短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色方法，屬于分子生物學(xué)核酸非放射性同位素染色方法領(lǐng)域。本發(fā)明包括如下步驟：首先對寡核苷酸進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后用甲醇固定液將寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝膠上，再用去離子水進行漂洗，然后用花青素類核酸染料進行染色，最后用紫外透視儀或凝膠成像儀觀察結(jié)果。本發(fā)明無需使用放射性同位素，簡便易行，染色效果好，能夠檢出長度為5-11個堿基的短鏈寡核苷酸；標(biāo)本用量少，只需0.04-3微克的寡核苷酸即可進行分析；且檢測靈敏度高，比直接花青素染色提高200倍以上。
【專利說明】短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)核酸非放射性同位素染色方法領(lǐng)域，具體是在電泳后采用 甲醇固定，再用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 和 SYBR Green II RNA gel stain 兩種花青素類核酸染料中的一種進行染色，對長度為5-11個堿基的寡核苷酸進行檢測的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 寡核苷酸主要是指20個以下堿基的短鏈核苷酸，包括脫氧寡核糖核酸（DNA)及寡 核糖核酸（RNA)，在自然界中廣泛存在，也可以是人工合成的產(chǎn)物，人工合成的寡核苷酸主 要用于PCR、核酸分子雜交、核酸連接反應(yīng)和RNA干擾等過程。寡核苷酸質(zhì)量的好壞可直接 影響上述過程的成敗，因此在上述試驗中常常需要檢測寡核苷酸的長度和質(zhì)量。目前檢測 寡核苷酸長度和質(zhì)量的簡便有效的方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0003] 寡核苷酸經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，必須用放射性同位素標(biāo)記或非放射性同 位素染色才能顯現(xiàn)出來。由于放射性同位素標(biāo)記可以進行原位放射自顯影，短鏈寡核苷酸 擴散丟失較少，因此放射性同位素標(biāo)記的優(yōu)點是受檢寡核苷酸的最小長度不受限制，其缺 點是可對操作人員造成損傷，對環(huán)境造成污染，放射廢物不易處理等，現(xiàn)已幾乎被非放射性 同位素染色所取代。
[0004] 目前寡核苷酸的非同位素染色方法主要有溴乙錠（EB)染色、不對稱花青素類染 色（包括SYBR Green I、SYBR Green II和SYBR Gold等）和銀染色等。EB染色的最大優(yōu) 點是價格便宜，操作簡單，但EB是一種強致癌物質(zhì)，易對環(huán)境造成污染或?qū)Σ僮魅藛T造成 損害，且靈敏度不夠高。不對稱花青素的靈敏度比EB高，背景低，無需洗脫過程，未發(fā)現(xiàn)有 致癌性，在凝膠中檢測DNA和RNA的靈敏度比EB高出10倍以上，可用于檢測雙鏈和單鏈 DNA以及RNA等，其主要缺點是成本較高，不夠穩(wěn)定，易受pH值等因素的影響。銀染法的優(yōu) 點主要是敏感度高，可接近甚至達到放射性同位素的水平，是目前檢測寡核苷酸比較常用 的染色方法之一。
[0005] 以上介紹的核酸染色方法對于15個堿基以上的長鏈寡核苷酸的檢測都比較有 效。但除了銀染法之外，上述其它染色方法都不能有效檢測短鏈寡核苷酸，這是因為寡核苷 酸片段較短，尤其是當(dāng)其長度只有11及11個堿基以下時，寡核苷酸在染色的過程中容易從 凝膠中擴散出來，從而造成染色失敗。但采用銀染法又有操作步驟較多，耗時較長，不能檢 出某些寡核苷酸的缺點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對上述存在的問題，提供一種比銀染法更簡便的短鏈 寡核苷酸非放射性同位素染色方法，用于檢測5-11個堿基長度的短鏈寡核苷酸。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：首先對寡核苷酸進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后用 甲醇固定液將寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝膠上，防止或盡量減少其擴散，然后用去離子 水進行漂洗，再用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和 SYBR Green II RNA gel stain 兩種花青素類染料中的一種染料進行染色，最后用紫外透視儀或凝膠成像儀觀察結(jié)果。其 中 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 主要用于雙鏈 DNA 染色，而 SYBR Green II RNA gel stain則主要用于RNA及單鏈DNA染色。
