一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用，通過自制的PMMoV抗血清(第一抗體)作為主要試劑組裝了PMMoV的ID-ELISA檢測(cè)試劑盒，可應(yīng)用于辣椒中PMMoV的檢測(cè)。該試劑盒具體包含陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、PMMoV特異性抗血清、酶標(biāo)二抗、顯色底物PNPP、封閉液、包被緩沖液、PBST洗滌緩沖液、抗體稀釋緩沖液、底物緩沖液、5塊96孔酶標(biāo)板和使用說明書1份。以待檢測(cè)抗原如病毒粒體免疫家兔等脊椎動(dòng)物可在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗血清(多克隆抗體)，抗血清可特異性識(shí)別并與抗原結(jié)合，因此可用于檢測(cè)樣品是否含抗原，填補(bǔ)了國內(nèi)在PMMoV抗血清制備及相應(yīng)ELISA檢測(cè)應(yīng)用方面的空白。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶學(xué)、免疫學(xué)或生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種PMMoV貴州分離物 ID-ELISA檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。 -種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒及其制備方法 與應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 植物病毒病又被稱為"植物癌癥"，目前沒有有效的治療方法。對(duì)植物病毒病快速、 準(zhǔn)確的檢測(cè)有助于病株的早期發(fā)現(xiàn)、隔離和銷毀，也是植物抗病育種和脫毒苗的培育所必 須的。診斷植物病毒的方法有傳統(tǒng)生物學(xué)方法、電鏡觀察法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法 等。
[0003] 血清學(xué)方法是檢測(cè)植物病毒最為常用和有效的手段之一。目前應(yīng)用最廣泛的血清 學(xué)檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)和斑點(diǎn)免疫結(jié)合測(cè)定法（DIBA)，DIBA法操作程序比 ELISA法要簡(jiǎn)單，但其檢測(cè)靈敏度低于ELISA法。
[0004] ELISA檢測(cè)方法的基本原理是：以酶催化的顏色反應(yīng)指示抗原抗體的結(jié)合。利 用酶標(biāo)抗體、抗原或次抗原作為一個(gè)檢測(cè)體系，其靈敏度較高，可檢測(cè)到納克（ng)水平 的病毒，并且可以減少檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)行大規(guī)模樣品調(diào)查，使常規(guī)病毒診斷變得非常容易， 特別適合脫毒苗的檢測(cè)。目前，應(yīng)用最多的是雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)和間接 ELISA (ID-ELISA)等方法。
[0005] DAS-ELISA檢測(cè)法將已知抗體吸附于固相載體，加入待檢樣品（含相應(yīng)抗原）與之 結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物，使抗體/抗原/酶標(biāo)記抗體復(fù)合物與底物反應(yīng)，呈 現(xiàn)深淺不同的顏色反應(yīng)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)：專業(yè)性強(qiáng)，靈敏度高、應(yīng)用廣泛，在國外已形成商 業(yè)化生產(chǎn)。但是DAS-ELISA存在一定的缺點(diǎn)：（1)檢測(cè)每種病毒都需要制備相應(yīng)的酶標(biāo)記 特異性抗體，標(biāo)記過程比較復(fù)雜，對(duì)技術(shù)和成本要求均高；（2)生產(chǎn)單克隆抗體存在雜交瘤 細(xì)胞系的退化和某些雜交瘤細(xì)胞系在大鼠腹腔中不能誘生腹水的問題。
[0006] ID-ELISA檢測(cè)法將待檢樣品（含相應(yīng)抗原）吸附于固相載體，加入第一抗體（抗 血清）與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入能識(shí)別第一抗體的酶標(biāo)第二抗體和底物，使抗原/ 一抗 /酶標(biāo)二抗復(fù)合物與底物反應(yīng)，呈現(xiàn)深淺不同的顏色反應(yīng)。ID-ELISA的缺點(diǎn)：對(duì)病毒檢測(cè)的 特異性和靈敏度比DAS-ELISA的要低；優(yōu)點(diǎn)：（1)無需針對(duì)每種待檢病毒都制備相應(yīng)的酶標(biāo) 記特異性抗體，降低成本和時(shí)間；（2)抗血清的制備方法容易，來源廣泛。
