一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建方法及應用，特別涉及一種高靈敏、可定量的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建方法及應用。所述方法是將化學發(fā)光和膠體金免疫層析方法相結(jié)合，包括：將膠體金的表面同時偶聯(lián)上檢測抗體和酶，形成膠體金-酶-抗體復合物，再依次將膠體金-酶-抗體復合物、包被抗體分別噴在樣品結(jié)合墊和膜上，通過免疫層析反應，基于膠體金的顏色深淺實現(xiàn)定性檢測，基于酶催化的化學發(fā)光反應的光強度實現(xiàn)定量檢測，從而構(gòu)建得到化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條；將所述試紙條應用于生物大分子和小分子的檢測。本發(fā)明可同時實現(xiàn)定性、定量和高靈敏的檢測，適合現(xiàn)場檢測和家庭個性化診斷。
【專利說明】一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建及應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫檢測分析領(lǐng)域，具體涉及一種免疫層析試紙條的構(gòu)建方法及應用，尤其涉及一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建及應用。

【背景技術(shù)】
[0002]實現(xiàn)農(nóng)獸藥殘留、傳染性的動植物致病菌、病毒以及臨床樣品中目標物的快速、靈敏、低成本的檢測和診斷對保護人類健康及生命安全、保障環(huán)境和國門安全、維護社會穩(wěn)定具有重要的意義。
[0003]目前比較成熟的檢測方法主要包括儀器分析法、微生物檢測法、分子生物學和免疫學檢測等方法。
[0004]儀器分析法具有靈敏度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但儀器分析法需要復雜的樣品前處理，儀器比較昂貴，檢測成本也比較高，不適合大規(guī)模的樣品篩查和現(xiàn)場快速檢測。例如CN102928531A公開了一種雞肉中喹啉黃的儀器分析法。
[0005]微生物檢測方法簡單、易行，但由于其檢測靈敏度低、耗時長，無法達到現(xiàn)場和快速檢測的要求。CN102353779A公開了一種微生物檢測方法，仍無法達到高靈敏、快速檢測的要求。
[0006]分子生物學方法主要是基于PCR的分析方法，具有檢測靈敏度高，特異性好等優(yōu)點，但需要昂貴的儀器和較高的專業(yè)技術(shù)人員操作，因此其應用受到一定的限制。
[0007]免疫學方法主要包括酶聯(lián)免疫分析和免疫層析試紙條的方法，酶聯(lián)免疫方法具有簡單、靈敏度比較高、成本低等優(yōu)點，適合于大規(guī)模樣品篩查，但其需要多步洗滌，比較耗時耗力，因此其使用也受到一定的限制。
[0008]膠體金免疫層析方法將免疫層析快速分離和反應的優(yōu)勢和膠體金優(yōu)異的光學性能結(jié)合起來，具有快速、簡單、低成本等優(yōu)點，在食品安全，環(huán)境監(jiān)測和臨床診斷等領(lǐng)域得到了廣泛地應用，是一種特別適合現(xiàn)場、快速和床邊診斷的分析方法，但其靈敏度相對比較低，不能實現(xiàn)定量檢測。提高其靈敏度，實現(xiàn)定量化檢測將是膠體金免疫層析方法重要的發(fā)展方向。
[0009]化學發(fā)光反應具有靈敏度高，抗干擾能力很強，特別適合于生物樣品中痕量目標物的檢測，特別是化學發(fā)光屬于自發(fā)光，因此不需要特殊、昂貴的儀器來激發(fā)其發(fā)光，所以將化學發(fā)光作為檢測信號具有其特有的優(yōu)勢。目前，基于辣根過氧化物酶(HRP)催化的魯米諾化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷等領(lǐng)域得到了廣泛地應用。
