用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法，其是將Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白作為布魯氏菌種間差異標識蛋白，且以Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，對于布魯氏菌感染血清SAT呈陽性的家畜，Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白與不同種的布魯氏菌感染血清均發(fā)生反應(yīng)，而Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白僅與除牛種布魯氏菌以外的其它種的布魯氏菌感染血清發(fā)生反應(yīng)，進而判定SAT呈陽性的家畜為布魯氏菌自然感染或免疫接種。通過Western?Blot檢測，證明了兩種蛋白具有區(qū)分牛種和非牛種布魯氏菌免疫血清的能力，也可以區(qū)分牛的自然感染與疫苗免疫；Omp31和Bp26蛋白還可用于鑒別其他微生物與布魯氏菌SAT抗原的非特異凝集反應(yīng)。
【專利說明】用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組學(xué)，具體地說，涉及一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]布魯氏菌(Brucella，簡稱布氏菌)是一種革蘭染色陰性的兼性細胞內(nèi)寄生菌，是布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)的病原菌。布病是一種人獸共患病，在我國傳染病防治法中屬于乙類傳染病。國際上，布病被歸為B類傳染病，在世界范圍內(nèi)都有流行，特別是2000年以后，布病疫情大幅度上升，給人民群眾帶來嚴重的健康損害和經(jīng)濟損失。
[0003]目前，布魯氏菌診斷的金標準是細菌分離培養(yǎng)，但是，布魯氏菌培養(yǎng)難度大，周期長，且分離率低。最常用的血清學(xué)檢測方法為虎紅平板凝集試驗(RBPT)、試管凝集試驗(SAT)、補體結(jié)合試驗(CFT)等,另外，由布魯氏菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)包被的ELISA檢測方法也逐步用于布病的診斷。但以上方法均無法區(qū)別試管凝集陽性血清是由于疫苗免疫還是自然感染。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，許多科研人員著眼于尋找布魯氏菌疫苗株與野毒株的差異蛋白，并且進行了大量研究，但是目前為止，并沒有找到一個能夠從本質(zhì)上區(qū)別疫苗株與野毒株的理想方法。
[0004]人間布病的防控與動物布病的防控密不可分，而且研究數(shù)據(jù)顯示人間布病的流行趨勢與動物布病的流行趨勢相符。在我國，牛和羊是布病主要的傳染源，因此，控制牛和羊的布病疫情，有利于控制人間布病的流行，對減少國家和人民的經(jīng)濟損失具有重大意義。家畜布病預(yù)防的主要措施之一是疫苗的免疫接種。但是，由于傳統(tǒng)的檢測方法無法區(qū)別家畜的自然感染和免疫接種，如果將布病病畜誤以為是免疫家畜，會保存?zhèn)魅驹矗瑢θ撕徒】导倚髱順O大威脅，反之，若將免疫家畜誤以為是布病疫畜而淘汰宰殺，會對國家及個人經(jīng)濟帶來巨大損失。特別是牛作為一種布病常見傳染源，且其經(jīng)濟價值較高，所以，在目前疫情極其嚴重時期，更加需要一種方法能夠區(qū)別出牛是自然感染還是免疫接種，并據(jù)此采取科學(xué)的處理措施，最大程度的避免不必要的經(jīng)濟損失，同時鑒別染疫動物保護人及其他家畜的健康。
[0005]目前，我國最普遍應(yīng)用于牛的疫苗是M5和S2，分別是羊種和豬種布魯氏菌的弱毒活疫苗株，而自然感染的病牛，主要是牛種布魯氏菌。隨著布魯氏菌全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有報道bp26基因存在于所有布魯氏菌種中，而且種間相當(dāng)保守，而omp31基因存在于除牛種之外的所有布魯氏菌中，所以，將Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，而0mp31蛋白作為種間差異標識蛋白，可有效地將牛種布魯氏菌與羊種和豬種等其他布魯氏菌種從血清學(xué)方法上區(qū)分開來，進而判斷SAT陽性的牛是自然感染還是免疫接種。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要根據(jù)家畜免疫接種疫苗株與自然感染的布魯氏菌種的不同，通過區(qū)分布魯氏菌的種間差異，間接的將疫苗接種與自然感染的家畜區(qū)分開來。
[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法，其是將0mp31蛋白或含His標簽的重組0mp31蛋白作為布魯氏菌種間差異標識蛋白，且以Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，對于布魯氏菌感染血清SAT呈陽性的家畜，Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白與不同種的布魯氏菌感染血清均發(fā)生反應(yīng)，而0mp31蛋白或含His標簽的重組0mp31蛋白僅與除牛種布魯氏菌以外的其它種的布魯氏菌感染血清發(fā)生反應(yīng)，進而判定SAT呈陽性的家畜為布魯氏菌自然感染或免疫接種。
