一種葉螨生物測(cè)定方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明“一種葉螨生物測(cè)定方法及其應(yīng)用”，屬于植物蟲(chóng)害防治領(lǐng)域。該方法中，將被供試藥劑浸泡過(guò)的葉碟放置在相同的供試藥劑浸泡過(guò)的藥管中，然后放入室內(nèi)飼養(yǎng)的或者田間直接采集的葉螨進(jìn)行培養(yǎng)，一段時(shí)間后計(jì)算葉螨的死亡情況從而評(píng)估該藥劑的對(duì)葉螨的毒殺活性，本發(fā)明的方法和操作過(guò)程具有簡(jiǎn)便、快速、可靠、實(shí)用的特點(diǎn)，解決了現(xiàn)有常用的葉螨生物測(cè)定方法中存在的缺陷和不足。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種葉螨生物測(cè)定方法及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種葉螨生物測(cè)定方法，屬于植物蟲(chóng)害防治領(lǐng)域。 【背景技術(shù)】
[0002] 葉螨屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda)、蛛形綱（Arachnida)、蝶螨亞綱（Acari)、真螨 目（Acariformes)、葉螨總科（Tetranychoidea)，葉螨屬（Tetranychus)。葉螨在田間發(fā) 生種類(lèi)繁多，如二斑葉螨Tetranychus urticae、朱砂葉螨T. cinnabarinus和截形葉螨 T. truncatus等，葉螨分布廣泛、寄主植物種類(lèi)多，是一種世界性的農(nóng)業(yè)害螨。田間防治不及 時(shí)，?？稍斐山?jīng)濟(jì)損失15% -20%。
[0003] 生產(chǎn)上對(duì)葉螨的防治主要以化學(xué)防治措施為主。防治葉螨的高效低毒藥劑的篩選 基礎(chǔ)是基于葉螨生物測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)的。常用的葉螨生物測(cè)定方法是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織 所推薦使用的標(biāo)準(zhǔn)方法一玻片浸漬法（FA0,1980)，需要用零號(hào)毛筆將葉螨背部小心地粘貼 在雙面膠帶上，再浸漬在不同濃度的藥液中（唐小鳳等，2014)，也是目前很多實(shí)驗(yàn)室常用 的葉螨生測(cè)方法。但該技術(shù)明顯的缺點(diǎn)是操作技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，易對(duì)螨體造成損傷，操作者需 要進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的技術(shù)練習(xí)才能操作成功；而且這種方法主要測(cè)試的觸殺和內(nèi)吸性能，而 藥劑的胃毒特性則不易測(cè)試。第二種方法是葉碟噴霧法，該方法是將健康活潑的雌成螨挑 于干凈的寄主植物葉片做成的葉碟上，待葉螨種群穩(wěn)定后，將其及葉碟一起置于Potter噴 霧塔下進(jìn)行噴霧處理，而后晾干飼養(yǎng)即可（Tsagkarakou et al.，2009)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是較 為接近田間的實(shí)際農(nóng)藥施用過(guò)程，操作簡(jiǎn)單，對(duì)螨體損傷小，缺點(diǎn)是噴在葉碟上的藥液量多 少對(duì)殺螨效果影響較大，另外儀器相對(duì)昂貴，且對(duì)于儀器的要求較為嚴(yán)格。葉片殘毒法也稱(chēng) 為藥膜法，是將寄主植物葉片先浸漬于藥液中，取出晾干后再將葉螨挑于葉片上，但是藥膜 的薄厚對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，而且由于害螨只是通過(guò)螨足接觸藥劑，不能確定具體 的施藥量，對(duì)室內(nèi)研究來(lái)說(shuō)具有一定的局限性（陳麗麗等，2005)，而且葉螨也常出現(xiàn)逃逸， 影響計(jì)數(shù)。