一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法，以用于腎臟毒性研究。在利用斑馬魚胚胎模型進(jìn)行化合物腎臟毒性作用的研究中，通過對胚胎組織中的肌酐成分進(jìn)行提取，并利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法測定其含量，作為評價胚胎腎臟功能的檢測指標(biāo)，從而建立一種快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的化合物腎臟毒性評價體系。
【專利說明】一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法，屬于 毒理學(xué)檢測領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 腎臟是機(jī)體的重要器官，能排出體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物，調(diào)節(jié)機(jī)體水、電 解質(zhì)平衡，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。作為機(jī)體的主要排泄器官，腎臟極易受到體內(nèi)各種代謝 廢物、毒物的影響，這些物質(zhì)往往具有潛在的腎臟毒性。隨著社會發(fā)展，金屬、冶煉業(yè)、化工 企業(yè)增多，加之醫(yī)藥及各種農(nóng)藥的濫用，環(huán)境污染日益加重，人群接觸腎毒性物質(zhì)的機(jī)會增 力口，中毒性腎病的發(fā)病率大幅增長。臨床上腎毒物質(zhì)導(dǎo)致的腎臟損傷，常表現(xiàn)為急性腎功能 衰竭（acute renal failure, ARF)，約占急性腎衰的5?25%。急性腎衰起病兇險，死亡率 高，患者多需要終身進(jìn)行透析治療甚至換腎，給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和沉重的經(jīng) 濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，確立快速、有效的評價體系或評價方法來檢測化合物的腎臟毒性作用，對中 毒性腎臟損害的早期預(yù)防具有顯著意義。
[0003] 目前已有的關(guān)于化合物腎臟毒性方面的研究多以大鼠、小鼠、家兔等哺乳動物為 模型進(jìn)行，腎臟功能的檢測手段主要有血、尿生化指標(biāo)測定，以及腎臟組織病理學(xué)觀察，這 些動物體格較大，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)成本高，所需周期長，很難實(shí)現(xiàn)化合物毒性的高通量檢測。利 用培養(yǎng)細(xì)胞系進(jìn)行體外毒性分析是早期毒性評價的重要替代方法，可快速產(chǎn)生大量的初步 結(jié)果，由于體外細(xì)胞脫離了腎臟所處的復(fù)雜的機(jī)體內(nèi)環(huán)境，不能真實(shí)反映體內(nèi)各器官相互 作用下腎臟功能的變化，所獲得的結(jié)果需要到活體動物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，評價模型 的選擇成為實(shí)現(xiàn)化合物毒性快速檢測的瓶頸。
[0004] 斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚，屬鯉科。其成魚僅約3-4厘米長，產(chǎn)卵量大，胚胎 透明而且體外發(fā)育，非常便于操作和觀察。其胚胎發(fā)育周期短，許多研究在胚胎期即可進(jìn) 行。斑馬魚基因組序列與人類基因組高度相似，包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多個重要 組織器官在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能及病理反應(yīng)上與人類相仿，使其作為一種理想的脊椎模式 生物，在發(fā)育生物學(xué)、化合物毒性評價和人類疾病模型研究等領(lǐng)域迅速得到廣泛應(yīng)用。
