基于蛋白標(biāo)志物pak4輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于蛋白標(biāo)志物PAK4輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒。本發(fā)明要求保護用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品在制備用于輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，發(fā)明人通首次在NSCLC患者外周血中發(fā)現(xiàn)了蛋白標(biāo)志物PAK4的存在，并發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血中蛋白標(biāo)志物PAK4的濃度高于健康者，即蛋白標(biāo)志物PAK4具有輔助診斷NSCLC患者的價值。在本發(fā)明中，發(fā)明人通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的腫瘤組織中，蛋白標(biāo)志物PAK4的表達(dá)量顯著高于腫瘤組織旁邊的正常組織，且表達(dá)強度與預(yù)后生存時間有關(guān)，可以作為候選的預(yù)后因子。本發(fā)明對于非小細(xì)胞肺癌的輔助診斷和預(yù)后具有重大價值。
【專利說明】基于蛋白標(biāo)志物PAK4輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑 合 品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于蛋白標(biāo)志物PAK4輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 全球腫瘤的發(fā)病率仍然在不斷的升高，尤其是肺癌，已經(jīng)成為癌癥死亡原因中排 名第一位的腫瘤。在2013年，估計美國將有228190例新發(fā)肺癌病例，雖然只占到腫瘤新發(fā) 病例的14%，但由其導(dǎo)致死亡的人數(shù)卻占全部死亡腫瘤患者的27%。從病理上，肺癌可分 為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC，約占85% )和小細(xì)胞肺癌（SCLC，約占15% )。
[0003] 肺癌的主要治療方式包括手術(shù)、放療和化療，近年來，雖然腫瘤治療技術(shù)有了很大 的進(jìn)步，靶向治療也取得了一定的效果，但肺癌的5年生存率仍在15 %左右徘徊。研究認(rèn)為 如此差的預(yù)后主要還是由于腫瘤發(fā)現(xiàn)過晚所致。據(jù)報道，新發(fā)現(xiàn)的肺癌病例中高達(dá)56%伴 有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，僅15%的病變局限于原發(fā)灶；而其相應(yīng)的5年生存率分別為3. 7%、52. 2%，發(fā) 現(xiàn)時分期相對較早的病變其預(yù)后明顯較好。尤其對于I期的非小細(xì)胞肺癌，根治性手術(shù)切 除后的5年生存率可達(dá)58-73%。因此，改善肺癌預(yù)后最有效的方式之一就在于進(jìn)一步提高 肺癌的早期診斷率。
[0004] 目前，肺癌的發(fā)現(xiàn)主要依靠胸片或CT檢查。美國進(jìn)行的一項納入53454例受試者 的大型隨機對照肺癌篩查研究顯示，低劑量螺旋CT篩查能發(fā)現(xiàn)更多的早期肺癌，且與X線 胸片篩查相比，肺癌的死亡率降低了 20%。但這種篩查方式同樣存在較多的問題：首先，影 像學(xué)的陽性發(fā)現(xiàn)中假陽性率高達(dá)95%，如何對這些陽性發(fā)現(xiàn)做下一步的鑒別仍然是個很大 的難題；此外，低劑量螺旋CT檢查存在過度診斷的問題，導(dǎo)致一些不必要的檢查甚至有創(chuàng) 治療；而且反復(fù)進(jìn)行影像學(xué)檢查存在放射線誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險。另一項研究則認(rèn)為，雖然低劑 量螺旋CT篩查肺癌可減少其死亡率，但費用相對昂貴，不利于推廣應(yīng)用。因此，仍亟需一種 無創(chuàng)手段以輔助腫瘤的篩查和早期診斷。
[0005] 人類血液中包含豐富的各種細(xì)胞成分和分子物質(zhì)，能很好地反映機體不同組織和 器官的生理、病理狀態(tài)，且其標(biāo)本容易獲得，因此，是一種理想的腫瘤無創(chuàng)診斷手段。因此， 仍有待開發(fā)敏感性和特異性良好的標(biāo)志物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基于蛋白標(biāo)志物PAK4輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試 劑盒。
[0007] 本發(fā)明要求保護用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品在制備用于輔助診斷非小細(xì)胞 肺癌患者的試劑盒中的應(yīng)用。如果待檢者血漿中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量為1. 976ng/ml 以上，待檢者為候選的非小細(xì)胞肺癌患者；如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量小于 1. 976ng/ml，待檢者為候選的非非小細(xì)胞肺癌患者。
[0008] 所述非小細(xì)胞肺癌患者可為肺磷癌患者。如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的 含量為1. 885ng/ml以上，待檢者為候選的肺磷癌患者；如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4 的含量小于1. 885ng/ml，待檢者為候選的非肺磷癌患者。
