化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法。該化學(xué)發(fā)光增敏液，包括0.1-100mmol/L的對溴苯酚、0.05-100mmol/L的過氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01％-20％有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-10mol/L、pH值為7-11的緩沖液。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該增敏液可以顯著的增強(qiáng)反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度、大大的延長其發(fā)光持續(xù)時(shí)間，其最大發(fā)光強(qiáng)度(化學(xué)發(fā)光值)可以達(dá)到2.5×107，發(fā)光持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到25分鐘。
【專利說明】 化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化學(xué)發(fā)光是在常溫下，由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。其發(fā)光機(jī)理是:反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)分子，如反應(yīng)物、中間體或者熒光物質(zhì)吸收了反應(yīng)釋放的能量而由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)中間體由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會釋放等能級的光子，對光子進(jìn)行測定而實(shí)現(xiàn)定量分析。1977年，Halman等人通過將高特異性的抗原抗體反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)結(jié)合起來，創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)。
[0003]化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物，因化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，從而避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響。魯米諾是化學(xué)發(fā)光免疫分析中應(yīng)用廣泛的標(biāo)記物質(zhì)，在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光，其中H2O2最為常用。在化學(xué)發(fā)光免疫分析的過程中，因發(fā)光反應(yīng)速度較慢，因此，常需添加某些酶類或無機(jī)催化劑。酶類主要是辣根過氧化物酶(HRP)，無機(jī)類包括O3、齒素及Fe3+、Cu2+、Co2+或它們的配合物。
[0004]化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescentenzyme immunoassay, CLELA)是以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)的過程中，酶作用于發(fā)光底物(如魯米諾)，在信號試劑作用下發(fā)光，再利用發(fā)光信號測定儀進(jìn)行發(fā)光測定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，兩者有各自的發(fā)光底物。
[0005]相關(guān)技術(shù)中，辣根過氧化物酶(HRP)最常用發(fā)光底物是魯米諾。在化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)中，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后，利用魯米諾作為發(fā)光底物，在辣根過氧化物酶(HRP)和起動發(fā)光試劑(NaOH和H2O2)作用下，發(fā)光底物(魯米諾)發(fā)光。在反應(yīng)的過程中，該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系(HRP-H2O2-1uminol)通常為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光，存在發(fā)光強(qiáng)度低、持續(xù)時(shí)間短的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種化學(xué)發(fā)光增敏液，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系(HRP-H2O2-1uminol)由于存在的發(fā)光強(qiáng)度低、持續(xù)時(shí)間短的技術(shù)問題。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法。
[0007]本發(fā)明實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，包括:0.l-100mmol/L的對溴苯酚、
0.05-100mmol/L的過氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.0l-lOmol/L、pH值為7_11的緩沖液。
[0008]本發(fā)明提供的這種化學(xué)增敏液，其由對溴苯酚、過氧化氫，魯米諾或魯米諾衍生物、堿、有機(jī)溶劑及緩沖液組成。在化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)中，將該增敏液加入到含有辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光體系中后，該增敏液以對溴苯酚為增強(qiáng)劑，其優(yōu)先與辣根過氧化物酶作用形成自由基，并且作為電子轉(zhuǎn)移中間體提高了魯米諾或魯米諾衍生物自由基的產(chǎn)率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增敏化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效果，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該增敏液可以顯著的增強(qiáng)反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度、大大的延長其發(fā)光持續(xù)時(shí)間,其最大發(fā)光強(qiáng)度(化學(xué)發(fā)光值)可以達(dá)到2.5X107，發(fā)光持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到25分鐘。因此，可廣泛用于以化學(xué)發(fā)光為檢測手段的化學(xué)、生物、免疫等檢測分析產(chǎn)品中，在檢測的過程中，由于發(fā)光增強(qiáng)效果顯著，其發(fā)光持續(xù)時(shí)間長，從而便于重復(fù)測量，進(jìn)而可提高檢測分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0009]可選的，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括:0.l_50mmol/L的對溴苯酌.、0.05_50mmol/L的過氧化氫、0.05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01_5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為