[0008]其中，所述含His標簽的重組0mp31蛋白以及含His標簽的重組Bp26蛋白的制備方法為:
[0009]I)從NCBI上獲取bp26和omp31的基因序列(bp26基因的GenBank編號為AY166768.1，omp31基因的GenBank編號為AF366063.1)，分別設(shè)計引物，PCR擴增bp26基因和omp31基因；
[0010]2)分別對步驟I)的擴增產(chǎn)物進行酶切，然后將bp26基因片段與經(jīng)過相同酶切的pET30a質(zhì)粒連接，將omp31基因片段與經(jīng)過相同酶切的pET32a質(zhì)粒連接，分別將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，篩選陽性克??；
[0011]3)將步驟2)中篩選到的陽性克隆分別接種到含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)劑IPTG進行誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)后的菌液離心，收集菌體，加入PBS液重懸菌體，超聲破碎后離心，所得沉淀用尿素溶解，離心后收集上清，用孔徑0.45 μ m的濾膜過濾，濾液過His標簽蛋白純化柱，即得含His標簽的重組蛋白。
[0012]用于PCR擴增bp26基因的引物包括:
[0013]上游引物:5’ -CCGGAATTCATGAACACTCGTGCTAGCAA-3 ’ 和
[0014]下游引物:5’ -CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACGACAT-3 ’。
[0015]用于PCR擴增omp31基因的引物包括:
[0016]上游引物:5’ -CCGGAATTCATGAAATCCGTAATTTTGGC-3 ’ 和
[0017]下游引物:5’ -CCGGAATTCATGAAATCCGTAATTTTGGC-3 ’。
[0018]前述的方法，利用蛋白免疫印跡法(Western Blot，縮寫WB)檢測蛋白與布魯氏菌感染血清中抗相應(yīng)蛋白的特異性抗體之間的反應(yīng)。
[0019]本發(fā)明中涉及的家畜包括但不限于牛。
[0020]本發(fā)明還提供一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的試劑盒，其是以0mp31蛋白或含His標簽的重組0mp31蛋白，以及Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為包被抗原。
[0021]本發(fā)明成功構(gòu)建了兩種目的標識蛋白0mp31和Bp26的重組原核表達質(zhì)粒，并成功的表達并純化出兩種目的標識蛋白。WB試驗結(jié)果顯示，M5疫苗免疫的血清中6/7表現(xiàn)為Bp26和0mp31均反應(yīng)陽性，S2疫苗免疫血清中5/6表現(xiàn)為兩種蛋白反應(yīng)陽性，自然感染的血清中9/10表現(xiàn)為Bp26反應(yīng)陽性，而0mp31反應(yīng)陰性。通過WB檢測，證明了兩種蛋白具有區(qū)分牛種和非牛種布魯氏菌免疫血清的能力，也可以區(qū)分牛的自然感染與疫苗免疫；0mp31和Bp26蛋白還可用于鑒別其他微生物與布魯氏菌SAT抗原的非特異凝集反應(yīng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實施例中兩種布魯氏菌基因PCR擴增圖；其中，A為bp26基因擴增圖:1.DNA marker, 2.bp26 ;B 為 omp31 基因擴增圖:1.DNA marker, 2.0mp31。
[0023]圖2為本發(fā)明實施例中兩種重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；其中，1.DNA Marker ；
2.pET30a/bp26重組質(zhì)粒酶切結(jié)果；3.pET32a/omp31重組質(zhì)粒酶切結(jié)果。
[0024]圖3為本發(fā)明實施例中重組質(zhì)粒PET30a/bp26在BL21 (DE3)中的表達情況；A中:I蛋白Marker ；2未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的BL21 (DE3)感受態(tài)細胞誘導(dǎo)后；3未插入目的序列PET30a載體轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)感受態(tài)細胞誘導(dǎo)后；4重組質(zhì)粒PET30a/bp26在BL21(DE3)中未誘導(dǎo)；5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)物誘導(dǎo)后；6誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒超聲破碎后沉淀；7誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒超聲破碎后上清；B中:1蛋白Marker ；2未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的BL21 (DE3)感受態(tài)細胞誘導(dǎo)后；3未插入目的序列PET32a載體轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)感受態(tài)細胞誘導(dǎo)后；4重組質(zhì)粒PET32a/omp31在BL21(DE3)中未誘導(dǎo)；5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)物誘導(dǎo)后；6誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒超聲破碎后沉淀；7誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒超聲破碎后上清。
[0025]圖4為本發(fā)明實施例中不同尿素濃度溶解Bp26重組蛋白包涵體效果圖；A中:1蛋白Marker ；2未誘導(dǎo)對照；3裂解后上清；4 2M尿素溶解后上清；5 4M尿素溶解后上清；
66M尿素溶解后上清；7 8M尿素溶解后上清；8溶解后沉淀；B中:1蛋白Marker ；2未誘導(dǎo)對照；3裂解后上清；4誘導(dǎo)后對照；5 2M尿素溶解后上清；6 4M尿素溶解后上清；7 6M尿素溶解后上清；8 8M尿素溶解后上清。
[0026]圖5為本發(fā)明實施例中兩種重組蛋白經(jīng)His標簽柱純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果；A中:1 Marker ；2誘導(dǎo)的重組蛋白；3誘導(dǎo)后菌液超聲破碎后沉淀；4誘導(dǎo)后菌液超聲破碎后上清；5-8洗脫液①-④；B中:1 Marker ;2_9 0mp31蛋白洗脫液①-⑧。
[0027]圖6為本發(fā)明實施例中Western Blot驗證兩種蛋白抗原性結(jié)果；其中，A、B、C依次為空白對照、陰性對照、羊種16M免疫血清；其中，空白對照是以PBS代替一抗進行孵育，陰性對照是來自非疫區(qū)的健康牛血清作為一抗進行孵育；A-C中，1-3依次代表蛋白Marker、Bp26 和 0mp31。
[0028]圖7為本發(fā)明實施例中Western Blot檢測已知血清中抗體結(jié)果；其中，A、B、C依次為疫苗株M5免疫血清、疫苗株S2免疫血清、牛種菌感染的病牛血清；A-C中，1-3依次代表蛋白 Marker、Bp26 和 0mp31。

【具體實施方式】
[0029]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0030]實施例用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法
[0031]根據(jù)目前我國的畜用疫苗的應(yīng)用狀態(tài)，牛群布病預(yù)防途徑主要是接種羊5號布魯氏菌疫苗(M5)和豬2號布魯氏菌疫苗(S2)，而牛感染的主要是牛種布魯氏菌。所以，通過0mp31與Bp26在不同種間標識的存在狀態(tài)不同，可以研究在血清學(xué)的水平上將布魯氏菌牛種菌和非牛種菌區(qū)別開，從而間接的區(qū)分出牛是由于自然感染還是疫苗接種，為進一步對其進行鑒別診斷處理提供必要的依據(jù)。
[0032]1.布魯氏菌蛋白bp26和omp31基因的克隆表達
[0033]1.1目的基因的擴增
[0034]1.1.1引物設(shè)計從NCBI上獲取bp26和omp31的基因序列(bp26基因的GenBank編號為AY166768.l，omp31基因的GenBank編號為AF366063.1)，同時從網(wǎng)站上檢測2個基因是否存在信號肽，2個基因存在信號肽的可能性為O。然后設(shè)計限制性內(nèi)切酶位點，本實施例選用EcoR I和Xho I，運用primer5軟件設(shè)計引物，2個表達基因的信息和引物見表I和表2。
[0035]表I兩種基因序列的基本情況
[0036]
基因名稱蛋白名稱基因來源片段長度(bp)
bp26Bp26羊種布魯氏菌16M753
omp31Omp31羊種布魯氏菌16M723
[0037]表2兩種布魯氏菌基因克隆表達設(shè)計引物
[0038]
基因上游引物下游引物
hp26 5、CCGGAATTCATCAACACTCGT5 ’-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCA

(ΧΤΛ(Χ〕ΛΛ-3 ’AAAACGACAT-3'
omp3! 5'.CCGGAATTCATG,\AATCCGTA5 '-CCGGAATTC ΛΤ?ΛΛ ATCCGTA

ATTTTGGC-3，ATTTTGGC-3,
[0039]1.1.2 PCR擴增以及產(chǎn)物回收
[0040](l)PCR20y L擴增體系:HiFi MixlO μ L,上、下游引物各0.5 μ L，模板(16Μ)0.5μ L，ddH208.5 μ L0
