一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，公開(kāi)了一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法及試劑盒。本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需預(yù)稀釋試劑及樣本，工作試劑無(wú)需配制可直接在各種自動(dòng)生化分析儀上使用，定量測(cè)定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的活性，尿液測(cè)定基本不受尿液氨基酸及氨的影響。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高、靈敏度好，精密度好，線(xiàn)性范圍寬。本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒穩(wěn)定性好，保存期長(zhǎng)，方便在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)，適用范圍廣，便于推廣使用，可廣泛應(yīng)用于各級(jí)醫(yī)院、衛(wèi)生預(yù)防部門(mén)和醫(yī)學(xué)生物科研單位測(cè)定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的含量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是涉及一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的 方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 丙氨酰氨基肽酶，簡(jiǎn)稱(chēng)APP，是亮氨酸氨基肽酶（LAP)的同工酶。血清、尿中丙氨酰 氨基肽酶活性變化與機(jī)體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。一些研究表明血清AAP測(cè)定可用于肝膽 疾病、肝腫瘤和脂肪肝的診斷。肝內(nèi)膽汁郁積、重癥肝炎、梗阻性黃疸、原發(fā)和繼發(fā)性肝癌均 會(huì)造成血清AAP明顯增高，其較其他指標(biāo)敏感。另外一些研究表明尿AAP的測(cè)定可應(yīng)用于 腎小球腎炎、腎小管早期損傷的診斷。在腎移植排異反應(yīng)、長(zhǎng)期服用腎毒性藥物治療對(duì)腎小 管的損傷、糖尿病腎病等疾病中，尿AAP均會(huì)呈不同程度增高，尤其是在對(duì)腎移植排異反應(yīng) 時(shí)尿AAP的檢測(cè)較N-乙酰-β -D-葡萄糖苷酶（NAG)敏感。因此丙氨酰氨基肽酶的測(cè)定對(duì) 疾病的鑒別診斷具有重要意義。
[0003]目前，丙氨酰氨基肽酶的測(cè)定方法主要是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定法的測(cè)定丙氨酰氨基肽酶原理的為雙抗體夾心ELISA法，該方法在測(cè)定時(shí)需要事先對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行預(yù)稀釋?zhuān)ū侗认♂專(zhuān)ぷ髟噭┰谑褂们耙残枰A(yù)稀釋并按比例配制，操作過(guò)程十 分復(fù)雜，測(cè)定結(jié)果極易受人為因素影響，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。且該方法的不同檢測(cè) 試劑需要在不同條件下保存，并且檢測(cè)試劑的有效期短，故不能被廣泛應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法準(zhǔn)確性差等問(wèn)題，提 供了一種準(zhǔn)確度高的檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法及試劑盒。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7. 5?8. 0的緩沖液中，待測(cè)樣品與L-丙 氨酰對(duì)硝基苯胺和激活劑混合，在405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度變化，通過(guò)每分鐘吸光度的變 化率計(jì)算待測(cè)樣本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
[0007] 作為優(yōu)選，所述激活劑為氯化鎂和/或硫酸鋅。
[0008] 為優(yōu)選，所述緩沖液為T(mén)ris-HCL緩沖液。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒，包括L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺、 PH7. 5?8. 0的緩沖液和激活劑。
[0010] 作為優(yōu)選，所述L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺濃度為8?12mmol/L。
[0011] 作為優(yōu)選，所述緩沖液為T(mén)ris-HCL緩沖液。
[0012] 作為優(yōu)選，所述激活劑為氯化鎂和/或硫酸鋅。
[0013] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒還包括穩(wěn)定劑。
[0014] 作為優(yōu)選，所述穩(wěn)定劑為疊氮鈉。
[0015] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒包括80mmol/L?120mmol/ L pH7. 5 ?8. OTris-HCL 緩沖液、8mmol/L ?1 2mmo1 /T, L_ 丙氛酸對(duì)硝基苯胺、0. lmmol/L ? 0. 3mmol/L 疊氣納、0. 5mmol/L ?0. 8mmol/LMgCl2 和 0. 2mmol/L ?0. 6mmol/L 硫酸鋒。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需預(yù)稀釋 試劑及樣本，工作試劑無(wú)需配制可直接在各種自動(dòng)分析儀上使用，定量測(cè)定人血清或尿液 中丙氨酰氨基肽酶的活性，尿液測(cè)定基本不受尿液氨基酸及氨的影響。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所 述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高、靈敏度好，精密度好，線(xiàn)性范圍寬。本發(fā) 明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒穩(wěn)定性好，保存期長(zhǎng)，方便在全自動(dòng)生化分析儀上檢 測(cè)，適用范圍廣，便于推廣使用，可廣泛應(yīng)用于各級(jí)醫(yī)院、衛(wèi)生預(yù)防部門(mén)和醫(yī)學(xué)生物科研單 位測(cè)定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的含量。