化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法。該化學(xué)發(fā)光增敏液，包括0.1-100mmol/L的4-咪唑苯酚、0.05-100mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01％-20％有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-10mol/L、pH值為7-11的緩沖液。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該增敏液可以顯著的增強(qiáng)反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度、大大的延長(zhǎng)其發(fā)光持續(xù)時(shí)間，其最大發(fā)光強(qiáng)度(化學(xué)發(fā)光值)可以達(dá)到7.5×107，發(fā)光持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到25分鐘。
【專利說(shuō)明】化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光增敏 液及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 化學(xué)發(fā)光是在常溫下，由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。其發(fā)光機(jī)理是：反應(yīng)體系中的 某些物質(zhì)分子，如反應(yīng)物、中間體或者熒光物質(zhì)吸收了反應(yīng)釋放的能量而由基態(tài)躍遷到激 發(fā)態(tài)，當(dāng)中間體由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì)釋放等能級(jí)的光子，對(duì)光子進(jìn)行測(cè)定而實(shí)現(xiàn)定量分 析。1977年，Halman等人通過(guò)將高特異性的抗原抗體反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)結(jié)合 起來(lái)，創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)。
[0003] 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物，因化學(xué)發(fā)光具有 熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，從而避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響。魯米諾是 化學(xué)發(fā)光免疫分析中應(yīng)用廣泛的標(biāo)記物質(zhì)，在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā) 光，其中H 202最為常用。在化學(xué)發(fā)光免疫分析的過(guò)程中，因發(fā)光反應(yīng)速度較慢，因此，常需添 加某些酶類或無(wú)機(jī)催化劑。酶類主要是辣根過(guò)氧化物酶（HRP)，無(wú)機(jī)類包括0 3、齒素及Fe3+、 Cu2+、Co2+或它們的配合物。
[0004] 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescent enzyme immunoassay，CLELA)是以酶標(biāo) 記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)的過(guò)程中，酶作用于發(fā)光底物（如魯米諾），在信號(hào)試 劑作用下發(fā)光，再利用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物 酶（HRP)和堿性磷酸酶（ALP)，兩者有各自的發(fā)光底物。
[0005] 相關(guān)技術(shù)中，辣根過(guò)氧化物酶（HRP)最常用發(fā)光底物是魯米諾。在化學(xué)發(fā)光酶免 疫分析（CLEIA)中，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后，利用魯米諾作為發(fā)光 底物，在辣根過(guò)氧化物酶（HRP)和起動(dòng)發(fā)光試劑（NaOH和H 202)作用下，發(fā)光底物（魯米諾） 發(fā)光。在反應(yīng)的過(guò)程中，該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系（HRP-H 202-luminol)通常為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光， 存在發(fā)光強(qiáng)度低、持續(xù)時(shí)間短的缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種化學(xué)發(fā)光增敏液，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 體系（HRP-H 202_luminol)由于存在的發(fā)光強(qiáng)度低、持續(xù)時(shí)間短的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的另一 個(gè)目的在于提供一種上述化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法。
[0007] 本發(fā)明實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，包括：0. l-100mm〇l/L的4-咪唑苯酚、 0. 05-100mmol/L的過(guò)氧化氫、0. 05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0. 01-10mol/L的 堿、體積百分?jǐn)?shù)為〇. 01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0. 01-10m〇l/L、pH值為7-11的緩沖 液。