0.01% -10%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-5mol/L的緩沖液。
[0010]可選的，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼。
[0011]可選的，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
[0012]可選的，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或；所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
[0013]本發(fā)明提供的這種化學(xué)增敏液的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)、在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物的母液；
[0015](2)、將對溴苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的對溴苯酚母液；
[0016](3)、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對溴苯酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0017]可選的，在步驟⑴中，具體包括:稱取Illmg魯米諾，加入到0.1mol/LNaOH水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液。
[0018]可選的，在步驟(2)中，具體包括:稱取86.5mg對溴苯酚，加入到2% DMF水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為5mmol/L的對溴苯酹母液。
[0019]可選的，在所述步驟(3)中，所述魯米諾母液和所述對溴苯酚母液的體積比為1:1。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0021]圖1為本實(shí)施例五提供的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法；
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的化學(xué)發(fā)光增敏液加入到含有辣根過氧化物酶的免疫反應(yīng)體系中后，體系的發(fā)光值和發(fā)光時(shí)間關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的【具體實(shí)施方式】，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實(shí)施方式，都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。
[0024]本發(fā)明提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其中包括0.l-100mmol/L的對溴苯酚、
0.05-100mmol/L的過氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.0l-lOmol/L、pH值為7_11的緩沖液。另外，為了實(shí)現(xiàn)更好的增強(qiáng)效果，優(yōu)選的，在增敏液中，各組份的含量范圍可適當(dāng)鎖銷，如:其可包括0.l-50mmol/L的對溴苯酌.、0.05-50mmol/L的過氧化氫、0.05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -10%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為
0.01-5mol/L的緩沖液；另外，優(yōu)選的，對于各組份，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼；所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣；所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。具體在制備的過程中，本發(fā)明的增敏液可以同時(shí)具備上述條件，或者只滿足上述限定條件中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0025]接下來，通過結(jié)合上述的內(nèi)容，本發(fā)明對基于以對溴苯酚作為增強(qiáng)劑的化學(xué)發(fā)光增敏液提供了以下具體的實(shí)施例，請參考以下內(nèi)容:
[0026]實(shí)施例一
[0027]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括:0.lmmol/L的對溴苯酚、
0.05mmol/L的過氧化氫、0.05mmol/L魯米諾、0.01mol/L的氫氧化鈉、體積百分?jǐn)?shù)為0.01 %二甲基甲酰胺、離子強(qiáng)度為0.01mol/L、pH值為7_11的磷酸鹽緩沖液。
[0028]實(shí)施例二
[0029]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液,其包括:10mmol/L的對溴苯酹、10mmol/L的過氧化氫、8mmol/L的7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼、5mol/L的氫氧化鉀、體積百分?jǐn)?shù)為10%二甲基甲酰胺、離子強(qiáng)度為5mol/L、pH值為7_11的Tris-HCl緩沖液。
[0030]實(shí)施例三
[0031]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括:50mmol/L的對溴苯酚、50mmol/L的過氧化氫、50mmol/L的異魯米諾或魯米諾鈉鹽、5mol/L的氫氧化鈣、體積百分?jǐn)?shù)為10%丙酮、甲醇或乙腈、離子強(qiáng)度為5mol/L、pH值為7_11的Tris-HCl緩沖液。
[0032]實(shí)施例四
[0033]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括:100mmol/L的對溴苯酚、IOOmmol/L的過氧化氫、100mmol/L的魯米諾、10mol/L的氫氧化鈉、體積百分?jǐn)?shù)為20%丙酮、甲醇或乙腈、離子強(qiáng)度為10mol/L、pH值為7_11的Tris-HCl緩沖液。