[0007] 目前，國內(nèi)未見有辣椒輕斑駁病毒（PMMoV)特異性抗血清制備、ELISA檢測(cè)方法的 建立和相應(yīng)試劑盒制備的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒的制備 方法，尤其是其中PMMoV特異性抗血清的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè) 辣椒PMMoV的檢測(cè)方面的應(yīng)用，旨在解決辣椒輕斑駁病毒（PMMoV)的血清學(xué)檢測(cè)尚屬空白 的問題。
[0011] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒，包括：陽性對(duì) 照、陰性對(duì)照、PMMoV特異性抗血清、酶標(biāo)二抗、顯色底物、封閉液、包被緩沖液、PBST洗滌緩 沖液、抗體稀釋緩沖液、底物緩沖液以及96孔酶標(biāo)板；其中，PMMoV特異性抗血清的制備包 括以下具體步驟：
[0012] (1)根據(jù)GenBank中公布的PMMoV各地分離物的CP序列設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR引物：
[0013] 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，
[0014] 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA ;
[0015] (2)對(duì)感染PMMoV貴州辣椒分離物的組織進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、純化以及回收，得到 CP基因片段；
[0016] (3)將所述CP基因片段和原核表達(dá)載體pET32a(+)以Nco I和EcoR I兩種DNA 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理、片段回收、連接、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌、重組CP蛋白表達(dá) 以及重組CP蛋白回收；
[0017] (4)將所述重組CP蛋白作為抗原免疫家兔制備特異性PMMoV抗血清，免疫后取兔 血，即得到PMMoV特異性抗血清。
[0018] 優(yōu)選地，所述陽性對(duì)照為含PMMoV病毒的辣椒葉片冷凍干燥后研磨成的細(xì)粉；所 述陰性對(duì)照為健康無毒辣椒葉片冷凍干燥后研磨成的細(xì)粉；所述酶標(biāo)二抗為堿性磷酸酶標(biāo) 記的羊抗兔抗體溶液。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒在辣椒PMMoV 的檢測(cè)方面的應(yīng)用。
[0020] 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA)是檢測(cè)生物樣品中是否含有特定蛋白質(zhì)（或特定病 毒）的一種常規(guī)方法，其準(zhǔn)確性和靈敏度都較高。間接ELISA法的基本原理為：將待檢樣 品中所有蛋白固定（吸附、或包被）在一支持表面上，加入能識(shí)別并與待檢抗原結(jié)合的抗 體（抗血清），樣品中若有抗原則抗體（第一抗體）與其結(jié)合，再加入能識(shí)別第一抗體的酶 標(biāo)記第二抗體（酶標(biāo)二抗），最后加入過量的該酶的底物（反應(yīng)物），則底物在酶的催化下 不斷轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物，最終將抗原存在的信號(hào)放大。本發(fā)明利用自制的PMMoV抗血清 (第一抗體）作為主要試劑組裝了 PMMoV的ID-ELISA檢測(cè)試劑盒，可應(yīng)用于辣椒中PMMoV 的檢測(cè)。該試劑盒具體包含陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、PMMoV特異性抗血清、酶標(biāo)二抗、顯色底物 PNPP、封閉液、包被緩沖液、PBST洗滌緩沖液、抗體稀釋緩沖液、底物緩沖液、5塊96孔酶標(biāo) 板和使用說明書1份。以待檢測(cè)抗原如病毒粒體免疫家兔等脊椎動(dòng)物可在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn) 生特異性的抗血清（多克隆抗體），抗血清可特異性識(shí)別并與抗原結(jié)合，因此可用于檢測(cè)樣 品是否含抗原。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)的不足相比，本發(fā)明所具有的有益效果為：