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法及試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì) 本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法已 經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本 文所述的產(chǎn)品和方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0019] 一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7. 5?8. 0的緩沖液中，待測(cè)樣品與L-丙 氨酰對(duì)硝基苯胺和激活劑混合，在405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度變化，通過(guò)每分鐘吸光度的變 化率計(jì)算待測(cè)樣本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
[0020] 本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7. 5?8. 0緩沖液中，底物L(fēng)-丙 氨酰對(duì)硝基苯胺在待檢樣品中的丙氨酰氨基肽酶作用下分解出對(duì)硝基苯胺，然后通過(guò)在 405nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每分鐘對(duì)硝基苯胺吸光度的變化率（Λ Α/分鐘），計(jì)算AAP的活性。
[0021] 待測(cè)樣品中丙氨酰氨基肽酶的活性按如下公式計(jì)算：
[0022] 丙氨酰氨基肽酶含量（U/L) =ΔΑ/分鐘X理論因數(shù)Κ，
[0023] 其中，上式中Λ Α/分鐘通過(guò)儀器測(cè)定的，為待測(cè)樣品每分鐘吸光度的變化率；理 論因數(shù)K為已知的，計(jì)算公式為:理論因數(shù)(K) = 103XVT// (9. 9XVsXb) = 2525(103 ：mmol 轉(zhuǎn)化umol的因數(shù)；VT :反應(yīng)液總體積；9. 9 :對(duì)硝基苯胺在405nm處的毫摩爾消光系數(shù)；VS ： 樣品體積；b :比色杯光徑（cm))。
[0024] 其中，本發(fā)明所述檢測(cè)方法中，所述待測(cè)樣品可以為人血清或尿液。且所述尿液無(wú) 需預(yù)處理。
[0025] 根據(jù)酶催化反應(yīng)最適條件的要求，在酶測(cè)定體系中還需要加入一定量的激活劑。 激活劑可以是酶的活性中心，也可以通過(guò)其他機(jī)制激活酶的活性。其中，所述激活劑可以為 二價(jià)金屬離子，如 Mg2.、Zn2.、Mn2.、Ca2+、Fe 2.等。
[0026] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)方法中所述激活劑為氯化鎂和/或硫酸鋅，以提供 Mg2+、Zn2+。在一些實(shí)施例中，所述氯化鎂為MgCl2 · 6H20，所述硫酸鋅為ZnS04 · 7H20。
[0027] 為了酶與底物很好的結(jié)合，酶和底物都需要緩沖液提供適宜的解離環(huán)境。緩沖液 的離子強(qiáng)度也影響著酶的活性，離子強(qiáng)度過(guò)高，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下 降，但離子強(qiáng)度過(guò)低也可能無(wú)法激活酶活性。一般選擇與生理環(huán)境的體液比較接近的離子 強(qiáng)度。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法中所述緩沖液為PH7. 5?8. 0的 Tris-HCL 液。
[0028] 進(jìn)一步的，為了保證待測(cè)樣品中丙氨酰氨基肽酶充分反應(yīng)，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨 酰氨基肽酶的方法中所述L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺、激活劑均過(guò)量。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒，包括L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺 溶液、pH7. 5?8. 0的緩沖液和激活劑。
[0030] 其中，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒中，所述L-丙氨酰對(duì) 硝基苯胺濃度為8?12mmol/L。更優(yōu)選為10mmol/L。
[0031] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒中，所述緩沖液為T(mén)ris-HCL 緩沖液。
[0032] 進(jìn)一步的，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒中，所述緩沖液的 濃度為 80mmol/L ?120mmol/L。
[0033] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒中，所述激活劑為氯化鎂和/ 或硫酸鋅。
[0034] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒中，所述激活劑為氯 化鎂和硫酸鋅，其中所述氯化鎂的濃度優(yōu)選為0. 5?0. 8mmol/L，更優(yōu)選為0. 65mmol/L ;所 述硫酸鋅的濃度優(yōu)選為0. 2?0. 6mmol/L,更優(yōu)選為0. 5mmol/L。
[0035] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒還包括穩(wěn)定劑。
[0036] 作為優(yōu)選，所述穩(wěn)定劑為疊氮鈉。進(jìn)一步的，所述疊氮鈉工作濃度為0. lmmol/L? 0. 3mmol/L,更優(yōu)選為 0. 2mmol/L。
[0037] 在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒包括80mmol/ L ?1 20mmo1 /Τ, pH7. 5 ?8. OTris-HCL 緩沖液、8mmol/L ?1 2mmo1 /T, L-丙氛酸對(duì)硝基苯胺、 0. lmmol/L ?0. 3mmol/L 疊氣納、0. 5mmol/L ?0. 8mmol/LMgCl2 和 0. 2mmol/L ?0. 6mmo 1 / L硫酸鋅。