[0005] 斑馬魚胚胎受精后 14h(14hpf，14hours post-fertilization)腎臟開始發(fā)育， 72hpf時腎臟發(fā)育完成。最早在48hpf可以觀察到腎小球?yàn)V過現(xiàn)象。斑馬魚腎臟分為幼魚 期的前腎和成魚期的中腎，前腎由一對腎單位組成，腎小球在背主動脈腹側(cè)的胚胎正中線 處融合，腎小管分居兩偵彳。前腎的解剖結(jié)構(gòu)比成魚的中腎及哺乳動物的后腎簡單，但在細(xì)胞 組成及分子水平上與哺乳動物的腎臟相似，并已具備同樣復(fù)雜的生物功能。斑馬魚發(fā)育第 一周內(nèi)，由于鰓還未發(fā)育完全，主要依賴腎臟排出體內(nèi)多余的水分和代謝廢物，加之此階段 仔魚不必喂食即可存活，干擾因素少，非常有利于開展腎臟毒性相關(guān)的研究。斑馬魚胚胎作 為整體動物模型，能夠真實(shí)反映腎臟在心血管系統(tǒng)、免疫細(xì)胞等內(nèi)環(huán)境作用下的病理變化， 具備了活體動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性高的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 目前，在利用斑馬魚胚胎進(jìn)行化合物腎臟毒性研究中，對腎臟損傷的檢測主要包 括表型改變、腎臟病理和腎小球?yàn)V過率估測等幾方面。其中，腎小球?yàn)V過率是直接反映腎 臟功能狀態(tài)的重要量化指標(biāo)，在斑馬魚胚胎是通過計算體內(nèi)菊粉等類似物質(zhì)的清除速率測 得，需要將顯色標(biāo)記的菊粉經(jīng)胚胎心靜脈竇注入循環(huán)血液內(nèi)，由于胚胎較小，此方法對儀器 和技術(shù)要求比較高，操作難度大。疾病導(dǎo)致機(jī)體病理生理發(fā)生變化，必然引起組織中代謝組 分含量的變化，對這些組分，尤其是一些與器官功能狀態(tài)密切相關(guān)的生物標(biāo)志物含量的檢 測，是診斷疾病發(fā)生、發(fā)展的重要依據(jù)。肌酐是肌肉的代謝產(chǎn)物，由前體化合物磷酸肌酸轉(zhuǎn) 化而成，主要由腎臟排出體外。腎功能受損時，肌酐在體內(nèi)蓄積成為有害毒素。在臨床上， 檢測血、尿肌酐值是了解腎臟功能的重要指標(biāo)。斑馬魚胚胎體積小，難以獲取血液或尿液樣 本，目前，有關(guān)斑馬魚胚胎體內(nèi)肌酐含量的數(shù)據(jù)資料及腎功能受損后肌酐水平變化方面的 研究尚屬空白。鑒于肌酐在腎功檢測中的重要意義，在利用斑馬魚胚胎進(jìn)行化合物腎臟毒 性研究時，有必要通過一種準(zhǔn)確、可靠的方法對此指標(biāo)進(jìn)行考察，以進(jìn)一步補(bǔ)充完善腎臟功 能評價體系。
[0007] 本發(fā)明利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法，對斑馬魚胚胎組織中的肌酐含量進(jìn)行測 定，并與正常斑馬魚胚胎組織的肌酐含量值比較，用于快速、可靠的檢測化合物的腎臟毒性 作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物 腎臟毒性的方法。
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種以組織中肌酐含量為指標(biāo)的腎臟毒性評價方法，以用于 腎臟毒性研究，在利用斑馬魚胚胎模型進(jìn)行化合物腎毒性作用的研究中，通過對胚胎組織 中的肌酐成分進(jìn)行提取，并利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法測定其含量，可以以胚胎組織中的 肌酐含量變化作為檢測腎臟功能的指標(biāo)，建立一種快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的化合物腎臟毒性 的評價體系。
[0010] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0011] 一種通過測定組織中肌酐的含量變化檢測化合物腎臟毒性的方法，步驟如下：
[0012] (1)將發(fā)育3?6天的斑馬魚胚胎移入含有待測化合物的培養(yǎng)水中，在28°C，14h 光照/l〇h黑暗條件下培養(yǎng)24?72h，作為測試組，然后去除死亡胚胎，用純水洗凈胚胎表面 殘留液后，獲得培育后胚胎，所述培育后胚胎距受精時間不超過7天；
[0013] 發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，受精時間超過7天后的胚胎，由于受到多種干擾因素影響， 會導(dǎo)致檢測準(zhǔn)確率降低。
[0014] 在相同條件下用培養(yǎng)水培養(yǎng)作為正常胚胎組；