[0008] 進一步地，上述對寡核苷酸進行聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體步驟為：
[0009] (1)準(zhǔn)備樣品
[0010] 將寡核苷酸配制成1〇〇μΜ的溶液，然后在微量紫外分光光度計上測定其 實際濃度；配制甲酰胺加樣緩沖液，其配方為：96〇 μ 1甲酰胺，4〇μ 1 250mmol/L、 EDTA (ρΗ8· 0)，0· 05% (w/v)溴酚藍；
[0011] ⑵制作濃度為15-45% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠：凝膠中丙烯酰胺與甲叉雙 丙烯酰胺之重量比為19/1，尿素的濃度為4-7M，凝膠的大小為10X 10cm，厚度為0. 3_。凝 膠和電泳槽緩沖液分別為1XTBE和0. 5XTBE。
[0012] 優(yōu)選地，5-10個堿基的寡核苷酸選用30-45% (w/v)的凝膠，10-15個堿基的寡核 苷酸選用20-30% (w/v)的凝膠，15個堿基以上（含15個）的寡核苷酸選用15-25% (w/ v)的凝膠。
[0013] 優(yōu)選地，15-35% (w/v)凝膠中的尿素濃度為7M，40% (w/v)凝膠中的尿素濃度為 6M，45% (w/v)的凝膠中的尿素濃度為4M。
[0014] (3)變性處理：將1μ g的寡核苷酸與2μ 1加樣緩沖液混勻，于95°C變性30-60秒， 迅速插入碎冰中，以破壞寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)；
[0015] (4)電泳：將上述已變性的寡核苷酸加樣于15-45% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠 上進行電泳，電壓為200-600V，電泳時間為1-4. 5小時，電泳溫度為20-30°C。
[0016] 進一步地，本發(fā)明用甲醇固定液將寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝膠上的具體步驟 為：將凝膠浸入甲醇固定液中，4-30°C浸泡1. 5-2小時，甲醇固定液為含有10% (v/v)乙酸 的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量為50ml/膠。通過甲醇固定液的固定，可以有 效防止短鏈寡核苷酸從染色劑中擴散出來，從而能使5-11個堿基長度的寡核苷酸被成功 檢測。
[0017] 凝膠被固定后，用去離子水（200ml/膠）漂洗3次，每次3分鐘。
[0018] 優(yōu)選地，上述凝膠的浸泡溫度根據(jù)寡核苷酸中堿基長度來確定，片段越短，浸泡溫 度越低，以減少擴散。其中，8個及8個以上堿基長度的寡核苷酸的浸泡溫度為15-30°C，8 個以下堿基長度可用選用4-15°C。
[0019] 優(yōu)選地，在電泳時，不同的凝膠濃度選用不同的電壓：15%凝膠，為200V ;20%凝 膠，300V ;25%凝膠，400V ;30-35%凝膠，500V ;40-45%凝膠，600V。同時，電泳的時間也根 據(jù)凝膠的濃度來確定，15-25%的凝膠電泳時間為1小時；30%的凝膠電泳時間為1. 5小時； 35-40%的凝膠電泳時間為3-3. 5小時；45%的凝膠電泳時間為4. 5小時。
[0020] 進一步地，本發(fā)明的方法中用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色是指將 2μ1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye加入10ml去離子水中，混勻后將凝膠充分浸 入其中，不留氣泡，常溫下浸泡30-60分鐘。用SYBR Green II RNA gel stain染色是指將 Ιμ? 10000X的SYBR Green II RNA gel stain加入10ml去離子水中，混勻后將凝膠充分 浸入其中，不留氣泡，常溫下浸泡30-60分鐘。
[0021] 綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
[0022] 1、電泳結(jié)束之后凝膠染色之前，加入甲醇固定過程，使寡核苷酸固定于凝膠之中， 防止或盡量減少其擴撒，從而保證有足夠的寡核苷酸能被染色，本發(fā)明通過簡便易行的方 法，能夠檢出長度為5-11個堿基的短鏈寡核苷酸，克服了采用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain直接染色難以檢出長度小于11個堿基的寡核 苷酸的技術(shù)問題。
[0023] 2、本發(fā)明無須放射性同位素，使用安全，且相比銀染法操作步驟少，產(chǎn)生的污染 少，操作更簡便。
