一種草魚白細(xì)胞介素1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種草魚白細(xì)胞介素1β(IL-1β)競(jìng)爭抑制酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，它包含如下組分：(1)酶標(biāo)板；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1β多克隆抗體濃縮液；(3)樣品稀釋液；(4)濃縮洗滌液；(5)濃縮包被液；(6)顯色底物；(7)終止液；(8)草魚白細(xì)胞介素1β標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明試劑盒具有操作簡單，重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和特異性良好，檢測(cè)線性范圍廣的特點(diǎn)。
【專利說明】-種草魚白細(xì)胞介轟IP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種草魚白細(xì)胞介素1目競(jìng)爭抑制酶聯(lián)免疫 檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[000引 白細(xì)胞介素1目（interle址in-1目，比-1目）是一種重要的炎癥介質(zhì)和免疫因子， 在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用，如激活T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活 性，刺激巨瞻細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和前列腺素等炎癥介質(zhì)，此外還可充當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系 統(tǒng)間的傳導(dǎo)信號(hào)，W監(jiān)視生理失調(diào)和病原入侵。作為潛在的炎癥介質(zhì)和共刺激信號(hào)分子， 白細(xì)胞介素1目可W促進(jìn)前列腺素（PG)的合成和誘導(dǎo)發(fā)熱，提高巨瞻細(xì)胞的吞瞻活性， 并可調(diào)節(jié)其它細(xì)胞因子的表達(dá)。
[0003] 草魚（Cteno地aryngodon idellus)屬纏形目纏科雅羅魚亞科草魚屬，是中國淡水 養(yǎng)殖的四大家魚之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但草魚抗病力和成活率較低，易患出血病、爛 觸病、赤皮病和腸炎病等，加之高密度養(yǎng)殖增加了水產(chǎn)動(dòng)物之間病原體交叉感染的機(jī)會(huì)，使 病害日益加劇，因此研究草魚免疫系統(tǒng)的各類免疫反應(yīng)及其機(jī)制十分必要。白細(xì)胞介素1目 在草魚免疫反應(yīng)中具有廣泛生物學(xué)活性，對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控發(fā)揮著必不可少的作用。但是， 目前草魚白細(xì)胞介素1目的分泌檢測(cè)方法并沒建立，主要因?yàn)椴蒴~白細(xì)胞介素1目與哺乳 動(dòng)物、兩棲動(dòng)物的白細(xì)胞介素1目分子結(jié)構(gòu)差異較大，不能用其他物種的白細(xì)胞介素1目抗 體來識(shí)別草魚魚白細(xì)胞介素1目。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種草魚白細(xì)胞介素1目酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。 本發(fā)明還提供了該試劑盒的使用方法和用途。
[0005] 本發(fā)明利用重組表達(dá)的草魚白細(xì)胞介素1目作為抗原包被酶標(biāo)板W及免疫健康 白兔制備多克隆抗體，再用辣根過氧化物酶（HR巧標(biāo)記該多克隆抗體，然后加入經(jīng)賠育后 的待測(cè)樣品和HRP標(biāo)記的多克隆抗體混合液，讓酶標(biāo)板上重組草魚白細(xì)胞介素1目與樣品 中的草魚白細(xì)胞介素1目競(jìng)爭結(jié)合抗體，通計(jì)算抑制率來檢測(cè)樣品中草魚白細(xì)胞介素1目 含量。
[0006] 本發(fā)明提供了一種草魚白細(xì)胞介素1目酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，它包含如下組分： (1) 96孔可拆卸的酶標(biāo)板；（2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1目多克隆抗體濃縮 液；（3)樣品稀釋液；(4)濃縮洗涂液；（5)濃縮包被液；(6)顯色物底物；(7)終止液；(8)草 魚白細(xì)胞介素1目標(biāo)準(zhǔn)品。
[0007] 其中，上述草魚白細(xì)胞介素1目多克隆抗體是W重組草魚白細(xì)胞介素1目蛋白為 抗原，免疫新西蘭大白兔并利用多克隆抗體制備與純化技術(shù)獲得抗草魚白細(xì)胞介素1目多 克隆抗體，該抗體可與草魚白細(xì)胞介素1目特異的結(jié)合。
[0008] 進(jìn)一步地，上述重組草魚白細(xì)胞介素1目蛋白是通過將草魚IL-I目基因序列克 隆到原核表達(dá)載體祀T-30a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，并將此載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL2UDE3)中進(jìn)行原核表達(dá)所得（周紅、楊瀟、汪新艷，一種草魚白細(xì)胞介素1目基因和蛋白 及其重組表達(dá)方法，中國專利申請(qǐng)?zhí)枺?01010221742. 9)。
[0009] 其中，上述辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1目多克隆抗體為采用馬 來醜亞胺活化的辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑盒（購自上海西寶生物科技有限公司，貨號(hào)： AZK0012A)標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1目多克隆抗體。