[0041]PCR 循環(huán)條件:95°C 5min ；95°C lmin，62°C lmin，72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C 5min ；PCR產(chǎn)物于4°C保存。
[0042](2)擴增所得的PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。對已鑒定的PCR產(chǎn)物進行切膠純化，使用凝膠回收試劑盒進行回收。PCR擴增結(jié)果見圖1。
[0043]1.2目的基因連接T載體
[0044]1.21 連接
[0045]10 μ L 連接體系:PMD18-T 載體 I μ L，PCR 產(chǎn)物 3 μ L，連接溶液 I 5 μ L，ddH201 μ L，于16 °C連接過夜。
[0046]1.2.2 轉(zhuǎn)化
[0047]取1yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50yL的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化方法:DH5 a感受態(tài)細胞放于冰上lOmin，待其融化，將10 μ L連接產(chǎn)物與50 μ L大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞混勻后放置于冰上30min。42°C熱激90s，立刻放于冰上90s。加入500yL的LB培養(yǎng)基，混勻，37°C，220rpm搖菌45?60min，取出200 μ L菌液均勻涂在含有抗性的平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。
[0048]1.2.3陽性克隆子鑒定
[0049]取出過夜培養(yǎng)平板，隨機挑取幾個單克隆，種在新的抗性平板上保存，接種環(huán)上殘留的菌加到PCR體系中做菌落PCR鑒定。PCR擴增體系:HiFi MixlO μ L ;上、下游引物各
0.5μ L ；ddH209 y L0 PCR 擴增條件:95 °C 1min ；95°C lmin,62°C lmin,72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C 5min ;4°C保存擴增產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察結(jié)果，是否擴增出了預(yù)期的目的條帶。
[0050]陽性克隆子接種到新鮮的含0.lmg/ml Amp (kana)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，過夜搖菌，提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板對其進行質(zhì)粒PCR鑒定，質(zhì)粒PCR體系與普通PCR相同。鑒定為陽性的克隆子標記為T/bp26和T/omp31。
[0051]測序:將T/bp26和T/omp31陽性克隆子質(zhì)粒，送至北京天一輝遠生物科技有限公司，利用T載體通用引物測序。測序后的序列與原始序列用blast比對，看有無突變，選用無任何突變的克隆子繼續(xù)進行后續(xù)的試驗。
[0052]1.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0053]1.3.1酶切回收目的片段和表達質(zhì)粒
[0054]將T/bp26和T/omp31,與表達載體kana抗性和Amp抗性同時用兩種限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I進行雙酶切反應(yīng)，酶切體系為30 μ L體系:重組T載體質(zhì)粒或表達載體各20 μ L，1X緩沖液Η3 μ L，ddH205 μ L，限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各I μ L。酶切條件:370C 4h。酶切產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳分析酶切效果，并在在紫外燈下切割目的條帶，按照天根公司的普通凝膠回收試劑盒進行核酸回收?；厥蘸蟮钠芜M行I %瓊脂糖凝膠電泳查看回收效果。存放于_20°C備用。
[0055]1.3.2連接目的片段和表達載體
[0056]根據(jù)酶切后的目的基因和表達載體條帶亮度粗略估計其濃度比，按照待插入的目的基因片段與酶切載體的摩爾比為3-6:1，計算其體積比，將二者連接。若二者條帶亮度相當(dāng)，連接體系為(1yL):目的基因6yL，表達載體2yL，T4DNA連接酶lyL，T4DNA連接酶緩沖液luL。連接條件:16°C，過夜連接。
[0057]1.3.3 轉(zhuǎn)化