[0010]目前常用的方法主要是將膠體金法和化學發(fā)光免疫法聯(lián)合使用。如“膠體金法和化學發(fā)光免疫法聯(lián)合檢測血HCG分析”，菜愛玲等，中國誤診學雜志，第12卷第4期，第799頁，2012年；“化學發(fā)光法聯(lián)合膠體金法檢測血清b-HCG”，陳仲平，放射免疫學，第20卷第I期，2007年；都公開了分別采用膠體金和化學發(fā)光免疫法先后檢測血HCG，利用該方法仍然是兩種方法單獨進行檢測，依然存在檢測成本高、耗時耗力的缺陷。CN101113980A公開了一種檢測豬胸膜肺炎抗體的膠體金化學發(fā)光免疫分析方法，該方法是在ELISA的基礎(chǔ)上，用膠體金作為一種標記物，并用強酸溶解后，生成AuC14_離子，再利用化學發(fā)光進行檢測。該方法仍無法同時實現(xiàn)定性和定量檢測，檢測步驟較復雜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種既可定性又可定量的免疫層析試紙條的構(gòu)建及應用，特別是一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建及應用。基于酶的化學發(fā)光反應和免疫層析反應，實現(xiàn)了化學發(fā)光免疫分析和膠體金免疫層析的有機結(jié)合，它具有靈敏度高，既可定性又可定量的特點。
[0012]為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0013]一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下:
[0014]I)將檢測抗體和酶分子按比例加到膠體金溶液中，使膠體金的表面同時偶聯(lián)上檢測抗體和酶分子，形成膠體金-酶-抗體復合物溶液，將所述復合物溶液噴在結(jié)合物墊上；
[0015]2)將包被抗體液噴到膜上形成檢測線1，將羊抗小鼠二抗液噴到膜的另一區(qū)域形成控制線2 ；
[0016]3)將樣品墊、步驟I)所制得的結(jié)合物墊、步驟2)所制得的膜、吸水墊依次粘貼在塑料底襯上，組裝成化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條。
[0017]本發(fā)明采用將膠體金的表面同時偶聯(lián)上檢測抗體和酶分子，一方面，膠體金的顏色深淺可以作為一種可視化的信號分子；另一方面，由于膠體金的比表面積大，其表面可以偶聯(lián)大量的酶分子，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)信號的放大，而且其表面偶聯(lián)的酶分子量也可以作為一種可定量的催化化學發(fā)光的信號分子，因而本發(fā)明實現(xiàn)了定性和定量的同時檢測。
[0018]圖2中的圖a表示樣品中沒有目標物時，檢測線I沒有化學發(fā)光信號和膠體金條帶顏色信號，而控制線2有化學發(fā)光信號和膠體金條帶顏色信號；圖b表示樣品中有目標物存在的情況下，通過抗體-抗原的識別作用，會形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。膠體金-酶-抗體復合物會被捕獲在檢測線I上，檢測線I上的膠體金的被捕獲量與樣品中目標物的含量呈正相關(guān)，進而化學發(fā)光強度和膠體金條帶顏色的信號與目標物的含量成一定的正相關(guān)，從而同時實現(xiàn)了定性和定量檢測。
[0019]作為優(yōu)選技術(shù)方案，步驟I)所述酶選自辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)，優(yōu)選為辣根過氧化物酶(HRP)。
[0020]作為優(yōu)選技術(shù)方案，步驟I)所述的膠體金-酶-抗體復合物的制備包括以下步驟:
[0021 ] 調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值，然后加入抗體和酶，在室溫下振蕩反應，然后加入BSA溶液封閉多余的位點，反應并離心后，去掉上清，加入PBS溶液，重懸，再離心，該步驟重復2-3次，最后得到表面既修飾有抗體，同時偶聯(lián)有酶的復合物，在4°C冰箱保存。
[0022]優(yōu)選地，所述膠體金溶液的pH值調(diào)整為7.0-9.0，例如可以是7.0、7.1、7.3、7.5、
7.8,8.0,8.2,8.5,8.7 或 9.0 ;優(yōu)選為 7.1-8.5 ;更優(yōu)選為 8.5。
[0023]優(yōu)選地，所述酶和抗體的偶聯(lián)比例為100-1:1，例如可以是95-1:1、90_1:1、85-1:1、80-1:1、75-1:1、70-1:1、65-1:1、60-1:1、55-1:1、40-1:1、30-1:1、20-1:1、15-1:1、10:1 ;優(yōu)選為80-5:1，更優(yōu)選為10:1。
[0024]優(yōu)選地，所述BSA溶液的濃度為3% ;所述PBS溶液的濃度為0.01M, pH值為7.4。