[0008] 本發(fā)明提供的這種化學(xué)增敏液，其由4-咪唑苯酚、過(guò)氧化氫，魯米諾或魯米諾衍 生物、堿、有機(jī)溶劑及緩沖液組成。在化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA)中，將該增敏液加入到 含有辣根過(guò)氧化物酶（HRP)的化學(xué)發(fā)光體系中后，該增敏液以4-咪唑苯酚為增強(qiáng)劑，其優(yōu) 先與辣根過(guò)氧化物酶作用形成自由基，并且作為電子轉(zhuǎn)移中間體提高了魯米諾或魯米諾衍 生物自由基的產(chǎn)率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增敏化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效果，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該增敏液可以顯著 的增強(qiáng)反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度、大大的延長(zhǎng)其發(fā)光持續(xù)時(shí)間，其最大發(fā)光強(qiáng)度（化學(xué)發(fā)光值） 可以達(dá)到7. 5X 107,發(fā)光持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到25分鐘。因此，可廣泛用于以化學(xué)發(fā)光為檢測(cè) 手段的化學(xué)、生物、免疫等檢測(cè)分析產(chǎn)品中，在檢測(cè)的過(guò)程中，由于發(fā)光增強(qiáng)效果顯著，其發(fā) 光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，從而便于重復(fù)測(cè)量，進(jìn)而可提高檢測(cè)分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0009] 可選的，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括：0. l_50mmol/L的4-咪唑苯酚、0. 05_50mmol/ L的過(guò)氧化氫、0. 05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0. 01-5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為 0. 01% -10%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0. 01-5mol/L的緩沖液。
[0010] 可選的，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲 酰肼。
[0011] 可選的，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
[0012] 可選的，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或；所述緩沖液為 磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
[0013] 本發(fā)明提供的這種化學(xué)增敏液的制備方法，包括以下步驟：
[0014] (1)、在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍 生物的母液；
[0015] (2)、將4-咪唑苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的4-咪唑苯酚母液；
[0016] (3)、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯酚母 液混合后，在其中依次加入緩沖液和過(guò)氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0017] 可選的，在步驟⑴中，具體包括：稱取lllmg魯米諾，加入到0· Imol/LNaOH水溶 液中，并定容至lOOmL，獲得濃度為6. 25mmol/L的魯米諾母液。
[0018] 可選的，在步驟⑵中，具體包括：稱取160mg4-咪唑苯酚，加入到2 % DMF水溶液 中，并定容至100mL，獲得濃度為10mm〇l/L的4-咪唑苯酚母液。
[0019] 可選的，在所述步驟（3)中，所述魯米諾母液和所述4-咪唑苯酚母液的體積比為 1:1。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體 實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的 附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前 提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0021] 圖1為本實(shí)施例五提供的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法；
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的化學(xué)發(fā)光增敏液加入到含有辣根過(guò)氧化物酶的免疫 反應(yīng)體系中后，體系的發(fā)光值和發(fā)光時(shí)間關(guān)系圖。
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例的增敏液中，不同的增強(qiáng)劑在不同辣根過(guò)氧化物酶濃度下的 化學(xué)發(fā)光值穩(wěn)定的時(shí)間圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行 清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的【具體實(shí)施方式】，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性 勞動(dòng)的前提下所得到的所有其它實(shí)施方式，都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。