近幾年國(guó)外學(xué)者推薦使用瓶膜法（Residual Coated Vial,簡(jiǎn)稱(chēng)RCV)(Kwon et al·，2010 ;Feng et al·，2011 ;Wang et al·，2014)，但是這種方法在使用過(guò)程中，需要從收 集葉螨卵開(kāi)始，采用3-5天內(nèi)孵化的成螨進(jìn)行測(cè)試（減少其吐絲結(jié)網(wǎng)的比例），因此試蟲(chóng)準(zhǔn) 備時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)由于藥劑的脅迫壓力，葉螨仍會(huì)出現(xiàn)應(yīng)急反應(yīng)而吐絲、纏繞等，造成的試 驗(yàn)誤差較大；另外，該方法僅能測(cè)試藥劑的觸殺活性，藥劑的胃毒、內(nèi)吸活性則難以測(cè)定。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述生物測(cè)定方法中存在的問(wèn)題和缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種新的葉螨生物測(cè)定 方法，技術(shù)方案如下：
[0005] -種葉螨生物測(cè)定方法，包括如下步驟：
[0006] (1)配藥：將供試藥劑配制成設(shè)定濃度的藥液；
[0007] (2)浸管：將所述藥液轉(zhuǎn)入管狀容器中，使得管狀容器完全被藥液浸滿(mǎn)，不留空 隙；
[0008] (3)晾管：浸管后倒掉管內(nèi)藥液，將管狀容器倒置，室溫下晾干；
[0009] (4)葉片浸藥：將新鮮的寄主植物葉片制成大小均一的圓形葉片，放入所述藥液 中浸泡，然后室溫晾干；
[〇〇1〇] (5)裝管：將所述藥液浸過(guò)的葉片夾入浸管后的所述管狀容器中，所述葉片平整 斜向且葉背向上放置，然后再放入受試葉螨，蓋上管狀容器的蓋子；
[0011] (6)培養(yǎng)箱飼養(yǎng)：將裝管后的所述管狀容器放置在溫度為26 土 1°C，光暗周期L: D =16h:8h的昆蟲(chóng)培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)；
[0012] (7)結(jié)果檢查：檢查受試葉螨的死亡與成活情況，記錄其死亡數(shù)和成活數(shù)。
[0013] 所述浸管的參數(shù)為：室溫下，浸泡2個(gè)小時(shí)。
[0014] 所述葉片浸藥的時(shí)間為10秒鐘。
[0015] 所述管狀容器為1. 5?2ml的塑料離心管；所述葉片的直徑為1. 5cm的圓形葉片。
[0016] 每個(gè)所述離心管放入30頭雌成螨進(jìn)行生物測(cè)定；放入葉螨的方法是將葉螨放入 折疊成漏斗形狀的稱(chēng)量紙中，葉螨通過(guò)漏斗底部小口進(jìn)入離心管中。
[〇〇17] 上述任一方法在葉螨生物測(cè)定中的應(yīng)用。
[〇〇18] 一種篩選有效防治葉螨的藥劑的方法，其特征在于：采用上述任一所述的方法；
[0019] 所述設(shè)定濃度指設(shè)定為系列梯度濃度；
[0020] 所述供試藥劑為一至多種；
[0021] 對(duì)每種供試藥劑的每個(gè)設(shè)定濃度下的藥液進(jìn)行步驟（1)?（7)的操作，根據(jù)步驟 7的結(jié)果檢查篩選出對(duì)葉螨有毒殺活性的有效藥劑種類(lèi)，進(jìn)而明確葉螨對(duì)各藥劑的敏感度。
[0022] 本發(fā)明提供一種新的葉螨生物測(cè)定方法，所述方法不僅在離心管內(nèi)壁全部涂有藥 齊U，且放置的植物葉蝶也在藥液中浸過(guò)，因此稱(chēng)為藥管浸葉法。該方法能夠?qū)λ巹┛赡芫哂?的胃毒、觸殺、內(nèi)吸活性同時(shí)進(jìn)行綜合測(cè)定。結(jié)果顯示在測(cè)試藥劑的殺螨活性時(shí)，藥劑不同 系列濃度與葉螨的死亡率之間的線性關(guān)系良好，測(cè)試結(jié)果可靠。
[0023] 與用于葉螨生物測(cè)定常用的玻片浸漬法相比，本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，且不會(huì)損 傷受試葉螨蟲(chóng)體，減小了因蟲(chóng)體本身?yè)p傷導(dǎo)致的試驗(yàn)誤差，且能夠?qū)λ巹┑奈付咎匦赃M(jìn)行 測(cè)定。與葉碟噴霧法和藥膜法相比，所述方法不需要任何昂貴儀器，所用材料常見(jiàn)其成本極 其低廉，不同批次試驗(yàn)中每個(gè)葉片上的藥量相對(duì)一致，提高了試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，且不存在 葉螨逃逸、淹死等其它影響試驗(yàn)結(jié)果的問(wèn)題。