[0025]優(yōu)選地，所述室溫下振蕩反應時間為1-2小時；加入BSA溶液封閉位點后的反應時間為0.5-1小時；所述離心時間為10-20分鐘；所述離心轉(zhuǎn)速為10000-12000r/min。
[0026]優(yōu)選地，所述膠體金、酶和抗體偶聯(lián)的方式包括靜電吸附偶聯(lián)，或者先構(gòu)建膠體金-鏈霉親和素復合物，同時制備生物素化的抗體和酶分子，通過生物素-鏈霉親和素這個信號放大系統(tǒng)，實現(xiàn)膠體金-抗體-酶分子復合物的構(gòu)建。
[0027]作為優(yōu)選技術(shù)方案，步驟I)所述的結(jié)合物墊為玻璃纖維、聚酯纖維膜或人造纖維中的任意一種，優(yōu)選為玻璃纖維。
[0028]作為優(yōu)選技術(shù)方案，步驟2)所述的膜為硝酸纖維素膜(NC)、偏氟乙烯均聚物膜(PVDF)或者尼龍膜，優(yōu)選為硝酸纖維素膜(NC)。
[0029]一種同時實現(xiàn)定性和定量檢測的試紙條使用方法，采用權(quán)利要求1-7任一項所述的試紙條，包括如下步驟:
[0030]I)將待測樣品加到所述試紙條上,免疫層析反應5-10min ;
[0031]2)肉眼觀察所述試紙條上檢測線(I)上膠體金顏色的深淺，得到所述試紙條定性檢測樣品的結(jié)果；
[0032]3)然后在原來的試紙條上添加化學發(fā)光底物，并用化學發(fā)光儀采集化學發(fā)光信號，化學發(fā)光強度和酶分子的量成正相關(guān)，而酶分子的量和待檢抗原成線性相關(guān)，因此，通過化學發(fā)光強度得到定量檢測樣品的結(jié)果。
[0033]將本發(fā)明的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條用于檢測生物大分子和/或小分子的應用。
[0034]作為優(yōu)選技術(shù)方案，將本發(fā)明的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條用于蛋白的檢測，優(yōu)選甲胎蛋白(AFP)、胎癌蛋白(CEA)和/或尿液中甲基安非他明的檢測。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0036](I)本發(fā)明基于膠體金優(yōu)異的光學性質(zhì)和比表面積大的優(yōu)勢，結(jié)合化學發(fā)光高靈敏，定量檢測技術(shù)，構(gòu)建了一種靈敏度高，既可定性同時可定量的免疫層析分析方法，在實現(xiàn)定量的同時，靈敏度可以提高I個數(shù)量級，不需要任何特殊的儀器設(shè)備，操作簡單。
[0037](2)本發(fā)明的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條具有普遍的適用性，可以檢測生物大分子(細菌、病毒和蛋白質(zhì)等)，也可以檢測小分子(農(nóng)獸藥殘留，尿液中的毒品等小分子)，適合現(xiàn)場檢測和家庭個性化診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1是傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條示意圖
[0039]圖2是高靈敏、可定量的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條原理
[0040]圖3是化學發(fā)光-膠體金試紙條可視化檢測甲胎蛋白(AFP)的結(jié)果圖
[0041]圖4是化學發(fā)光-膠體金試紙條定量檢測AFP的結(jié)果圖
[0042]圖5是化學發(fā)光-膠體金試紙條可視化檢測胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果圖
[0043]圖6是化學發(fā)光-膠體金試紙條定量檢測胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果圖
[0044]圖7是化學發(fā)光-膠體金試紙條同時檢測甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果圖
[0045]圖8是化學發(fā)光-膠體金試紙條同時定量檢測甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果圖
[0046]其中:1-檢測線；2_控制線；3_加樣區(qū)域；4_觀察區(qū)域。

【具體實施方式】