[0058]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞:從_80°C超低溫冰箱中取出DH5 α感受態(tài)細胞放于新冰上lOmin，待其融化，向感受態(tài)細胞中加入連接產(chǎn)物10 μ L，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置30min，將離心管置于42°C水浴中放置熱激90s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中90s，此過程不要搖動離心管。然后向離心管中加入500 μ L的LB培養(yǎng)基中，混勻后置于37°C搖床振蕩培養(yǎng)45min，目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性基因表達，使菌體復(fù)蘇；然后將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞加到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上，用無菌接種環(huán)將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，370C培養(yǎng)過夜。
[0059]1.4陽性克隆子的篩選和鑒定
[0060]隨機挑取若干單菌落種在新的抗性平板上以便保存，接種環(huán)上殘留的菌加到PCR體系中做菌落PCR鑒定，并將擴增產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外下觀察結(jié)果，是否擴增出了預(yù)期的目的條帶。
[0061]經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆子接種到含相應(yīng)抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，220rpm,37°C過夜搖菌,用天根公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進行質(zhì)粒PCR鑒定。擴增產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外下觀察結(jié)果，是否擴增出預(yù)期的目的條帶。
[0062]對菌落PCR鑒定陽性的克隆子進行質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定。
[0063]質(zhì)粒PCR 體系:HiFi MixlO μ L，上、下游引物各 0.5 μ L，質(zhì)粒 I μ L，ddH208.5 μ L0PCR 循環(huán)條件:95°C 5min ；95°C lmin,62°C lmin,72°C 2min,30 個循環(huán)；72°C 5min ；
[0064]酶切體系(1yL):重組質(zhì)粒5 μ L，1X緩沖液Hl μ L，雙蒸水3 μ L，限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 Xho I 各 0.5 μ L。酶切條件:37°C 4h。
[0065]質(zhì)粒PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察是否在預(yù)期位置酶切得到了相應(yīng)的條帶。鑒定結(jié)果如圖2所示。
[0066]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，取感受態(tài)細胞置于冰浴中，向感受態(tài)細胞中加入重組質(zhì)粒I μ L,冰上放置30min后，然后向離心管中加入800 μ L的LB培養(yǎng)基中，混勻后置于37°C搖床振蕩培養(yǎng)45min ;吸取100 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞加到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)平板上，用無菌接種環(huán)將細胞均勻涂開，37°C培養(yǎng)過夜。挑選單菌落接種于5mL含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200rpm搖床過夜，用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR鑒定。成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒標記為PET30a/bp26和PET32a/omp31。
[0067]1.5重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)及表達
[0068]挑取陽性克隆接種到含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，過夜搖菌。將過夜的菌液按