[0022] (1)本發(fā)明采用pET32a(+)和BL21 (DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)，使得所制備的抗原（重組 PMMoV外殼蛋白）是高度可溶的，便于采用親和層析純化抗原，同時(shí)也保證了抗原的質(zhì)量。 與通過提純完整的病毒粒體作為抗原來制備抗血清的方法比較，采用原核表達(dá)制備抗原具 有成本低和步驟簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。
[0023] (2)本發(fā)明PMMoV特異性抗血清具有高特異性，針對(duì)待測(cè)病汁液的效價(jià)達(dá)1:8000。
[0024] (3)本發(fā)明的試劑盒可對(duì)辣椒樣品中的PMMoV檢測(cè)靈敏度達(dá)0. 3 lmg/mL PMMoV病 汁液（即病葉提取液在稀釋3200倍后仍可被檢測(cè)到）；同一樣品在一塊酶標(biāo)板上重復(fù)測(cè) 定，測(cè)得結(jié)果（〇〇 4(15值）變異系數(shù)小于5 % ;同一樣品在5塊酶標(biāo)板上重復(fù)測(cè)定，測(cè)得結(jié)果 _4(15值）變異系數(shù)小于10%;該試劑盒檢測(cè)結(jié)果具有良好的板內(nèi)和板間重復(fù)性；試劑盒提 供完成該ELISA檢測(cè)所需的幾乎所有試劑、緩沖液和說明書，使用者只需按照說明書操作 即可完成檢測(cè)；在4°C保存，該試劑盒有效期達(dá)1年，填補(bǔ)了國內(nèi)在PMMoV抗血清制備及相 應(yīng)ELISA檢測(cè)應(yīng)用方面的空白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中PMMoV CP基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；其中，1 : DNAmarker ;2、3 :RT-PCR 產(chǎn)物；
[0026] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中PMMoV CP基因的原核表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果圖；其中，1 :蛋 白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 :含pET32a(+)空載體的大腸桿菌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后的裂解樣品；3 :未誘 導(dǎo)過夜培養(yǎng)的細(xì)胞裂解樣品；4?10 :IPTG誘導(dǎo)后培養(yǎng)1、3、6、9、12、15和18h后全細(xì)胞裂 解樣品；
[0027] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中重組PMMoV CP蛋白可溶性分析結(jié)果圖；其中，1 :全細(xì)胞裂 解樣；2 :裂解后的上清；3 :裂解后的沉淀；
[0028] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中自制抗血清的Western Blot分析結(jié)果圖；其中，1 :預(yù)染蛋 白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 :IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PMMoV CP重組菌全細(xì)胞樣。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1抗原（重組PMMoV CP蛋白）的制備
[0031] 1、PMMoV貴州分離物外殼蛋白基因（CP基因，大小為474bp)的RT-PCR擴(kuò)增
[0032] (1)根據(jù)GenBank中公布的PMMoV各地分離物的CP序列設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR引物：
[0033] 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，
[0034] 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA。
[0035] (2)從感染PMMoV貴州辣椒分離物的新鮮植物葉片中提取總RNA(Trizol試劑提取 法提取）。
[0036] (3)以第⑵步中提取的總RNA為模板，以第⑴步中設(shè)計(jì)的引物通過一步RT-PCR 法（使用商品化試劑盒"PrimeScript?0ne Step RT-PCR Kit Ver.2"，寶生物大連公司，貨 號(hào)：RR055A，或其它公司同類產(chǎn)品）擴(kuò)增獲得PMMoV的CP基因，操作按試劑盒說明書進(jìn)行 (退火溫度：50°C)。取lyL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖1所示，在 約474bp左右觀察到DNA條帶。