[0010] 優(yōu)選地，上述多克隆抗體的濃度為5mg/ml。
[0011] 其中，上述樣品稀釋液為含0. 2%牛血清白蛋白炬SA)的洗涂液，每升稀釋液中含 KH2PO4O. 2g，化2冊(cè)〇42. 9g，化C18. Og, BSA2. Og,吐溫-200. 5ml，PH7. 4 ;
[0012] 其中，上述濃縮洗涂液為含0. 5%吐溫-20的0. 2M磯酸鹽緩沖液，每升濃縮洗涂液 中含皿2口〇42. Og,化2冊(cè)〇429. Og, NaClSO. Og,吐溫"2〇5. Oml, PHL 4 ;
[001引其中，上述濃縮包被液為0. 5M的碳酸鹽緩沖液，每升濃縮包被液中含化CO3I5. 9g， NaHCCyg. 3g，P冊(cè).6。
[0014] 其中，顯色物底物TMB為可溶型單組分TMB底物溶液（購自天根生化科技有限公 司，貨號(hào)：PA107-02)。
[0015] 其中，上述終止液為2M硫酸溶液。
[0016] 其中，上述草魚白細(xì)胞介素1目標(biāo)準(zhǔn)品為按Img每管分裝的重組草魚白細(xì)胞介素 1目蛋白。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述試劑盒的使用方法，它包括如步驟：
[0018] (1)包被；將濃縮包被液稀釋10倍即為包被液，W包被液將重組草魚白細(xì)胞介素 1目蛋白稀釋至2 y g/mU根據(jù)待檢樣品數(shù)量，按100 y 1每孔加入酶標(biāo)板孔中，4C賠育過夜 后甩干孔內(nèi)液體，每孔加入洗涂液300 y 1，洗涂3次，每次3分鐘。
[0019] (2)封閉；將濃縮洗涂液稀釋10倍即為洗涂液，用洗涂液溶解5%脫脂奶粉、 0. 3% BSA即為封閉液，每孔加入封閉液300 yl，室溫封閉兩小時(shí)后，甩干，每孔加入洗涂液 300 U 1，洗涂3次，每次3分鐘。
[0020] (3)酶標(biāo)抗體與抗原的賠育：用樣品稀釋液將重組草魚白細(xì)胞介素1目蛋白分別 稀釋到Ing/血、2. Sng/血、5ng/血、7. Sng/血、IOng/血、15ng/mL作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋液作 為陰性對(duì)照，分別取標(biāo)準(zhǔn)品50 y 1、待測(cè)樣品50 y 1、樣品稀釋液50 y 1與50 y 1適當(dāng)稀釋的 辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1目多克隆抗體混勻后室溫賠育2小時(shí)；待酶標(biāo)板 封閉、洗涂后，加入上述抗原抗體混合液，室溫賠育2小時(shí)。
[0021] (4)顯色；甩干孔內(nèi)液體，每孔加入洗涂液300 y 1，洗涂5次，每次3分鐘。洗涂 后甩干孔內(nèi)液體，然后每孔加入IOOy 1顯色底物TMB，37°C反應(yīng)30分鐘后每孔加入50 y 1 2MH2SO4終止反應(yīng)。
[0022] (5)讀數(shù)、結(jié)果處理；采用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取吸光度值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì) 算樣品抑制率，樣品抑制率％ =(陰性對(duì)照吸光值-標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品吸光值）/陰性樣 品吸光值X 100 %，最后W標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲 線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品中草魚白細(xì)胞介素1目的濃度。
[0023] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述試劑盒在制備草魚免疫調(diào)節(jié)功能檢測(cè)試劑中的用途。
[0024] 本發(fā)明W重組草魚白細(xì)胞介素1目蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)草魚白細(xì)胞介素 I目的化ISA方法，為檢測(cè)草魚血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素I目的蛋白表達(dá)水平提供 了快速高效的檢測(cè)手段，該法穩(wěn)定可靠，且成本較低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[002引圖1草魚白細(xì)胞介素1目ELISA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0026] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027] 實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成及其使用方法
[0028] 1.本發(fā)明試劑盒的組成
[0029] (1)96孔可拆卸酶標(biāo)板；
[0030] (2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1目多克隆抗體濃縮液；
[0031] (3)樣品稀釋液；含0. 2%牛血清白蛋白炬SA)的洗涂緩沖液，每升稀釋緩沖液中 含 KH2PO4O. 2g，化2冊(cè)〇42. 9g，化C18. Og, BSA2. Og,吐溫-200. 5ml，PH7. 4 ;
[0032] (4)濃縮洗涂液；含0. 5 %吐溫-20的0. 2M磯酸鹽緩沖液，每升濃縮洗涂液中含 KH2PO42. Og,化2冊(cè)〇429. Og, NaClSO. Og,吐溫-205. Oml, PH7. 4 ;
[0033] 妨濃縮包被液；0. 5M的碳酸鹽緩沖液，每升濃縮包被液中含化CO3I5. 9g， NaHCCyg. 3g，P冊(cè).6 ;
[0034] (6)顯色底物；可溶型單組分TMB底物溶液；
[00對(duì) （7)終止液；2M硫酸溶液；