[0009] 所述非小細(xì)胞肺癌患者可為肺腺癌患者。如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的 含量為1.976ng/ml以上，待檢者為候選的肺腺癌患者；如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4 的含量小于1. 976ng/ml,待檢者為候選的非肺腺癌患者。
[0010] 所述非小細(xì)胞肺癌患者可為I期非小細(xì)胞肺癌患者。如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志 物PAK4的含量為1. 662ng/ml以上，待檢者為候選的I期非小細(xì)胞肺癌患者；如果待檢者血 楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量小于1. 662ng/ml,待檢者為候選的非I期非小細(xì)胞肺癌患者。 [0011] 本發(fā)明還保護一種用于輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒，包括用于檢測蛋白 標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品。所述試劑盒還可具有記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體：如果待檢者血漿中 蛋白標(biāo)志物PAK4的含量為1. 976ng/ml以上，待檢者為候選的非小細(xì)胞肺癌患者；如果待檢 者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量小于1. 976ng/ml，待檢者為候選的非非小細(xì)胞肺癌患者。
[0012] 所述非小細(xì)胞肺癌患者可為肺磷癌患者。所述試劑盒還可具有記載有如下判斷標(biāo) 準(zhǔn)的載體：如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量為1. 885ng/ml以上，待檢者為候選的 肺磷癌患者；如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量小于1. 885ng/ml，待檢者為候選的 非肺磷癌患者。
[0013] 所述非小細(xì)胞肺癌患者為可肺腺癌患者。所述試劑盒還可具有記載有如下判斷標(biāo) 準(zhǔn)的載體：如果待檢者血漿中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量為1. 976ng/ml以上，待檢者為候選的 肺腺癌患者；如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量小于1. 976ng/ml，待檢者為候選的 非肺腺癌患者。
[0014] 所述非小細(xì)胞肺癌患者可為I期非小細(xì)胞肺癌患者。所述試劑盒還可具有記載 有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體：如果待檢者血漿中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量為1. 662ng/ml以上， 待檢者為候選的I期非小細(xì)胞肺癌患者；如果待檢者血楽中蛋白標(biāo)志物PAK4的含量小于 1. 662ng/ml，待檢者為候選的非I期非小細(xì)胞肺癌患者。
[0015] 以上任一所述用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品可為用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的 試劑盒，具體可為"P21蛋白激活激酶4(PAK4)檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法）"，購自 "USCN Life Science, Wuhan，China"，貨號為 "SEH464HU，，。
[0016] 本發(fā)明還保護用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品在制備用于對非小細(xì)胞肺癌患者 進(jìn)行預(yù)后判斷的試劑盒中的應(yīng)用。蛋白標(biāo)志物PAK4在腫瘤組織中表達(dá)表達(dá)越強該患者的 預(yù)后越差。所述用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品可為蛋白標(biāo)志物PAK4的抗體，具體可為 兔來源的多克隆PAK4抗體，購自abnova公司。
[0017] 蛋白標(biāo)志物 PAK4 的全稱為 p21 活化激酶 4(p21_activated kinase4，serine/ threonine-protein kinase PAK4)，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種，1998年首先由 Abo等發(fā)現(xiàn)，可以誘導(dǎo)絲狀偽足形成及肌動蛋白的聚合，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重構(gòu)。蛋白標(biāo)志物 PAK4的編碼基因定位于染色體19ql3. 2-13. 3。在本發(fā)明中，發(fā)明人通首次在NSCLC患者外 周血中發(fā)現(xiàn)了蛋白標(biāo)志物PAK4的存在，并發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血中蛋白標(biāo)志物PAK4的濃 度高于健康者，即蛋白標(biāo)志物PAK4具有輔助診斷NSCLC患者的價值。在本發(fā)明中，發(fā)明人 通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的腫瘤組織中，蛋白標(biāo)志物PAK4的表達(dá)量顯著高于腫瘤組 織旁邊的正常組織，且表達(dá)強度與預(yù)后生存時間有關(guān)，可以作為候選的預(yù)后因子。本發(fā)明對 于非小細(xì)胞肺癌的輔助診斷和預(yù)后具有重大價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為實施例1中的R0C曲線。