[0034]為了使得本發(fā)明上述實(shí)施例的化學(xué)發(fā)光增敏液得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光免疫分析的領(lǐng)域中，本發(fā)明還在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)之上提供了實(shí)施例五，實(shí)施例五給出了上述實(shí)施例的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法，現(xiàn)做詳細(xì)的闡述和解釋。
[0035]實(shí)施例五
[0036]本發(fā)明實(shí)施例提供的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法具體包括以下步驟，請參考圖1:
[0037]步驟101:在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物的母液；[0038]具體的，在該步驟中，稱取Illmg魯米諾，加入到0.1mol/LNaOH水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液，備用。
[0039]步驟102:將對溴苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的對溴苯酚母液；
[0040]具體的，稱取86.5mg對溴苯酚，加入到20% DMF水溶液中，并定容至IOOmL，獲得濃度為5mmol/L的對溴苯酹母液,備用。
[0041]步驟103:按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對溴苯酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0042]在該步驟中，所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對溴苯酚母液的體積比為1:1。在操作的過程中，分別吸取2mL魯米諾母液和2mL對溴苯酚母液，用16mL0.1M，pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液稀釋，并加入10 μ L30%的過氧化氫溶液，混勻即得。
[0043]其中，緩沖液的配置方法包括:用IM鹽酸溶液調(diào)整pH值至9.0，后用去離子水定容至1000mL,獲得濃度為0.05mol/L、pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液，在具體使用的時(shí)候根據(jù)特定的需求調(diào)至既定的PH和離子濃度。
[0044]另外，具體的，在本實(shí)施例中，整個(gè)配置過程可以按照以下操作進(jìn)行:稱取Illmg魯米諾，用0.1mol/LNaOH水溶液定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液；稱取86.5mg對溴苯酹,用20% DMF水溶液定容至IOOmL,獲得濃度為5mmol/L的對溴苯酹母液；稱取三羥甲基氨基甲烷6.05g，先用900mL去離子水溶解后，用IM鹽酸溶液調(diào)整pH值至9.0，后用去離子水定容至1000mL,獲得濃度為0.05mol/L、pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液；分別吸取2mL魯米 諾母液和2mL對溴苯酚母液，用16mL0.05M, pH值為9.0的Tris-HCl緩沖液稀釋，并加入10μ L30%的過氧化氫溶液，混勻后得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0045]請參考圖2，通過上述方法制成的化學(xué)發(fā)光增敏液，其將其加入含有辣根過氧化物酶的免疫反應(yīng)體系中，可出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光值與發(fā)光時(shí)間。檢測結(jié)果如圖2所示，從圖2可知，基于增強(qiáng)劑對溴苯酚的化學(xué)發(fā)光增敏液有效增強(qiáng)了魯米諾-辣根過氧化物酶-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度(最大發(fā)光強(qiáng)度可以達(dá)到
2.5X IO7)，延長了其發(fā)光持續(xù)時(shí)間(可以達(dá)到25分鐘)；其具有明顯的發(fā)光增強(qiáng)效果和提高發(fā)光時(shí)間以及其發(fā)光穩(wěn)定性的效果。另外，本發(fā)明還考察了在不同濃度的辣根過氧化物酶(HRP)的條件下，測定其在20分鐘內(nèi)的發(fā)光動力。具體結(jié)果請參考表1:
[0046]表1辣根過氧化物酶濃度和對溴苯酚增敏液對發(fā)光的影響
[0047]
【權(quán)利要求】
1.化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括:
0.1 ~1 OOmmol /I,的對漠苯酌.、0.05~1 OOmmol /I,的過氧化氧、0.05~1 OOmmol /I,魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-lOmol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-10mol/L、pH 值為 7-11 的緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括:0.l-50mmol/L的對溴苯酌.、0.05-50mmol/L的過氧化氫、0.05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01 % -10 %有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-5mol/L的緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于:所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈； 和/或； 所述緩沖液為磷酸鹽 緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物的母液； (2)、將對溴苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的對溴苯酚母液； (3)、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對溴苯酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，具體包括: 稱取Illmg魯米諾，加入到0.1mol/LNaOH水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，具體包括: 稱取86.5mg對溴苯酚，加入到20% DMF水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為5mmol/L的對溴苯酹母液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述魯米諾母液和所述對溴苯酚母液的體積比為1:1。
【文檔編號】G01N21/76GK104020162SQ201410302196
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】金茂俊, 王靜, 楊麗華, 杜鵬飛, 金芬, 邵華, 佘永新, 王珊珊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所