[0036] (8)草魚白細(xì)胞介素1目標(biāo)準(zhǔn)品：按Img每管分裝的重組草魚白細(xì)胞介素1目蛋 白。商品化的試劑盒組成見表1 ;
[0037] 表1本發(fā)明試劑盒的主要組分
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種草魚白細(xì)胞介素1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于：它包含如下組分： (1) 酶標(biāo)板； (2) 辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1β多克隆抗體濃縮液； (3) 樣品稀釋液； (4) 濃縮洗滌液； (5) 濃縮包被液； (6) 顯色底物； (7) 終止液； (8) 草魚白細(xì)胞介素1β標(biāo)準(zhǔn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述草魚白細(xì)胞介素1β多克隆抗體 由如下方法制備： (1) 以重組草魚白細(xì)胞介素1β蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔； (2) 利用多克隆抗體制備與純化技術(shù)獲得抗草魚白細(xì)胞介素1β多克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì) 胞介素1β多克隆抗體是由馬來酰亞胺活化的辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1β 多克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述多克隆抗體的濃度為5mg/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于： 所述樣品稀釋液為含〇. 2%牛血清白蛋白的洗滌液，每升稀釋液中含KH2P040. 2g， Na2HP042. 9g，NaC18. 0g，牛血清白蛋白 2. 0g，吐溫-200. 5ml，PH7. 4 ; 所述濃縮洗滌液為含〇. 5%吐溫-20的0. 2M磷酸鹽緩沖液，每升濃縮洗滌液中含 KH2P042. 0g，Na2HP0429. 0g，NaC180. 0g，吐溫-205. 0ml，PH7. 4 ; 所述濃縮包被液為〇. 5M的碳酸鹽緩沖液，每升濃縮包被液中含NaC0315.9g， NaHC0329. 3g, PH9. 6 ； 所述顯色物底物為可溶型單組分TMB底物溶液； 所述終止液為2M硫酸溶液； 所述草魚白細(xì)胞介素1β標(biāo)準(zhǔn)品為按lmg每管分裝的重組草魚白細(xì)胞介素1β蛋白。
6. 權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述試劑盒的使用方法，其特征在于：它包含如下步驟： (1) 包被：將濃縮包被液稀釋10倍即為包被液，以包被液將重組草魚白細(xì)胞介素1 β 蛋白稀釋至2μ g/mL，根據(jù)待檢樣品數(shù)量，按?οομ 1每孔加入酶標(biāo)板孔中，4°C孵育過夜后 甩干孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液300 μ 1，洗滌3次，每次3分鐘。 (2) 封閉：將濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液，用洗滌液溶解5%脫脂奶粉、0. 3%牛血 清白蛋白即為封閉液，每孔加入封閉液300 μ 1，室溫封閉兩小時(shí)后，甩干，每孔加入洗滌液 300 μ 1，洗滌3次，每次3分鐘。 (3) 酶標(biāo)抗體與抗原的孵育：用樣品稀釋液將重組草魚白細(xì)胞介素1β蛋白分別稀釋 至lj lng/mL、2. 5ng/mL、5ng/mL、7. 5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL 作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品稀釋液作為陰 性對(duì)照；分別取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μ 1、待測(cè)樣品50 μ 1、樣品稀釋液50 μ 1與50 μ 1適當(dāng)稀 釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的草魚白細(xì)胞介素1β多克隆抗體混勻后室溫孵育2小時(shí)；待酶 標(biāo)板封閉、洗漆后，加入上述抗原抗體混合液，室溫孵育2小時(shí)。 (4) 顯色：甩干孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液300 μ 1，洗滌5次，每次3分鐘；洗滌后 甩干孔內(nèi)液體，然后每孔加入100 μ 1顯色底物TMB，37°C反應(yīng)30分鐘后每孔加入50 μ 1 2MH2S04終止反應(yīng)。 (5) 讀數(shù)、結(jié)果處理：采用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取吸光度值；根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算樣 品抑制率，樣品抑制率％ =(陰性對(duì)照吸光值-標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品吸光值）/陰性樣品吸光 值X 100% ;最后以標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通 過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品中草魚白細(xì)胞介素1β的濃度。
7.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的試劑盒在制備草魚免疫調(diào)節(jié)功能檢測(cè)試劑中的用途。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104237529SQ201410327933
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】周紅, 楊瀟 申請(qǐng)人:電子科技大學(xué)