[0024] 3、本發(fā)明通過增加甲醇固定過程，能顯著提高SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain染色對短鏈寡核苷酸的靈敏度，比直接SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色提高200倍以上，標(biāo)本用量少，只需0.04-3微克的寡核苷酸 即可進行分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1實施例1實驗1中11種寡核苷酸的15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
[0026] 圖2實施例1實驗2中7中寡核苷酸的40%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
[0027] 圖3靈敏度檢測結(jié)果圖，其中A為用本發(fā)明的方法對寡核苷酸oligo八11進行甲醇 固定和染色后的檢測結(jié)果圖，B為直接用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye進行染色 后的檢測結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明檢測長度為5-11個堿基的寡核苷酸的原理是：寡核苷酸聚丙烯酰胺凝膠 電泳結(jié)束后，凝膠上的寡核苷酸必須經(jīng)過染色才能顯示出來，但是在染色的過程中，短鏈 寡核苷酸，尤其是11個堿基以下的寡核苷酸很容易從凝膠擴撒到染液及洗滌液中，從而 使染色失敗。因此本發(fā)明的關(guān)鍵是在常規(guī)電泳結(jié)束之后，凝膠染色之前，加入甲醇固定過 程，使寡核苷酸固定于凝膠之中，防止或盡量減少其擴撒，從而保證有足夠的寡核苷酸能被 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye或SYBR Green II RNA gel stain染色，最后用紫外 透視儀或凝膠成像儀來觀察結(jié)果。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳述：
[0029] 實施例1染色效果實驗
[0030] 實驗試劑：受檢寡核苷酸為 oligo C6G2、oligo C5G3、oligo C4G4、oligo C3G5、oligo CGCG5、oligo (CG3) 2、oligo (ACG) 3、oligo T9、oligo A7C4、oligo (A5T)、oligo (ACGT) 2、oligo C8、oligo C7、oligo C6、oligo C5、oligo T7、oligo Tj^Poligo T5，由上海生工合成，其序列見 表1。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、Tris、Na2EDTA · 2H20、硼酸、甲醇、乙酸、四甲基乙二 胺（TEMED)、過硫酸銨、甲酰胺和溴酚藍均為分析純，均購自上海生工。SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye和SYBR Green II RNA gel stain分別購自上海生工和北京索萊寶科技 有限公司。
[0031] 實驗 1 :對 oligo C6G2、oligo C5G3、oligo C4G4、oligo C3G5、oligo CGCG5、 oligo(CG3)2、oligo(ACG)3、oligo T9、oligo A7C4、oligo(A5T)和 oligo(ACGT)2 等 11 種寡 核苷酸進行15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、甲醇固定和SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色。
[0032] 具體過程按下述操作：
[0033] 1、寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0034] (1)準(zhǔn)備樣品：
[0035] 將寡核苷酸配制成100 μ Μ的溶液，然后在微量紫外分光光度計上測定其實際濃 度；
[0036] 甲酰胺加樣緩沖液：960μ 1 甲酰胺，40μ 1250mmol/LEDTA(pH8. 0)，0· 05% (w/v) 溴酚藍；
[0037] (2)制作變性聚丙烯酰胺凝膠：凝膠濃度為15% (w/v)，凝膠中丙烯酰胺與甲叉雙 丙烯酰胺之重量比為19/1，尿素的濃度為7M，凝膠的大小為10X 10cm，厚度為0. 3mm，凝膠 和電泳槽緩沖液分別為1XTBE和0. 5XTBE ;
[0038] (3)變性處理：將1 μ g的寡核苷酸與2 μ 1加樣緩沖液混勻，于95°C變性30秒，迅 速插入碎冰中，以破壞寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)；
[0039] (4)電泳：將上述已變性的寡核苷酸加樣于15% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠上 進行電泳，電壓為200V,電泳時間為1小時，電泳溫度為25°C。