[0025] 本發(fā)明提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其中包括0. l-100mmol/L的4-咪唑苯酚、 0. 05-100mmol/L的過(guò)氧化氫、0. 05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0. 01-10mol/L的 堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-10m〇l/L、pH值為7-11的緩 沖液。另外，為了實(shí)現(xiàn)更好的增強(qiáng)效果，優(yōu)選的，在增敏液中，各組份的含量范圍可適當(dāng)鎖 銷，如：其可包括〇. l_50mmol/L的4-咪唑苯酌·、0. 05_50mmol/L的過(guò)氧化氫、0. 05_50mmol/ 1^魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-5111〇1/1的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01 (%-10(%有機(jī)溶劑、離子 強(qiáng)度為〇. 〇l-5mol/L的緩沖液；另外，優(yōu)選的，對(duì)于各組份，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉 鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼；所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣； 所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或 Tris-HCl緩沖液。具體在制備的過(guò)程中，本發(fā)明的增敏液可以同時(shí)具備上述條件，或者只滿 足上述限定條件中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0026] 接下來(lái)，通過(guò)結(jié)合上述的內(nèi)容，本發(fā)明對(duì)基于以4-咪唑苯酚作為增強(qiáng)劑的化學(xué)發(fā) 光增敏液提供了以下具體的實(shí)施例，請(qǐng)參考以下內(nèi)容：
[0027] 實(shí)施例一
[0028] 本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括：0. lmmol/L的4-咪唑苯酚、 0. 05mmol/L的過(guò)氧化氫、0. 05mmol/L魯米諾、0. 01mol/L的氫氧化鈉、體積百分?jǐn)?shù)為0. 01% 二甲基甲酰胺、離子強(qiáng)度為〇. 01m〇l/L、pH值為7-11的磷酸鹽緩沖液。
[0029] 實(shí)施例二
[0030] 本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括：10mmol/L的4-咪唑苯酚、lOmmol/ L的過(guò)氧化氫、8mmol/L的7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼、5mol/L的氫氧化鉀、體積百分?jǐn)?shù) 為10%二甲基甲酰胺、離子強(qiáng)度為5mol/L、pH值為7-11的Tris-HCl緩沖液。
[0031] 實(shí)施例三
[0032] 本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括：50mmol/L的4-咪唑苯酚、50_〇1/ L的過(guò)氧化氫、50mmol/L的異魯米諾或魯米諾鈉鹽、5mol/L的氫氧化鈣、體積百分?jǐn)?shù)為10% 丙酮、甲醇或乙腈、離子強(qiáng)度為5mol/L、pH值為7-11的Tris-HCl緩沖液。
[0033] 實(shí)施例四
[0034] 本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括：100mm〇l/L的4-咪唑苯酚、 1001111]1〇1/1的過(guò)氧化氫、1001111]1〇1/1的魯米諾、101]1〇1/1的氫氧化鈉、體積百分?jǐn)?shù)為20 (%丙 酮、甲醇或乙腈、離子強(qiáng)度為10m〇l/L、pH值為7-11的Tris-HCl緩沖液。
[0035] 為了使得本發(fā)明上述實(shí)施例的化學(xué)發(fā)光增敏液得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到 化學(xué)發(fā)光免疫分析的領(lǐng)域中，本發(fā)明還在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)之上提供了實(shí)施例五，實(shí)施例 五給出了上述實(shí)施例的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法，現(xiàn)做詳細(xì)的闡述和解釋。
[0036] 實(shí)施例五
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例提供的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法具體包括以下步驟，請(qǐng)參考圖 1 :
[0038] 步驟101 :在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯 米諾衍生物的母液；
[0039] 具體的，在該步驟中，稱取lllmg魯米諾，加入到0. Imol/LNaOH水溶液中，并定容 至100mL，獲得濃度為6. 25mmol/L的魯米諾母液，備用。
[0040] 步驟102 :將4-咪唑苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的4-咪唑苯酚母液；
[0041] 具體的，稱取160mg4-咪唑苯酚，加入到2% DMF水溶液中，并定容至100mL，獲得 濃度為10mm〇l/L的4-咪唑苯酚母液，備用。
[0042] 步驟103 :按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯 酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過(guò)氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0043] 在該步驟中，所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯酚母液的 體積比為1:1。在操作的過(guò)程中，分別吸取2mL魯米諾母液和2mL4-咪唑苯酚母液，用 16mL0. 05M，pH值為9的Tris-HCl緩沖液稀釋，并加入10μ L30%的過(guò)氧化氫溶液，混勻即 得。