與瓶膜法（RCV)相比，本發(fā)明的藥管浸葉法主 要具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，測(cè)試所用材料采用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常見(jiàn)的1. 5?2ml的塑料離心管，材料 易得，且成本低；第二，用藥液將離心管浸滿(mǎn)無(wú)空隙，放置2h，而不需要采用特制的旋轉(zhuǎn)器 進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)lh ;第三，藥管內(nèi)加入浸過(guò)藥液的葉螨寄主植物葉蝶，增加對(duì)藥劑胃毒作用的測(cè) 試；第四，測(cè)試葉螨的挑取，不需要采用3?5天內(nèi)孵化的雌成螨，可以采集田間種群進(jìn)行直 接測(cè)試，而不擔(dān)心葉螨吐絲纏繞的問(wèn)題。
[0024] 綜上，本發(fā)明的葉螨生物測(cè)定方法具有以下明顯的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：（1)簡(jiǎn)便性：采用 藥管浸葉法進(jìn)行葉螨的生物測(cè)定，技術(shù)操作簡(jiǎn)便，不需要像采用玻片浸漬法一樣反復(fù)練習(xí) 才能掌握其操作步驟；（2)快速性：葉螨可以隨時(shí)采集隨時(shí)進(jìn)行生物測(cè)定，不需如瓶膜法 (RCV)中必須采用孵化前3-5天的雌成螨進(jìn)行；（3)可靠性：由于螨體不會(huì)受到損傷，且加 入了可供葉螨取食的寄主葉片，測(cè)試過(guò)程中葉螨不會(huì)結(jié)網(wǎng)，結(jié)果檢查比較容易，減小了試驗(yàn) 誤差，提高了測(cè)試結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性；(4)實(shí)用性：加入可供葉螨取食的浸藥葉片可同 時(shí)測(cè)試藥劑的胃毒、觸殺、內(nèi)吸活性，解決了常規(guī)的玻片浸漬法（Slide-dip method)和瓶膜 法（RCV)中主要測(cè)試藥劑的觸殺活性而不能測(cè)試其它特性的問(wèn)題，測(cè)試過(guò)程與田間葉螨種 群的受藥過(guò)程更為接近，因此試驗(yàn)結(jié)果更科學(xué)。 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1.采用本發(fā)明方法獲得的阿維菌素的劑量對(duì)數(shù)值與葉螨死亡率機(jī)率值之間的 線性關(guān)系；
[0026] 其中，縱坐標(biāo)表示截形葉螨死亡率的機(jī)率值，橫坐標(biāo)表示阿維菌素各測(cè)試濃度的 對(duì)數(shù)值。
[0027] 圖2.采用本發(fā)明方法獲得的噠螨靈的劑量對(duì)數(shù)值與葉螨死亡率機(jī)率值之間的線 性關(guān)系；
[0028] 其中，縱坐標(biāo)表示截形葉螨死亡率的機(jī)率值，橫坐標(biāo)表示噠螨靈各測(cè)試濃度的對(duì) 數(shù)值。 【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋?zhuān)枰f(shuō)明的是，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不 局限于此。
[0030] 試驗(yàn)材料的來(lái)源：
[0031] 截形葉螨室內(nèi)相對(duì)敏感種群：由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院洪曉月教授惠贈(zèng)，從 2009年室內(nèi)飼養(yǎng)至今；由"碧豐"品種的無(wú)蟲(chóng)菜豆苗葉片作為寄主進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，期間未 接觸任何殺蟲(chóng)劑，采用培養(yǎng)皿海綿水隔離臺(tái)法飼養(yǎng)，即在20cm直徑的培養(yǎng)皿中放置一層海 綿，海綿上放置一層濾紙，濾紙上面正面朝下放置清潔無(wú)污染的菜豆葉片，每5天更換一次 新鮮葉片；培養(yǎng)箱溫度為26±1°C，光周期為L(zhǎng):D = 16h:8h。該種群本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，申 請(qǐng)人聲明自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)，可向公眾發(fā)放用于必要的驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0032] 田間葉螨種群：于2014年6月份采集于北京順義的黃瓜寄主上，經(jīng)鑒定為截形葉 螨（王少麗等，2013);室內(nèi)飼養(yǎng)一代后用于殺蟲(chóng)殺螨劑的生物測(cè)定試驗(yàn)。