[0037] 2、PMMoV CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建（常規(guī)分子生物學(xué)方法）
[0038] (1)采用"普通產(chǎn)物純化試劑盒"（北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP204,或其 它公司同類產(chǎn)品）將上步獲得的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化的CP基因片段和原核表達(dá) 載體pET32a(+)(德國Novagen公司）均同時(shí)以Nco I和EcoR I兩種DNA限制性內(nèi)切酶進(jìn) 行雙酶切處理（寶生物大連公司，貨號(hào)：1160A，1040A，或其它公司同類產(chǎn)品），具體操作按 照限制酶說明書進(jìn)行。
[0039] (2)對(duì)CP基因酶切產(chǎn)物和pET32a (+)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳（常規(guī) 分子生物學(xué)操作），CP基因酶切產(chǎn)物應(yīng)該474bp左右有DNA條帶，pET32a (+)酶切產(chǎn)物應(yīng)該 在5,900bp處有DNA條帶。用潔凈刀片切下這兩處膠條并分別放入2支1. 5mL塑料帶蓋離 心管中，采用"瓊脂糖凝膠回收試劑盒"（北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP209,或其它 公司同類產(chǎn)品）對(duì)CP基因和pET32a(+)載體進(jìn)行回收，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。
[0040] ⑶測(cè)定上步中回收的CP基因片段和pET32a⑴載體片段的濃度（ng DNA/ μ L)， 并按照3:1的摩爾比（CP: pET32a (+) = 3:1)進(jìn)行混合，加入T4DNA連接酶（寶生物大連公 司，貨號(hào)：2011A，或其它公司同類產(chǎn)品）進(jìn)行連接，具體操作按照連接酶說明書進(jìn)行。
[0041] (4)用10 μ L上步中的連接反應(yīng)產(chǎn)物以熱激法轉(zhuǎn)化100 μ L大腸桿菌DH5a感受態(tài) 細(xì)胞（可購自寶生物大連公司、上海生工等多家公司），并將100 μ L轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂于含 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上在37°C培養(yǎng)16h(常規(guī)分子生物學(xué)操作）。
[0042] (5)隨機(jī)挑取平板上的大腸桿菌單菌落若干分別轉(zhuǎn)入5mL含100 μ g/mL氨芐青霉 素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)16h (37°C，200rpm)。采用菌液PCR的方法對(duì)各培養(yǎng)物 進(jìn)行陽性重組子的篩選（PCR條件：正向引物S · Tag_Fw :5' -GAACGCCAGCACATGGAC ;反向 引物T7Rv :5 ^ -GCTAGTTATTGCTCAGCGGT，退火溫度50°C :循環(huán)次數(shù)：25)(常規(guī)分子生物學(xué) 操作）。
[0043] (6)對(duì)上步檢測(cè)到含有陽性重組子（pET32a(+)_PMMoVCP)的菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒 (即pET32a(+)-PMMoVCP)的提?。ǔＲ?guī)分子生物學(xué)操作）。
[0044] 3、PMMoV CP基因的原核表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物CP蛋白的獲得（常規(guī)分子生物學(xué)方法）
[0045] (1)用1 μ L提取到的重組質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化100 μ L大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì) 胞（可購自北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)：CB105 ;Novagen公司等），并于含100μ g/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上在37°C培養(yǎng)16h(常規(guī)分子生物學(xué)操作）。
