成，質(zhì)控品I的濃度為2-8ng/ml，質(zhì)控品II的濃度為20_30ng/ml。
[0008]所述的質(zhì)控品I的濃度優(yōu)選為5ng/ml,質(zhì)控品II的濃度優(yōu)選為25ng/ml。
[0009]所述的酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的抗血漿HSP70抗體的抗體即酶標(biāo)記的抗抗體，所述的反應(yīng)板材質(zhì)是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液是PH7.0-pH8.0的中性緩沖液。
[0010]本發(fā)明提供的血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒具有以下優(yōu)越性:
1.本發(fā)明可定性、定量的檢測(cè)病人血漿HSP70抗體的含量，并通過血漿HSP70抗體的含量多少幫助診斷病情，判斷病人病情發(fā)展、變化。
[0011]2.本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，既保留了酶聯(lián)免疫的操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，又具有放射免疫的高靈敏度，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作，適合在醫(yī)院普及、推廣使用。
[0012]3.本發(fā)明通過檢測(cè)發(fā)光信號(hào)值分析顯色底物，大大提高了檢測(cè)的靈敏性，與ELISA法相比，其分析靈敏度大幅度提高。
[0013]

【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1:制備本發(fā)明的血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒 1.固相包被板的制備
1)包被:使用PH9.6的0.05mol/L的碳酸鈉緩沖液，加入適量重組HSP70抗原混勻，然后加入到微孔板板孔中，100 μ I/孔，4°C過夜；
2)封閉:棄去包被液，在吸水紙紙上拍干，加入含有3%BSA和0.05%防腐劑(Proclin? 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，200 μ I/ 孔，37°C 2 小時(shí)；
3)封袋:棄去封閉液，在吸水紙上拍干，室溫下于真空干燥箱中抽5小時(shí)，立即進(jìn)行真空封袋，檢查有無漏氣，如有重新封袋，貼上標(biāo)簽后于2-8 °C保存。
[0015]2.酶標(biāo)抗HSP70抗體的抗體(酶標(biāo)二抗)的制備
抗血漿HSP70抗體的抗體用過碘酸鹽氧化法與辣根過氧化物酶交聯(lián)，通過方陣滴定，確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。加入甘油，_20°C以下保存。
[0016]3.抗HSP70抗體校準(zhǔn)品的制備
用含有3% BSA和0.05%防腐劑(Proclin? 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋抗HSP70 抗體，分裝 O、0.25、1、5、10、25、50 ng/ml 共 7 個(gè)濃度。
[0017]4.抗HSP70抗體質(zhì)控品的制備用含有3%BSA，1%海藻糖和0.05%防腐劑(Proclin? 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋抗HSP70抗體純品配制質(zhì)控品I，2，濃度分別為5ng/ml和25ng/ml。
[0018]5.化學(xué)發(fā)光底物液
從市場(chǎng)上購置魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液
6.濃縮洗滌液
取I M PBS緩沖液100ml，吐溫-20 5ml加水定容至IL即成，臨用前稀釋10倍。
[0019]7.半成品及成品組成。
[0020]上述步驟所得產(chǎn)品分裝后即為半成品。抽檢合格后組裝成試劑盒成品，成品還需抽檢，合格后才能出廠。
[0021]實(shí)施例2:本發(fā)明的試劑盒的使用方法
以實(shí)施例1制備的血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的具體操作如下:
1.試劑、樣本準(zhǔn)備 I)試劑準(zhǔn)備
①試劑盒置于室溫(18-26°c )平衡20分鐘。
[0022]②從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用純化水1: 20稀釋后加入洗板機(jī)的洗液瓶中。
[0023]2)樣本準(zhǔn)備
使用前將待測(cè)的合格血清或血漿置于室溫(18-26°C )平衡20分鐘。
[0024]2.試驗(yàn)條件
在室溫(18-26°C )嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0025]3.操作步驟
I)取出所需的重組HSP70抗原包被的微孔板反應(yīng)條置于微孔架上(剩余的微孔反應(yīng)條立即放回鋁箔袋中，并重新密封鋁箔袋)。
[0026]2)加入校準(zhǔn)品I?7、質(zhì)控品I?2和待測(cè)樣本，每孔50 μ 1，充分混勻，置于37°C恒溫箱孵育20分鐘。
[0027]3)手工洗板:棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干；或洗板機(jī)洗滌:程序設(shè)置4個(gè)循環(huán)，每孔350μ 1，洗滌后拍干。
[0028]4)加入酶標(biāo)抗體，每孔50 μ 1，充分混勻，置于37°C恒溫孵育20分鐘。
[0029]5)重復(fù)程序3)。
[0030]6)加入發(fā)光底物液，每孔100 μ 1，充分混勻。
[0031]7)放入化學(xué)發(fā)光儀中檢測(cè)信號(hào)值。
[0032]4.試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算