[0033] 菜豆葉片："碧豐"品種的無(wú)蟲(chóng)菜豆苗葉片。
[0034] 供試藥劑：
[0035] 1. 8%阿維菌素乳油（北京中農(nóng)大生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品）；
[0036] 10%聯(lián)苯菊酯乳油（拜耳作物科學(xué)（中國(guó)）公司產(chǎn)品）；
[0037] 73%克螨特乳油（美國(guó)科聚亞公司產(chǎn)品）；
[0038] 10%溴蟲(chóng)腈懸浮劑（德國(guó)巴斯夫股份有限公司產(chǎn)品）；
[0039] 15%噠螨靈乳油（江蘇克勝集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品）。
[0040] 本發(fā)明未特別說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，或采用本領(lǐng)域常規(guī)方法配制 而得，可商購(gòu)獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級(jí)即可。
[0041] 實(shí)施例1、藥管浸葉法和玻片浸漬法對(duì)葉螨種群的生物測(cè)定結(jié)果比較
[0042] 分別采用藥管浸葉法和玻片浸漬法測(cè)定3種殺蟲(chóng)劑對(duì)采集于北京順義地區(qū)的田 間截形葉螨雌成螨的毒力。
[0043] 1、采用藥管浸葉法進(jìn)行葉螨的生物測(cè)定
[0044] (1)配藥：在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將供試藥劑的原藥或者制劑配制成5?7個(gè)系列 濃度梯度，同時(shí)以溶劑處理作為對(duì)照組CK ;
[0045] (2)浸管：測(cè)試所用離心管為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常見(jiàn)的1. 5?2ml的塑料離心管。將各系列 濃度梯度的藥液轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行浸管，保證離心管被全部浸滿(mǎn)無(wú)任何空隙，每個(gè)濃度浸4 個(gè)離心管（重復(fù)），室溫下浸管2個(gè)小時(shí)；
[0046] (3)晾管：浸管2h后，倒掉管內(nèi)藥液，將離心管倒置在一張干凈濾紙上，室溫下晾 干2h，（此時(shí)間可根據(jù)測(cè)試環(huán)境濕度的高低而進(jìn)行調(diào)整）；
[0047] (4)葉片打孔與浸藥：將新鮮的寄主植物葉片（豆苗葉片或花生葉片）打成直徑 為1. 5cm的圓形葉片，分別在每個(gè)濃度的藥液中浸葉10s，浸葉過(guò)程中為避免高濃度藥液對(duì) 低濃度藥液的影響，應(yīng)先浸對(duì)照組葉片，然后再?gòu)牡蜐舛鹊礁邼舛纫来芜M(jìn)行，最后在干凈濾 紙上室溫晾葉1. 5小時(shí)；
[0048] (5)裝管與挑蟲(chóng)：標(biāo)記離心管后，用干凈的小鑷子將各葉片夾入已浸相應(yīng)藥液濃 度的離心管中，平整斜向且葉背向上放置，該步驟也應(yīng)先進(jìn)行對(duì)照組，然后從低濃度向高濃 度依次進(jìn)行；把稱(chēng)量紙做成漏斗型，用零號(hào)毛筆將葉螨挑放在稱(chēng)量紙上，然后輕彈紙漏斗， 葉螨即被彈入離心管中，每管大約接30頭雌成螨；
[0049] (6)培養(yǎng)箱飼養(yǎng)：蓋緊裝有試螨的離心管蓋子，放置在溫度為26土1°C，光暗周期 L:D = 16h:8h的昆蟲(chóng)培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)；
[0050] (7)結(jié)果檢查：24h (也可根據(jù)殺螨劑的特性或者測(cè)試目的進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整）后，檢查 記錄測(cè)試葉螨的死亡數(shù)和成活數(shù)，死亡標(biāo)準(zhǔn)是以毛筆尖輕觸成螨，其足不動(dòng)的視為死亡。