[0047]下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0048]實施例中所用的試劑、儀器和設(shè)備來源如下:
[0049]I甲胎蛋白、胎癌蛋白及相關(guān)的抗體:北京熱景生物技術(shù)有限公司；
[0050]2化學發(fā)光底物購自Millipore公司；
[0051]3膠體金構(gòu)建的相關(guān)試劑購自sigma公司；
[0052]4硝酸纖維素膜:默克密理博；
[0053]5三維平面劃膜儀和三維平面噴金儀:上海金標生物科技有限公司；
[0054]6冷凍干燥機:北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；
[0055]7切條機:上海金標生物科技有限公司；
[0056]8PVC膠板、吸水紙、玻璃纖維膜和卡殼:上海金標生物科技有限公司。
[0057]實施例1
[0058]圖1和圖2分別是免疫層析試紙條示意圖和化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建原理圖。該化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條構(gòu)建具體步驟如下:
[0059]I)膠體金-酶-抗體復合物的制備:
[0060]將1mL的膠體金溶液pH值調(diào)至8.5,然后分別加入0.0lmg的檢測抗體和0.2mg的辣根過氧化物酶(HRP)，所述酶和抗體的偶聯(lián)比例為10:1，在室溫下輕輕地振蕩反應1-2小時，然后加入3mL濃度為3%的BSA溶液封閉多余的位點，反應0.5-1小時，然后離心10-20分鐘，離心力為10000-12000r/min，去掉上清，加入2mL濃度為0.01M, pH值為1.4的含0.1 % BSA的PBS溶液，重懸，再離心，該步驟重復2-3次，最后得到表面既修飾有檢測抗體，同時偶聯(lián)有酶分子的復合物，將ImL上述制備得到的膠體金-酶-抗體復合物噴在結(jié)合物墊上。
[0061]2)將0.1mg包被抗體噴到硝酸纖維素膜上形成檢測線1，將0.2mg羊抗小鼠二抗液噴到膜的另一區(qū)域形成控制線2。
[0062]3)化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建:
[0063]將塑料底襯、樣品墊、步驟I)所制得的結(jié)合物墊、步驟2)所制得的膜、吸水墊進行粘貼，組裝成化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條。
[0064]在本發(fā)明化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的檢測線I上富集的膠體金顏色深淺作為定性的標準，同時膠體金表面偶聯(lián)的酶分子催化化學發(fā)光反應而發(fā)光，并且發(fā)光強度和酶分子的量成正比，通過所述的發(fā)光強度實現(xiàn)定量檢測。
[0065]實施例2
[0066]檢測甲胎蛋白(AFP)。
[0067]實驗步驟如下:
[0068](I)用 PBS 緩沖溶液構(gòu)建成濃度為 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、Ing/mL和Ong/mL的AFP溶液，然后分別添加到化學發(fā)光_膠體金免疫層析試紙條上，免疫層析反應5-10min ；
[0069](2)肉眼觀察試紙條上膠體金顏色的深淺，并用相機拍照，得到可視化檢測AFP的結(jié)果;
[0070](3)在原來的試紙條上，添加化學發(fā)光底物，并用化學發(fā)光儀對其結(jié)果進行定量檢測。
[0071]圖3是化學發(fā)光-膠體金試紙條可視化檢測甲胎蛋白(AFP)的結(jié)果，從圖3膠體金的顏色可以看出，該試紙條對AFP的最低檢出限為10ng/mL。
[0072]圖4是化學發(fā)光-膠體金試紙條定量檢測甲胎蛋白(AFP)的結(jié)果，從圖4膠體金的顏色可以看出，該試紙條對AFP的最低檢出限可以達到Ing/mL，并且化學發(fā)光的強度和AFP待檢抗原的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，實現(xiàn)了定量檢測。
[0073]經(jīng)過該對比實驗可以得出:采用化學發(fā)光-膠體金模式的試紙條靈敏度提高了 10倍。并且同時實現(xiàn)了定性和定量檢測。
[0074]實施例3
[0075]檢測血清中的胎癌蛋白(CEA)。
[0076]實驗步驟如下:
[0077](I)用 PBS 緩沖溶液構(gòu)建成濃度為 200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、Ing/mL和Ong/mL的CEA溶液，然后分別添加到化學發(fā)光_膠體金試紙條上，免疫層析反應5-10min ；
[0078](2)肉眼觀察試紙條上膠體金顏色的深淺，并用相機拍照，得到可視化檢測CEA的結(jié)果;
[0079](3)在原來的試紙條上，添加化學發(fā)光底物，并用化學發(fā)光儀對其結(jié)果進行定量檢測。
[0080]圖5是化學發(fā)光-膠體金試紙條可視化檢測胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果，從圖5膠體金的顏色可以看出，該試紙條對CEA的最低檢出限為10ng/mL。
[0081]圖6是化學發(fā)光-膠體金試紙條定量檢測胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果，從圖6膠體金的顏色可以看出，該試紙條對CEA的最低檢出限可以達到Ing/mL，并且化學發(fā)光的強度和CEA待檢抗原的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，實現(xiàn)了定量檢測。
[0082]經(jīng)過該對比實驗可以得出:采用化學發(fā)光-膠體金模式的試紙條靈敏度提高了 10倍。并且同時實現(xiàn)了定性和定量檢測。
[0083]實施例4
[0084]同時檢測血清中的甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)。
[0085]實驗步驟如下:
[0086](I)將一系列不同濃度的 AFP 溶液(200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、Ong/mL)和 CEA 溶液(200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、I Ong/mL、2ng/mL、Ong/mL)等體積混合在一起,將混合液滴加在化學發(fā)光-膠體金試紙條的加樣墊上，免疫層析反應5-10min ；
[0087](2)肉眼觀察試紙條上膠體金顏色的深淺，并用相機拍照，得到可視化同時檢測AFP和CEA的結(jié)果；
[0088](3)然后在原來的試紙條上，添加化學發(fā)光底物，用化學發(fā)光底物觀察化學發(fā)光的信號，并用化學發(fā)光儀對其結(jié)果進行定量檢測。
[0089]圖7是化學發(fā)光-膠體金試紙條同時檢測甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果，圖8是化學發(fā)光-膠體金試紙條定量同時檢測甲胎蛋白(AFP)和胎癌蛋白(CEA)的結(jié)果，經(jīng)過該對比實驗可以得出:化學發(fā)光-膠體金試紙條檢測的靈敏度提高了 10倍，并且化學發(fā)光的強度分別和AFP或CEA待檢抗原的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而實現(xiàn)了定性和定量檢測。
[0090]實施例5
[0091]檢測尿液中的甲基安非他明。
[0092]實驗步驟如下:
[0093](I)將一系列不同濃度的甲基安非他明(500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、Ing/mL、Ong/mL)滴加到化學發(fā)光-膠體金試紙條的加樣墊上，免疫層析反應5-10min ；
[0094](2)肉眼觀察試紙條上膠體金顏色的深淺，并用相機拍照，得到可視化檢測甲基安非他明的結(jié)果；
[0095](3)然后在原來的試紙條上添加化學發(fā)光底物，用化學發(fā)光底物觀察化學發(fā)光的信號，并用化學發(fā)光儀對其進行定量分析檢測。
[0096]對比實驗結(jié)果顯示:化學發(fā)光-膠體金試紙條檢測的靈敏度提高了 10倍，并且同時實現(xiàn)了定性和定量檢測。