[0044] 其中，緩沖液的配置方法包括：用1Μ鹽酸溶液調(diào)整pH值至9.0,后用去離子水定 容至1000mL，獲得濃度為0. 05mol/L、pH值為7. 2的Tris-HCl緩沖液，在具體使用的時(shí)候 根據(jù)特定的需求調(diào)至既定的pH和離子濃度。
[0045] 另外，具體的，在本實(shí)施例中，整個(gè)配置過(guò)程可以按照以下操作進(jìn)行：稱取lllmg 魯米諾，用〇. Imol/LNaOH水溶液定容至100mL，獲得濃度為6. 25mmol/L的魯米諾母液；稱 取160mg4-咪唑苯酚，用2% DMF水溶液定容至100mL，獲得濃度為10mmol/L的4-咪唑苯 酚母液；稱取三羥甲基氨基甲烷6. 05g，先用900mL去離子水溶解后，用1M鹽酸溶液調(diào)整pH 值至9. 0,后用去離子水定容至1000mL，獲得濃度為0. 05mol/L、pH值為7. 2的Tris-HCl 緩沖液；分別吸取2mL魯米諾母液和2mL4-咪唑苯酚母液，用16mL0. 05M，pH值為9. 0的 Tris-HCl緩沖液稀釋，并加入10 μ L30%的過(guò)氧化氫溶液，混勻后得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0046] 請(qǐng)參考圖2,通過(guò)上述方法制成的化學(xué)發(fā)光增敏液，其將其加入含有辣根過(guò)氧化物 酶的免疫反應(yīng)體系中，可出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光值與發(fā)光時(shí)間。
[0047] 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從圖2可知，基于增強(qiáng)劑4-咪唑苯酚的化學(xué)發(fā)光增敏液有 效增強(qiáng)了魯米諾-辣根過(guò)氧化物酶-過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度（最大發(fā)光強(qiáng)度可 以達(dá)到7. 5Χ107)，延長(zhǎng)了其發(fā)光持續(xù)時(shí)間（可以達(dá)到25分鐘）；其具有明顯的發(fā)光增強(qiáng)效 果和提高發(fā)光時(shí)間以及其發(fā)光穩(wěn)定性的效果。
[0048] 另外，本發(fā)明還基于對(duì)增敏液中的增強(qiáng)劑進(jìn)行替換，通過(guò)考察了在不同濃度的辣 根過(guò)氧化物酶（HRP)的條件下，測(cè)定其在20分鐘內(nèi)的發(fā)光動(dòng)力。具體結(jié)果請(qǐng)參考表1 : [0049] 表1辣根過(guò)氧化物酶濃度和不同增強(qiáng)劑對(duì)發(fā)光的影響 [0050]

【權(quán)利要求】
1. 化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括： 0. l-100mmol/L 的 4_ 咪唑苯酌·、0. 05-1 OOmmol/T,的過(guò)氧化氧、0. 05-1 OOmmol/T,魯米 諾或魯米諾衍生物、〇. 01-10m〇l/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0. 01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為 0.01-10mol/L、pH 值為 7-11 的緩沖液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括： 0. l-50mmol/L 的 4-咪唑苯酌·、0. 05-50mmol/L 的過(guò)氧化氧、0. 05-50mmol/L 魯米諾 或魯米諾衍生物、0.01-5111〇1/1的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01(%-10(%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為 0· 01-5mol/L的緩沖液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于：所述魯米諾衍生物為魯米諾 鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀 或氫氧化鈣。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰 胺、丙酮、甲醇或乙腈； 和/或； 所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
6. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 、在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物 的母液； (2) 、將4-咪唑苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的4-咪唑苯酚母液； (3) 、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯酚母液混 合后，在其中依次加入緩沖液和過(guò)氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，在步驟⑴中，具體包括： 稱取lllmg魯米諾，加入到0. Imol/LNaOH水溶液中，并定容至100mL，獲得濃度為 6. 25mmol/L的魯米諾母液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟⑵中，具體包括： 稱取160mg4-咪唑苯酚，加入到2% DMF水溶液中，并定容至100mL，獲得濃度為 10mmol/L的4-咪唑苯酌·母液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟（3)中，所述魯米諾母液 和所述4-咪唑苯酚母液的體積比為1: 1。
【文檔編號(hào)】G01N33/532GK104049080SQ201410302775
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】金茂俊, 王靜, 楊麗華, 杜鵬飛, 金芬, 邵華, 佘永新, 王珊珊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所