I: 100的比例加入5ml含相應(yīng)抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm搖至菌液OD值約為0.6?1.0時加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為1.0mM0 37°C,220rmp誘導(dǎo)4h。將誘導(dǎo)后的菌液12000rpm離心5min，棄上清，用PBS洗滌2次，沉淀用30 μ L PBS懸浮，加入10 μ L4X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸8min，SDS-PAGE電泳進行鑒定，觀察表達結(jié)果。選取誘導(dǎo)蛋白量最大的IPTG濃度，重新對菌液進行誘導(dǎo)后，用0.0lM的PBS洗菌2次，200 μ L PBS混懸菌體，冰浴超聲破碎處理，超聲2s，間歇3s，共超2min ；4°C，12000rpm離心5分鐘，分離上清和沉淀，沉淀加入PBS懸浮，取30 μ L沉淀或上清與10 μ L4X蛋白上樣緩沖液混合，煮沸后跑SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果。SDS-PAGE結(jié)果見圖3。
[0069]SDS-PAGE 電泳方法:
[0070]首先，配制SDS-PAGE凝膠，分離膠濃度15 %，濃縮膠濃度5 %，準備SDS-PAGE電泳；將處理好的蛋白樣品與蛋白標準品一預(yù)染的蛋白marker按一定順序加入加樣孔中，按其中蛋白含量確定加樣量；電壓80V，30min，待溴酚藍進入分離膠后，換120V繼續(xù)電泳2h左右；待溴酚藍到達距凝膠底部Icm左右時終止。取出凝膠，置于5倍體積的考馬斯亮藍染液中染色2h，然后用脫色液脫色4h，肉眼觀察或用凝膠成像儀成像。
[0071]重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達結(jié)果:兩種基因bp26和omp31表達蛋白的大小應(yīng)該分別為27.6kDa和26.5kDa。pET30a的標簽大小為5kDa，而pET32的標簽是一個18kDa的融合蛋白，故理論上Bp26蛋白條帶應(yīng)該位于32kDa左右,而0mp31蛋白條帶應(yīng)該位于44kDa左右。結(jié)果顯示，pET30a/bp26重組克隆和pET32a/omp31重組克隆均在目的位置有蛋白被誘導(dǎo)出來，超聲裂解之后，發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白均主要以包涵體的形式存在于沉淀中。
[0072]1.6蛋白的純化
[0073]1.6.1包涵體溶解最佳尿素濃度的優(yōu)化
[0074]將含有陽性克隆子的細菌接種進1ml含相應(yīng)抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，按照以上的方法進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)完成以后，按上述方法收集菌體，洗滌并超聲破碎，離心，分別收集上清和沉淀，將沉淀混懸于2M尿素溶液中溶解，放置30分鐘，1000rpm離心，收集上清和沉淀，所得的沉淀繼續(xù)用4M尿素溶解，而后依次將前次所得的沉淀用6M、8M尿素溶液溶解，收集各次離心所得的上清以及最后一次離心的沉淀，進行SDS-PAGE電泳，確定對包涵體的溶解作用最強的尿素濃度，SDS-PAGE結(jié)果見圖4。
[0075]將誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎后，沉淀依次用2M、4M、6M和8M的尿素溶解所得結(jié)果如圖4所示，在最大濃度8M的尿素的溶解下，依然有部分蛋白溶出，說明8M的尿素溶解蛋白最徹底，因此選用8M作為溶解包涵體的最適尿素濃度。
[0076]1.6.2蛋白純化
[0077]含有陽性克隆子的細菌接種進600ml含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中進行大量誘導(dǎo)，8000rpm離心30min收集菌體，PBS洗三遍。將菌體混懸于50mlPBS中，冰浴超聲破碎，超聲5s，間隔10秒，60W，超聲20min。1000rpm離心20min。所得沉淀用8M尿素溶解30min后，1000rpm離心20min,收集上清，并用0.45 μ m的濾膜過濾備用。
[0078]注射器手推純化:His標簽蛋白純化柱(5ml)依次用5_10柱體積的純水和結(jié)合緩沖液過柱，清洗以及平衡柱子；將過濾后的蛋白注射器手推過柱，流速控制在0.5-5ml/min范圍之內(nèi)；上樣完成后，用至少5-10柱體積的結(jié)合緩沖液過柱，洗去不能跟柱子結(jié)合的雜蛋白；然后用5-10柱體積的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液時分管收集，以保證蛋白的濃度；洗脫完成以后，在另外用10體積洗脫緩沖液過柱，徹底洗去殘留的蛋白，再用10-15柱體積的純水過柱，最后用5體積20%乙醇過柱，保存柱子備用。
[0079]BP26蛋白過柱純化以后，洗脫液分四管收集，其中①、②管蛋白含量較多，濃度相當(dāng)，③、④管蛋白很少，幾乎可以忽略，所以棄去這兩管收集液，合并①、②管的收集液，留作后續(xù)試驗備用。0mp31蛋白純化后洗脫液分8管收集，標為①-⑧管，其中②、③管蛋白含量較多，合并備用，棄去其他幾管收集液。
[0080]將分管收集的各管蛋白跑SDS-PAGE電泳，對比純化效果，并用Bradford法蛋白定量試劑盒檢測各管蛋白濃度，選取濃度最適宜的蛋白進行后續(xù)試驗，SDS-PAGE結(jié)果見圖5。
[0081]2ffestern Blot 分析
[0082]2.1兩種目的蛋白的抗原性驗證