[0046] (2)從上述平板上挑取任一單菌落轉(zhuǎn)入5mL含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)16h(37°C，200rpm)，按1:50(V/V)將培養(yǎng)后菌液接種于200mL含 10(^8/11^氨芐青霉素的1^液體培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)（371：，200印111)。待細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì) 數(shù)生長期，即菌液在600nm的吸光度值（0D_)達(dá)0. 5?0. 7時(shí)，向菌液中加入異丙基硫代 半乳糖甘（IPTG)使其終濃度達(dá)0. 5mmol/L以誘導(dǎo)PMMoV CP基因在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì) 胞中的表達(dá)，在25°C、200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12h使CP基因表達(dá)量（即CP蛋白合成量）達(dá) 最大（如圖2所示）?？扇苄苑治霰砻髦亟MPMMoV CP蛋白是可溶的（如圖3所示）。
[0047] (3)將菌液離心，收集菌體，重懸于裂解緩沖液中采用超聲方法破碎細(xì)胞釋放重組 的CP蛋白，離心除去細(xì)胞碎片，采用固定化金屬親和層析法（IMAC，鎳柱，Ni 2+-NTA)對(duì)上清 液中的重組CP蛋白進(jìn)行純化，紫外法測(cè)定蛋白濃度后備用（常規(guī)分子生物學(xué)操作）。
[0048] 實(shí)施例2
[0049] 1、PMMoV抗血清的制備
[0050] 以實(shí)施例1中得到的表達(dá)產(chǎn)物即重組CP蛋白（PMMoV病毒的外殼蛋白）作為抗原 免疫家兔制備特異性PMMoV抗血清。初次免疫使用弗式完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗式不完 全佐劑。
[0051] 初次免疫：采用背部皮下多點(diǎn)注射的方式對(duì)健康的約2kg重的新西蘭雄兔進(jìn)行免 疫，每點(diǎn)約〇. 2?0. 5mL，總量約500 μ g重組CP蛋白。
[0052] 加強(qiáng)免疫：初次免疫后1周，對(duì)家兔進(jìn)行再次免疫，方法如前。每隔一周免疫一次， 總共再次免疫4次。
[0053] 抗血清制備：對(duì)家兔進(jìn)行心臟取血，常規(guī)方法制備的血清分裝后于_20°C保存待 用。
[0054] 2、PMMoV抗血清質(zhì)量評(píng)價(jià)
[0055] Western blot分析表明PMMoV抗血清對(duì)重組CP蛋白具有強(qiáng)的特異性（如圖4所 示）。采用ID-ELISA法測(cè)定，所制備的PMMoV抗血清針對(duì)重組CP蛋白的效價(jià)（抗血清稀 釋度）達(dá)1:25600,針對(duì)PMMoV病汁液效價(jià)達(dá)1:8000 ;抗血清在1:1000的稀釋度下能檢測(cè) 到以1:3200倍稀釋的PMMoV辣椒病汁液中的PMMoV (即檢測(cè)靈敏度達(dá)0. 3lmg/mL病汁液， 病汁液為新鮮病葉按1:10的研磨提取液）；該抗血清只與PMMoV產(chǎn)生陽性反應(yīng)，不與同屬 的TMV、0RSV和ToMV發(fā)生交叉反應(yīng)，也不與其它能侵染辣椒的病毒如CMV、PVX和PVY發(fā)生 交叉反應(yīng)，具有強(qiáng)的特異性。以上抗血清各項(xiàng)指標(biāo)完全能夠滿足對(duì)PMMoV病毒的ID-ELISA 檢測(cè)。
[0056] 實(shí)施例3PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒
[0057] 1、PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒包含以下組分：
[0058] (1)陽性對(duì)照：將含PMMoV病毒的辣椒葉片冷凍干燥后研磨成細(xì)粉并裝入小瓶 (lg)。
[0059] (2)陰性對(duì)照：將健康無毒辣椒葉片冷凍干燥后研磨成細(xì)粉并裝入小瓶（lg)。
[0060] (3)A1液：將制備的PMMoV抗血清100 μ L裝入小管蓋緊（4°C可保存一年）。
[0061] (4)A2液：酶標(biāo)二抗溶液：堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體溶液（購自碧云天生物技 術(shù)研究所，貨號(hào)：A0239,或其它公司同類產(chǎn)品，4°C保存一年）100 μ L裝入小管蓋緊。
[0062] (5)顯色底物：lg對(duì)硝基苯磷酸二鈉（ΡΝΡΡ)(購自北京索來寶公司，或其他公司同 類產(chǎn)品）。
[0063] (6) 96孔酶標(biāo)板5塊（購自美國Corning公司，或其它公司同類產(chǎn)品）。
[0064] (7)包被緩沖液：1. 59g碳酸鈉，2. 93g碳酸氫鈉，0· 20g疊氮化鈉，溶于900mL去離 子水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9. 6,加水至1L。