可以采用作圖法或計(jì)算法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。
[0033]作圖法:以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的Ig值為橫坐標(biāo)(X)，以其對(duì)應(yīng)的信號(hào)值為縱坐標(biāo)(y)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)檢測(cè)樣本測(cè)得的信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)的抗原含量Ig值，計(jì)算抗原含量。
[0034]計(jì)算法:以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的Ig值為自變量(X)，以其對(duì)應(yīng)的信號(hào)值為應(yīng)變量(y)，求出回歸方程，將待測(cè)樣本的信號(hào)值代入回歸方程式，求得對(duì)應(yīng)的HSP70抗體的含量。
[0035]5.質(zhì)量控制程序
I)質(zhì)控品I測(cè)定的濃度應(yīng)在5ng/ml±10%，質(zhì)控品2測(cè)定的濃度應(yīng)在25ng/ml±10%。
[0036]2)若血漿HSP抗體含量大于50 ng/ml，應(yīng)用校準(zhǔn)品I重新測(cè)定，再按稀釋倍數(shù)計(jì)算血漿HSP70抗體的含量。
[0037]實(shí)施例3:本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)鑒定
按照本領(lǐng)域常規(guī)的制造及檢定過程對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定:
1.血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的靈敏性檢測(cè)
使用實(shí)施例1制備的血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，在微孔板的微孔中加入不同濃度的血漿HSP70抗體抗原，血漿HSP70抗體抗原的濃度分別為O、0.25、1、5、10、25、
50ng/ml。
[0038]經(jīng)過換算,本試劑盒的靈敏度達(dá)到了 0.lng/ml
2.血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的特異性檢測(cè)
使用實(shí)施例1制備的血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，在微孔板的微孔中加入其他血漿中抗體，濃度為20ng/ml，其他步驟再按實(shí)施例2所述的使用方法檢測(cè)。
[0039]本發(fā)明的試劑盒與其他血漿中抗體HSP60抗體等的交叉反應(yīng)性小于1%。
[0040]3.血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性檢測(cè)
通過試劑盒內(nèi)部和組間的變異度判定，確定試劑盒的穩(wěn)定性，具體方法如下:
1.血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光試劑盒內(nèi)部變異系數(shù)確定方法:三個(gè)已知濃度樣品(5ng，12ng，25ng)在一塊包被HSP70蛋白的酶標(biāo)板上各單獨(dú)測(cè)定20次。變異系數(shù)計(jì)算方法:
CV =批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差S/平均值X 100%
結(jié)果:變異系數(shù)的值CV = 7.2%< 10%。
[0041]2.血漿HSP70抗體檢測(cè)試劑盒反應(yīng)之間變異系數(shù)確定方法:三個(gè)已知濃度的樣品由四個(gè)研究人員單獨(dú)各測(cè)定20次。
[0042]試劑盒反應(yīng)之間的變異系數(shù):CV =批間標(biāo)準(zhǔn)差S/批間平均值X 100%
結(jié)果:CV = 6.6%< 10%。
【權(quán)利要求】
1.一種血漿HSP70抗體化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括反應(yīng)板，酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液，所述的反應(yīng)板包被有重組HSP70抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的校準(zhǔn)品以血漿HSP70抗體純品配制，濃度為 0,0.25、1、5、10、25、50 ng/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品以血漿HSP70抗體純品配制，由質(zhì)控品I和質(zhì)控品II兩部分組成，質(zhì)控品I的濃度為2-8ng/ml，質(zhì)控品II的濃度為20_30ng/ml。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品I的濃度為5ng/ml，質(zhì)控品II的濃度為25ng/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的抗血漿HSP70抗體的抗體，所述的反應(yīng)板材質(zhì)是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗漆液是pH7.0-pH8.0的中性緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104049088SQ201410284471
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】李永鋒, 陳國勇, 傅汝毅, 陶玲云, 藍(lán)文苑 申請(qǐng)人:廣西博士海意信息科技有限公司