[0040] 2、甲醇固定液固定凝膠
[0041] 電泳結(jié)束后將其中一份凝膠浸入甲醇固定液中，25°C浸泡1. 5小時，甲醇固定液 為含有10% (v/v)乙酸的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量為50ml/膠。凝膠被 固定后，用去離子水（200ml/膠）漂洗3次，每次3分鐘。
[0042] 3、用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 對凝膠進行染色
[0043] 將 2 μ 1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 加入 10ml 去離子水中，混勻后將 甲醇固定后的凝膠充分浸入其中，不留氣泡，常溫下浸泡50分鐘。
[0044] 4、結(jié)果：所有的受檢寡核苷酸均被檢出（如圖1所示）。在圖1中，第1和第13 泳道為 DNAmarkerl(GeneRuler? Ultra low Range DNA ladder, Fermentas,購自上海生 工）；第 2-12 泳道依次為 oligo C6G2、oligo C5G3、oligo C4G4、oligo C3G5、oligo CGCG5、 oligo(CG3)2、oligo(ACG)3、oligo T9、oligo A7C4、oligo(A5T)和 oligo(ACGT)2。
[0045] 實驗 2 :對 oligo C8、oligo C7、oligo C6、oligo C5、oligo T7、oligo T6 和 oligo 丁5等7種寡核苷酸進行40%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和SYBR Green II RNA gel stain染 色。
[0046] 具體過程按下述操作：
[0047] 1、寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0048] (1)準(zhǔn)備樣品：
[0049] 將寡核苷酸配制成100 μ Μ的溶液，然后在微量紫外分光光度計上測定其實際濃 度；
[0050] 甲酰胺加樣緩沖液：960μ 1 甲酰胺，40μ 1250mmol/LEDTA(pH8. 0)，0· 05% (w/v) 溴酚藍；
[0051] (2)制作變性聚丙烯酰胺凝膠：凝膠濃度為40% (w/v)，凝膠中丙烯酰胺與甲叉雙 丙烯酰胺之重量比為19/1，尿素的濃度為6M，凝膠的大小為10X 10cm，厚度為0. 3mm，凝膠 和電泳槽緩沖液分別為1XTBE和0. 5XTBE ;
[0052] (3)變性處理：將1 μ g的寡核苷酸與2 μ 1加樣緩沖液混勻，于95°C變性60秒，迅 速插入碎冰中，以破壞寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)；
[0053] (4)電泳：將上述已變性的寡核苷酸加樣于40% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠上 進行電泳，電壓為600V，電泳時間為3. 5小時，電泳溫度為25°C。
[0054] 2、甲醇固定液固定凝膠
[0055] 電泳結(jié)束后將其中一份凝膠浸入甲醇固定液中，25°C浸泡1. 5小時，甲醇固定液 為含有10% (v/v)乙酸的50% (v/v)甲醇溶液。甲醇固定液的用量為50ml/膠。凝膠被 固定后，用去離子水（200ml/膠）漂洗3次，每次3分鐘。
[0056] 3、用 SYBR Green II RNA gel stain 對凝膠進行染色
[0057] 將 1 μ 1 10000X 的 SYBR Green II RNA gel stain 加入 10ml 去離子水中，混勻后 將甲醇固定后的凝膠充分浸入其中，不留氣泡，常溫下浸泡30分鐘。
[0058] 4、結(jié)果：盡管oligo C5和oligo T5的電泳帶很弱，但所有的寡核苷酸電泳帶均能 看到，如圖 2 所示，第 1-7 泳道為依次為 oligo C5、oligo C7、oligo C6、oligo C8、oligo Τ5、 oligo T6和 oligo T7〇
[0059] 實施例2染色靈敏度實驗
[0060] 實施例1的染色結(jié)果表明本發(fā)明能夠檢出5-11堿基長度的寡核苷酸，現(xiàn)以寡核 苷酸oligo An作為標(biāo)樣對本發(fā)明方法的靈敏度做進一步檢測：實驗分成實驗組和對照組。 實驗組 oligo An 的上樣量依次為 0· 01、0· 02、0· 04、0· 06、0· 08、0· 1、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8 和 1 μ g ;對照組oligo An的上樣量依次為為2 μ g、4 μ g、6 μ g、8 μ g和10 μ g。變性聚丙烯酰 胺凝膠的濃度為15%，電壓為200V，25°C，電泳1小時。電泳結(jié)束后，實驗組先用甲醇固定 液將寡核苷酸固定，再用SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye進行染色，而對照組則不用 甲醇固定，直接進行 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 染色。