[0065] (8)PBST洗滌緩沖液：8.0g氯化鈉，1. 15g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯 化鉀，溶于800mL去離子水后調(diào)節(jié)pH至7. 4,加入0. 5g吐溫-20后，加水1L。
[0066] (9)封閉液：脫脂奶粉溶于0. 1MTBST緩沖液至終濃度為5%，完全溶解，過0. 2 μ m 濾膜后4°C保存。
[0067] (10)抗體稀釋緩沖液：含2% PVP的PBST緩沖液，4°C保存。
[0068] (11)底物緩沖液：MgCl2 ·6Η200. lg，疊氮化鈉0. 2g、乙二醇胺97mL，加800mL去離 子水后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9. 8,定容至1000mL，4°C保存。
[0069] 2、PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒試劑準(zhǔn)備
[0070] (1)包被緩沖液：取一袋包被緩沖液（1. 59g碳酸鈉，2. 93g碳酸氫鈉，0. 20g疊氮 化鈉），加水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9. 6,加水至1L。
[0071] (2)PBST洗滌液：取一袋PBS(8. 0g氯化鈉，1. 15g磷酸氫二鈉，0· 2g磷酸二氫鉀， 〇· 2g氯化鉀），加水溶解，調(diào)節(jié)pH至7. 4,加入一管Tween (吐溫）-20,加水至1L。
[0072] (3)抗體稀釋緩沖液：取上步配好的PBST洗滌液30mL，加入1袋PVP，溶解。
[0073] (4)封閉液：取30mLPBST洗滌液，加入1. 5g封閉用脫脂奶粉，溶解。
[0074] 3、PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用方法
[0075] (1)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的預(yù)處理：第一次使用本試劑盒時(shí)，將陽性對(duì)照（帶毒葉 片凍干粉末）和陰性對(duì)照（健康葉片凍干粉末）打開，各加入l〇mL包被緩沖液，充分重懸 混勻后分裝至1. 5mL塑料帶蓋離心管（每管lmL)，-20°C保存待用。
[0076] (2)待檢樣品預(yù)處理：向0· 5g?lg待檢樣品中加入5?10mL包被緩沖液（w/v = 1/10)，在研缽中研磨充分。
[0077] 注：可先加少量緩沖液，待研磨細(xì)后再加入剩余緩沖液繼續(xù)研磨，以防葉片飄浮導(dǎo) 致的研磨困難。
[0078] (3)包被：向酶標(biāo)板孔中加入100 μ L待測(cè)樣品溶液，每次測(cè)定均應(yīng)同時(shí)包被至少 一個(gè)孔的陽性對(duì)照（100 μ L)、一個(gè)空的陰性對(duì)照（100 μ L)和一個(gè)孔的空白對(duì)照（100 μ L 包被緩沖液），建議做一個(gè)重復(fù)。將酶標(biāo)板放于濕盒（帶蓋微波爐飯盒，底部墊上吸水后的 紙）中，4°C孵育過夜，或37°C 2?4h。
[0079] (4)洗滌：將酶標(biāo)板各孔中的液體倒出，可直接翻轉(zhuǎn)傾倒。用8道或12道排槍向 各孔中加滿PBST洗滌緩沖液，放置3min后再次倒掉，此時(shí)可將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)在吸水紙上進(jìn)行 拍打盡量除去液體，重復(fù)洗滌3次。
[0080] (5)封閉：向每孔加入200 μ L5%脫脂奶粉封閉溶液，37°C濕盒中封閉a。
[0081] (6)洗滌：按步驟"4"方法用PBST洗滌各孔3次。
[0082] (7) -抗孵育：取12 μ L(可做96孔樣，可根據(jù)具體樣品數(shù)增減）A1溶液加入到 12mL抗體稀釋緩沖液中（1:1000稀釋），于加樣槽中輕柔混勻（在第"5"步結(jié)束前10分鐘 內(nèi)配制），向酶標(biāo)板各孔中加入100 μ L稀釋后的A1溶液，37°C濕盒中孵育lh。
[0083] (8)洗滌：按步驟"4"方法用PBST洗滌各孔8次。
[0084] (9)酶標(biāo)二抗孵育：將24 μ LA2溶液按1:500比例用抗體稀釋緩沖液稀釋，于加樣 槽中輕柔混勻（在第"7"步結(jié)束前10分鐘內(nèi)配制），向酶標(biāo)板各孔中加入100 μ L稀釋后的 Α2溶液，37°C濕盒中孵育lh。
[0085] (10)準(zhǔn)備底物溶液：取2片PNPP，加入llmL底物緩沖液溶解（濃度：約lmg/mL， 在第（9)步結(jié)束前15分鐘內(nèi)配制），避光保存。
[0086] (11)洗滌：按步驟"4"方法用PBST洗滌酶標(biāo)板各孔8次。
[0087] (12)底物顯色：向各孔中加入現(xiàn)配的PNPP底物溶液，每孔100 μ L，37°C濕盒中顯 色lh。