[0015] (2)向培育后胚胎加入內(nèi)標(biāo)溶液，經(jīng)勻漿、分層提取其中的極性組分，提取樣品經(jīng) 氮吹干后，加入純水溶解，然后過〇. 45 μ m聚醚砜水相濾膜，將濾液注入LC-MS/MS，進(jìn)行分 離分析；然后分別將肌酐標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入LC-MS/MS，在相同條件下進(jìn)行 檢測；
[0016] (3)根據(jù)如下公式：
[0017]

【權(quán)利要求】
1. 一種通過測定組織中肌酐的含量變化檢測化合物腎臟毒性的方法，其特征在于，步 驟如下： (1) 將發(fā)育3?6天的斑馬魚胚胎移入含有待測化合物的培養(yǎng)水中，在28°C，14h光照 /l〇h黑暗條件下培養(yǎng)24?72h，做為測試組，去除死亡胚胎，經(jīng)純水洗凈胚胎表面殘留液 后，獲得培育后胚胎，所述培育后胚胎距受精時間不超過7天； 在相同條件下用培養(yǎng)水培養(yǎng)作為正常胚胎組； (2) 向培育后胚胎加入內(nèi)標(biāo)溶液，經(jīng)勻漿、分層提取其中的極性組分，提取樣品經(jīng)氮吹 干后，加入純水溶解，然后過0. 45 μ m聚醚砜水相濾膜，將濾液注入LC-MS/MS，進(jìn)行分離分 析；然后分別將肌酐標(biāo)準(zhǔn)品溶液及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入LC-MS/MS，在相同條件下進(jìn)行檢 測； (3) 根據(jù)如下公式：
式中：C為提取樣品濃度，AA為色譜峰面積； 計算待測樣品中的肌酐及內(nèi)標(biāo)含量，再根據(jù)內(nèi)標(biāo)提取率計算各組胚胎樣品中的肌酐含 量； (4) 胚胎組織中肌酐含量以均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法分析比較組 間差異的顯著性，當(dāng)測試組胚胎組織中肌酐含量高于正常胚胎組胚胎組織中的肌酐含量 (P〈0. 05)，并超過相應(yīng)發(fā)育齡胚胎組織肌酐含量的正常界值范圍，說明胚胎腎臟功能受到 損害，受試化合物具有腎臟毒性； 上述各發(fā)育齡胚胎組織中肌酐含量的正常界值范圍為： 受精后4d斑馬魚組織中的肌酐水平為30. 91?49. 09ng/50個胚胎；受精后5d斑馬魚 組織中的肌酐水平為36. 56?56. 32ng/50個胚胎；受精后6d斑馬魚組織中的肌酐水平為 58. 38?82. 06ng/50個胚胎；受精后7d斑馬魚組織中的肌酐水平為84. 47?124. 81ng/50 個胚胎。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中，所用的斑馬魚為野生型或 AB系斑馬魚胚胎。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，上述胚胎為受精3天以上，腎臟已完成發(fā)育 的野生型或AB系斑馬魚胚胎。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中，含有待測化合物的培養(yǎng)水 為在培養(yǎng)水中加入待測化合物或待測化合物與助溶劑的混合。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，上述培養(yǎng)水組分為： NaC15mmol/L, KC10. 17mmol/L, CaCl20. 4mmol/L, MgS040. 16mmol/L，去離子水配制。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中，培養(yǎng)期間每24h更換3/4 體積的含有待測化合物的培養(yǎng)水。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中，胚胎樣品中加入的內(nèi)標(biāo)物 質(zhì)為西咪替丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
【文檔編號】G01N30/88GK104122355SQ201410334259
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】王雪, 劉可春, 韓利文, 陳錫強(qiáng), 何秋霞, 彭維兵, 王希敏, 侯海榮, 張云, 孫晨, 楚杰 申請人:山東省科學(xué)院生物研究所