[0038] 進(jìn)一步的，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒由 100mmol/LpH7. 5 ?8. OTris-HCL 緩沖液、10mmol/L L-丙氛酸對(duì)硝基苯胺、0. 2mmol/L 疊氣 鈉、0. 65mmol/L MgCl2 和 0. 5mmol/L 硫酸鋅組成。
[0039] 本發(fā)明提供的檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒可以為單一試劑，例如，將L-丙氨酰 對(duì)硝基苯胺與緩沖液、穩(wěn)定劑、激活劑制成單一試劑。本發(fā)明提供的檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的 試劑盒也可以為雙試劑。如，將緩沖液和金屬離子激活劑制成第一試劑，將L-丙氨酰對(duì)硝 基苯胺和穩(wěn)定劑制成第二試劑，在利用該試劑盒檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶時(shí)，將第一試劑與第 二試劑混合，從而檢測(cè)待測(cè)樣品中的丙氨酰氨基肽酶。
[0040] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0041] 實(shí)施例1 :本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒。
[0042] 本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒為液體單一試劑，包括：100mmol/ L pH7. 5?8. OTris-HCL緩沖液、10mmol/L L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺、0. 2mmol/L疊氮鈉、 0. 65mmol/L MgCl2 和 0. 5mmol/L 硫酸鋒。
[0043] 實(shí)施例2 :本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒。
[0044] 本發(fā)明所述檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒為雙試劑，第一試劑包括lOOmmol/ L PH7. 5 ?8. OTris-HCL 緩沖液、0. 65mmol/L MgCl2 和 0. 5mmol/L 硫酸鋅，第二試劑包括 10mmol/L L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺、0. 2mmol/L疊氮鈉。
[0045] 實(shí)施例3 :檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法。
[0046] 設(shè)定全自動(dòng)生化分析儀反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)方法為速率法，測(cè)定主波長(zhǎng)405nm，反 應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間90s，測(cè)量時(shí)間為120s，理論因數(shù)為2525。然后取待測(cè)樣品與試 劑盒中的試劑置于全自動(dòng)生化分析儀，儀器自動(dòng)加樣混合，檢測(cè)并記錄405nm波長(zhǎng)下的吸 光度變化值。根據(jù)計(jì)算公式C# = A A#/minXK,計(jì)算待測(cè)樣品中丙氨酰氨基肽酶的濃度， 其中，C#為待測(cè)樣本濃度；AA#/min為樣品每分鐘吸光度變化率；K為理論因數(shù)，已設(shè)定為 2525。
[0047] 實(shí)施例4 :本發(fā)明所述試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0048] 利用日立7080全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)在2?8°C環(huán)境下保存不同時(shí)間的實(shí)施例 1所述試劑盒的空白吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0049] 表1穩(wěn)定性試驗(yàn)

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的方法，其特征在于，在pH7. 5?8. 0的緩沖液中，待測(cè)樣 品與L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺和激活劑混合，在405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度變化，通過(guò)每分鐘吸 光度的變化率計(jì)算待測(cè)樣本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活劑為氯化鎂和/或硫酸鋅。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為T(mén)ris-HCL緩沖液。
4. 一種檢測(cè)丙氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于，包括L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺、 PH7. 5?8. 0的緩沖液和激活劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述L-丙氨酰對(duì)硝基苯胺濃度為8? 12mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述緩沖液為T(mén)ris-HCL緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述激活劑為氯化鎂和/或硫酸鋅。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，還包括穩(wěn)定劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為疊氮鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒,其特征在于，包括80mmol/L?120mm ol/L pH7. 5? 8. OTris-HCL 緩沖液、8mmol/L ?1 2mmo1 /T, L-丙氛酸對(duì)硝基苯胺、0. lmmol/L ?0. 3mmol/L 疊氣納、0. 5mmol/L ?0. 8mmol/LMgCl2 和 0. 2mmol/L ?0. 6m mol/L 硫酸鋒。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104049090SQ201410310395
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】董理 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司