[0088] 4、結(jié)果分析：
[0089] (1)通過肉眼觀察，陽性對(duì)照應(yīng)為黃色，陰性對(duì)照應(yīng)為無色或淺黃色，空白對(duì)照應(yīng) 為無色，樣品孔若為黃色則基本判斷為PMMoV陽性，無色則為PMMoV陰性。
[0090] (2)在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔405nm的吸光度值（0D405)，若樣品0D405值彡2倍陰性 對(duì)照0D405值則判斷樣品為PMMoV陽性，否則判斷為PMMMoV陰性。若陰性對(duì)照0D405值小 于0. 05,則陰性對(duì)照0D405值均按0. 05計(jì)，即樣品的0D405值彡2X0. 05才能判定為陽性。
[0091] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0092] _序列表_ SEQUENCE LISTING <110〉貴州師范大學(xué) <120〉一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用 <130〉 2014 <160〉 4 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉正向引物 <400> 1 ctacccatgg catacacagt taccagtg 28 <210〉 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉反向引物 <400> 2 ggaattcagg agttgtagcc cacgtaa 27
[0093] <210〉 3 <211〉 18 <212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220> <223〉正向引物STag_Fw <400> 3 gaacgccagc acatggac 18 <210〉 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉反向引物T7 Rv <400〉 4 gctagttatt gctcagcggt 20
【權(quán)利要求】
1. 一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：陽性對(duì)照、陰性對(duì) 照、PMMoV特異性抗血清、酶標(biāo)二抗、顯色底物、封閉液、包被緩沖液、PBST洗滌緩沖液、抗體 稀釋緩沖液、底物緩沖液以及96孔酶標(biāo)板；其中，PMMoV特異性抗血清的制備包括以下具體 步驟： (1) 根據(jù)GenBank中公布的PMMoV各地分離物的CP序列設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR引物： 正向引物：5' -CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG， 反向引物：5' -GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA ; (2) 以感染PMMoV貴州辣椒分離物的組織總RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、純化以及 回收，，得到CP基因片段； (3) 將所述CP基因片段和原核表達(dá)載體pET32a(+)以Nco I和EcoR I兩種DNA限制 性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理、片段回收、連接、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌、重組CP蛋白表達(dá)以及 重組CP蛋白回收； (4) 將所述重組CP蛋白作為抗原免疫家兔制備特異性PMMoV抗血清，免疫后取兔血，即 得到PMMoV特異性抗血清。
2. 如權(quán)利要求1所述的PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陽 性對(duì)照為含PMMoV病毒的辣椒葉片冷凍干燥后研磨成的細(xì)粉；所述陰性對(duì)照為健康無毒辣 椒葉片冷凍干燥后研磨成的細(xì)粉；所述酶標(biāo)二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體溶液。
3. 權(quán)利要求2所述的PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測(cè)試劑盒在辣椒PMMoV的檢測(cè)方 面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104101705SQ201410319878
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】乙引, 洪鯤, 萬晴姣, 張宇斌 申請(qǐng)人:貴州師范大學(xué)