[0019] 圖2為實施例2中的R0C曲線。
[0020] 圖3為實施例3中的R0C曲線。
[0021] 圖4為實施例4中的R0C曲線。
[0022] 圖5為實施例5中到的部分免疫組化照片。
[0023] 圖6為154例非小細(xì)胞肺癌患者中蛋白標(biāo)志物PAK4的表達(dá)強度與預(yù)后的關(guān)系。

【具體實施方式】
[0024] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0025] 標(biāo)本的收集和保存均按照人類蛋白質(zhì)組織血楽蛋白質(zhì)項目（Human Proteome Organization，HUP0)和早期篩查研究網(wǎng)（early detection research network，EDRN)提 供的建議進(jìn)行。所有參與者均提供了書面的知情同意書。
[0026] 統(tǒng)計學(xué)分析由 Graphpad Prism5 軟件（San Diego, CA, USA)和 SPSS15. 0 軟 件（IBM, Chicago, USA)完成。血漿中蛋白標(biāo)志物的組間差異采用Mann-Whitney U檢 驗。腫瘤組織與正常組織的免疫組化染色差異采用Wilcoxon秩和檢驗。生存分析采用 Kaplan-Meier法，組間生存差異采用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險模型，以 P值< 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0027] 實施例1、應(yīng)用蛋白標(biāo)志物PAK4輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者
[0028] 用于本實施例的患者為153例臨床確診的非小細(xì)胞肺癌患者（外周靜脈血均在手 術(shù)前獲得，患者此前并未接受化療、放療、介入等治療）和108例健康人（健康志愿者，取血 前已排除肺癌或其他疾?。?，均為知情同意的志愿者。
[0029] 血液標(biāo)本采用EDTA抗凝管采集，采血1小時內(nèi)3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，得到血 漿，凍存于_80°C。室溫溶解后分別蔣策檢測血漿中蛋白標(biāo)志物PAK4的濃度、蛋白標(biāo)志物 Cyfra21-1的濃度、蛋白標(biāo)志物SCC的濃度及蛋白標(biāo)志物CEA的濃度。
[0030] 用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的試劑盒全稱為"p21蛋白激活激酶4(PAK4)檢測 試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法）"，購自"USCN Life Science, Wuhan，China"，貨號為 "SEH464Hu"。用于檢測蛋白標(biāo)志物Cyfra21-1的試劑盒全稱為" Elecsys?> CYFRA21-1) "， 購自"羅氏應(yīng)用化學(xué)公司"，貨號為"11820966"。用于檢測蛋白標(biāo)志物SCC的試劑盒全稱為 "i2000SR SCC檢測試劑"，購自"雅培公司"，貨號為"8D18"。用于檢測蛋白標(biāo)志物CEA的試 劑盒全稱為" Η1 ocsys? Carcinoembryonic antigen (CEA) "，購自"羅氏應(yīng)用化學(xué)公司"，貨 號為 "11731629"。
[0031] 153例非小細(xì)胞肺癌患者的血漿中各個蛋白標(biāo)志物的濃度結(jié)果見表1。108例健康 人的血漿中各個蛋白標(biāo)志物的濃度結(jié)果見表2。
[0032] 表1非小細(xì)胞肺癌患者血漿中各個蛋白標(biāo)志物的濃度（+代表診斷陽性，-代表診 斷陰性）
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品在制備用于輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒 中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述非小細(xì)胞肺癌患者為肺磷癌患者。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述非小細(xì)胞肺癌患者為肺腺癌患者。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述非小細(xì)胞肺癌患者為I期非小細(xì)胞肺 癌患者。
5. -種用于輔助診斷非小細(xì)胞肺癌患者的試劑盒，包括用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的 產(chǎn)品。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述非小細(xì)胞肺癌患者為肺磷癌患者。
7. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述非小細(xì)胞肺癌患者為肺腺癌患者。
8. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述非小細(xì)胞肺癌患者為I期非小細(xì)胞 肺癌患者。
9. 用于檢測蛋白標(biāo)志物PAK4的產(chǎn)品在制備用于對非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行預(yù)后判斷的 試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/574GK104111332SQ201410341619
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】赫捷, 張百華, 陳照麗, 周成誠 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院