[0083]克隆表達以及純化后得到的蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后，將準備好的NC膜在轉(zhuǎn)膜液里浸泡5min，用“夾心法”安裝轉(zhuǎn)膜裝置，即從上到下按照海綿、濾紙、SDS-PAGE膠、NC膜、濾紙、海綿的順序固定裝置，注意各層之間不能有氣泡。NC膜朝向正極，恒流200mA 濕轉(zhuǎn) 2h。
[0084]轉(zhuǎn)膜后的NC膜，用PBS稍加洗滌，然后轉(zhuǎn)入封閉液(含0.5% Tween的PBS配成5%的脫脂奶粉)，4°C過夜封閉。
[0085]將封閉后的NC膜置于1:100稀釋的一抗羊種菌16M免疫綿羊血清稀釋液，37°C，50rpm緩慢搖動孵育2h，孵育完成后，倒掉一抗稀釋液，PBS洗膜三遍，每次lOmin。加1:30000稀釋的二抗稀釋液(HRP標記的鼠抗綿羊/山羊/牛IgG)，37°C，50rpm緩慢搖動孵育2h，孵育完成后，倒掉二抗稀釋液，PBS洗膜三遍，每次lOmin。洗膜后加入顯色液DAB，緩慢搖動顯色l_2min，加蒸餾水終止顯色反應(yīng)。各種免疫血清的WB結(jié)果見圖6和圖7。
[0086]2.2 Western Blot法檢測血清樣本
[0087]血清樣本來源見表3-表5。
[0088]表3 M5免疫血清
[0089]

【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的方法，其特征在于，其是將Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白作為布魯氏菌種間差異標識蛋白，且以Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為陽性對照蛋白，對于布魯氏菌感染血清SAT呈陽性的家畜，Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白與不同種的布魯氏菌感染血清均發(fā)生反應(yīng)，而Omp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白僅與除牛種布魯氏菌以外的其它種的布魯氏菌感染血清發(fā)生反應(yīng)，進而判定SAT呈陽性的家畜為布魯氏菌自然感染或免疫接種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用蛋白免疫印跡法檢測蛋白與布魯氏菌感染血清中抗相應(yīng)蛋白的特異性抗體之間的反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述含His標簽的重組Omp31蛋白以及含His標簽的重組Bp26蛋白的制備方法為: 1)從NCBI上獲取bp26和omp31的基因序列，分別設(shè)計引物，PCR擴增bp26基因和omp31基因； 2)分別對步驟I)的擴增產(chǎn)物進行酶切，然后將bp26基因片段與經(jīng)過相同酶切的pET30a質(zhì)粒連接，將omp31基因片段與經(jīng)過相同酶切的pET32a質(zhì)粒連接，分別將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，篩選陽性克?。? 3)將步驟2)中篩選到的陽性克隆分別接種到含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)劑IPTG進行誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)后的菌液離心，收集菌體，加入PBS液重懸菌體，超聲破碎后離心，所得沉淀用尿素溶解，離心后收集上清，用孔徑0.45 μ m的濾膜過濾，濾液過His標簽蛋白純化柱，即得含His標簽的重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，用于PCR擴增bp26基因的引物包括: 上游引物:5’ -CCGGAATTCATGAACACTCGTGCTAGCAA-3> 和 下游引物:5’ -CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACGACAT-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，用于PCR擴增omp31基因的引物包括: 上游引物:5 ’ -CCGGAATTCATGAAATCCGTAATTTTGGC-3，和 下游引物:5’ -CCGGAATTCATGAAATCCGTAATTTTGGC-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述家畜包括但不限于牛。
7.用于鑒定布魯氏菌自然感染或免疫接種家畜的試劑盒，其特征在于，以O(shè)mp31蛋白或含His標簽的重組Omp31蛋白，以及Bp26蛋白或含His標簽的重組Bp26蛋白作為包被抗原。
【文檔編號】G01N33/531GK104166000SQ201410314620
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】崔步云, 姜海, 楊星雅, 田國忠, 趙鴻雁, 樸東日 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所