[0097] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)將檢測抗體和酶分子按比例加到膠體金溶液中，使膠體金的表面同時偶聯(lián)所述抗體和酶分子，形成膠體金-酶-抗體復合物溶液，并將所述復合物溶液噴在結(jié)合物墊上； 2)將包被抗體液噴到膜上形成檢測線(I)，將羊抗小鼠二抗液噴到膜的另一區(qū)域形成控制線⑵； 3)將樣品墊、步驟I)所制得的結(jié)合物墊、步驟2)所制得的膜、吸水墊依次粘貼在塑料底襯上，組裝成化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條； 在所述試紙條中，檢測線(I)上膠體金顏色的深淺作為定性的依據(jù)，同時膠體金表面偶聯(lián)的酶分子數(shù)量作為化學發(fā)光定量的依據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的酶為辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)，優(yōu)選為辣根過氧化物酶(HRP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的膠體金-酶-抗體復合物的制備方法包括如下步驟: 調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH值，然后加入檢測抗體 和酶分子，在室溫下振蕩反應，然后加入BSA溶液封閉多余的位點，反應并離心后，去掉上清液，加入含0.1% BSA的PBS溶液，重懸，再離心，該步驟重復2-3次，得到表面既修飾有檢測抗體，同時偶聯(lián)有酶分子的復合物，在4 °C冰箱保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述膠體金溶液的pH值調(diào)整為7.0-9.0,優(yōu)選為7.1-8.5 ;更優(yōu)選為8.5 ； 優(yōu)選地，所述酶分子和檢測抗體的偶聯(lián)比例為100-1:1，優(yōu)選為80-5:1，更優(yōu)選為10:1 ； 優(yōu)選地，所述BSA溶液的濃度為3% ;所述PBS溶液的濃度為0.01M, pH值為7.4 ; 優(yōu)選地，所述室溫下振蕩反應時間為1-2小時；加入BSA溶液封閉位點后的反應時間為0.5-1小時；所述離心時間為10-20分鐘；所述離心轉(zhuǎn)速為10000-12000r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，步驟I)所述膠體金、酶分子和檢測抗體偶聯(lián)的方式包括:靜電引力吸附偶聯(lián)或者先構(gòu)建膠體金-鏈霉親和素復合物，同時制備生物素化的抗體和酶分子，通過生物素-鏈霉親和素這個信號放大系統(tǒng)，實現(xiàn)膠體金-酶-抗體復合物的制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的結(jié)合物墊為玻璃纖維、聚酯纖維膜或人造纖維中的任意一種，優(yōu)選為玻璃纖維。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的膜為硝酸纖維素膜(NC)、PVDF膜或者尼龍膜，優(yōu)選為硝酸纖維素膜(NC)。
8.一種同時實現(xiàn)定性和定量檢測的試紙條使用方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-7任一項所述的試紙條，包括如下步驟: 1)將待測樣品加到所述試紙條上，免疫層析反應5-10min； 2)肉眼觀察所述試紙條上檢測線(I)上膠體金顏色的深淺，得到所述試紙條定性檢測樣品的結(jié)果； 3)然后在原來的試紙條上添加化學發(fā)光底物，并用化學發(fā)光儀采集化學發(fā)光信號，化學發(fā)光強度和酶分子的量成正相關(guān)，而酶分子的量和待檢抗原成正相關(guān)，因此，通過化學發(fā)光強度得到定量檢測樣品的結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述方法得到的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條在檢測生物大分子和/或小分子中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，將所述的化學發(fā)光-膠體金免疫層析試紙條用于蛋白的檢測，優(yōu)選甲胎蛋白(AFP)、胎癌蛋白(CEA)和/或尿液中甲基安非他明的檢測。
【文檔編號】G01N33/543GK104076140SQ201410325350
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】蔣興宇, 陳翊平, 曹豐晶, 張曉青, 張偉, 查瑞濤 申請人:國家納米科學中心