[0061] 實驗組的檢測結(jié)果如圖3中A所示，對照組的檢測結(jié)果如圖3中B所示。在A中， 第 1 泳道為 DNA markerl(GeneRuler? Ultra low Range DNA ladder, Fermentas,購自上 海生工）；第 2-12 泳道的 oligo 的上樣量依次為 0· 01、0· 02、0· 04、0· 06、0· 08、0· 1、0· 2、 0. 4、0. 6、0. 8和lyg，另外，第11泳道還加入了 DNA marker 1。在圖Β中，第1泳道為DNA marker 1 ;第2-6泳道的oligo 的上樣量依次為2、4、6、8和10 μ g，未發(fā)現(xiàn)oligon的電 泳帶。
[0062] 從圖中可以看出，實驗組能檢出的最小上樣量為0. 04μ g/孔，而對照組即使上樣 量已經(jīng)高達10 μ g/孔，仍不能檢出。
[〇〇63] 本實施例的實驗表明采用本發(fā)明的檢測方法對短鏈寡核苷酸具有很高的靈敏度， 經(jīng)甲醇固定后，可以提高SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色對寡核苷酸的靈敏度 200 倍（10/0. 04)以上。
【權(quán)利要求】
1. 短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于包括如下步驟：首先對寡核苷酸 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后用甲醇固定液將寡核苷酸固定在聚丙烯酰胺凝膠上，再用 去離子水進行漂洗，然后用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye 和 SYBR Green II RNA gel stain兩種花青素類核酸染料中的一種進行染色，最后用紫外透視儀或凝膠成像儀觀 察結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述對 寡核苷酸進行聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體步驟為： (1) 準(zhǔn)備樣品：將寡核苷酸配制成ΙΟΟμΜ的溶液，然后在微量紫外分光光度計上 測定其實際濃度；配制甲酰胺加樣緩沖液，其配方為：960μ 1甲酰胺，40μ 1 250mmol/L EDTA(pH8. 0)，0· 05% (w/v)溴酚藍； (2) 制作濃度為15-45% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠：凝膠中丙烯酰胺與甲叉雙丙烯 酰胺之重量比為19/1，尿素的濃度為4-7M，凝膠的大小為10X 10cm，厚度為0. 3_ ;凝膠和 電泳槽緩沖液分別為1XTBE和0. 5XTBE ; (3) 變性處理：將1 μ g的寡核苷酸與2-3 μ 1甲酰胺加樣緩沖液混勻，于95°C變性 30-60秒，迅速插入碎冰中，以破壞寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)； (4) 電泳：將上述已變性的寡核苷酸加樣于15-45% (w/v)的變性聚丙烯酰胺凝膠上進 行電泳，電壓為200-600V，電泳時間為1-4. 5小時，電泳溫度為20-30°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述將 寡核苷酸固定是指將凝膠浸入甲醇固定液中，4-30°C浸泡1. 5-2小時，甲醇固定液為含有 10% (v/v)乙酸的50% (v/v)甲醇溶液，其用量為50ml/膠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述用 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye染色是指將2μ1 SDNAClear Nucleic Acids Stain Dye加入10ml去離子水中，混勻后將凝膠充分浸入其中，不留氣泡，常溫下浸泡30-60分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的短鏈寡核苷酸甲醇固定花青素染色法，其特征在于：所述用 SYBR Green II RNA gel stain染色是指將1 μ 1 10000X的SYBR Green II RNA gel stain 加入l〇ml去離子水中，混勻后將凝膠充分浸入其中，不留氣泡，常溫下浸泡30分鐘。
【文檔編號】G01N1/30GK104101528SQ201410307331
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】李衛(wèi), 張小龍 申請人:廣西醫(yī)科大學(xué)