[0051] 2、采用玻片浸漬法進(jìn)行葉螨的生物測(cè)定
[0052] (1)將雙面膠帶剪成2?3cm長(zhǎng)，貼在載玻片一端，用鑷子揭去雙面膠帶上的紙片， 用零號(hào)毛筆挑選大小一致、行動(dòng)活潑的截形葉螨雌成螨，將其背部粘在雙面膠帶上，不粘住 螨足、螨須和口器，每片膠帶粘3行，每行大約粘15頭。
[0053] (2)在溫度為26±1°C、相對(duì)濕度為80%左右的人工氣候培養(yǎng)箱中放置4h后，在解 剖鏡下觀察，剔除死亡或不太活潑以及體位不正確的葉螨個(gè)體。
[0054] (3)藥劑在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上稀釋5?7個(gè)濃度，將帶螨玻片端浸入不同濃度的藥液 中，輕輕搖動(dòng)5s后取出，快速用吸水紙吸干螨體及其周?chē)亩嘤嗨幰骸Ｒ越n清水作為對(duì) 照處理，每個(gè)處理重復(fù)4次。
[0055] (4)鋪一層濕潤(rùn)紗布在一個(gè)白色瓷缸內(nèi)，將浸過(guò)藥液的玻片平整放置于濕潤(rùn)紗布 上，瓷缸上面再覆蓋一層濕潤(rùn)紗布，在紗布上面蓋上玻璃板，同時(shí)確保紗布不會(huì)下滑落在帶 螨玻片上，且能夠達(dá)到較好的保濕效果。
[0056] (5) 24h后用雙目解剖鏡檢查結(jié)果。用毛筆輕觸螨體，以螨足不動(dòng)者計(jì)為死亡，空白 對(duì)照死亡率在10%以下為有效試驗(yàn)。
[0057] 3、數(shù)據(jù)處理
[0058] 藥管浸葉法和玻片浸漬法對(duì)測(cè)試葉螨雌成螨的b±SE、LC5(I值及其95%置信區(qū)間 等采用Polo Plus Versionl.O軟件進(jìn)行處理。LC5(I的95%置信區(qū)間重疊則視為差異不顯 著，不重疊則視為差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，表格中的不同字母代表差異顯著。
[0059] 表1.藥管浸葉法和玻片浸漬法測(cè)定3種藥劑對(duì)截形葉螨的毒力
[0060]
【權(quán)利要求】
1. 一種葉螨生物測(cè)定方法，包括如下步驟： (1) 配藥：將供試藥劑配制成設(shè)定濃度的藥液； (2) 浸管：將所述藥液轉(zhuǎn)入管狀容器中，使得管狀容器完全被藥液浸滿(mǎn)，不留空隙； (3) 晾管：浸管后倒掉管內(nèi)藥液，將管狀容器倒置，室溫下晾干； (4) 葉片浸藥：將新鮮的寄主植物葉片制成大小均一的圓形葉片，放入所述藥液中浸 泡，然后室溫晾干； (5) 裝管：將所述藥液浸過(guò)的葉片夾入浸管后的所述管狀容器中，所述葉片平整斜向 且葉背向上放置，然后再放入受試葉螨，蓋上管狀容器的蓋子； (6) 培養(yǎng)箱飼養(yǎng)：將裝管后的所述管狀容器放置在溫度為26土TC，光暗周期L:D = 16h:8h的昆蟲(chóng)培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)； (7) 結(jié)果檢查：檢查受試葉螨的死亡與成活情況，記錄其死亡數(shù)和成活數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述浸管的參數(shù)為：室溫下，浸泡2個(gè)小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述葉片浸藥的時(shí)間為10秒鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述管狀容器為1. 5?2ml的塑料離心管；所述葉片 的直徑為1. 5cm的圓形葉片。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，每個(gè)所述離心管放入30頭雌成螨進(jìn)行生物測(cè)定；放入 葉螨的方法是將葉螨放入折疊成漏斗形狀的稱(chēng)量紙中，葉螨通過(guò)漏斗底部小口進(jìn)入離心管 中。
6. 權(quán)利要求1?5所述的方法在葉螨生物測(cè)定中的應(yīng)用。
7. -種篩選有效防治葉螨的藥劑的方法，其特征在于：采用權(quán)利要求1?5任一所述 的方法； 所述設(shè)定濃度指設(shè)定為系列梯度濃度； 所述供試藥劑為一至多種； 對(duì)每種供試藥劑的每個(gè)設(shè)定濃度下的藥液進(jìn)行步驟（1)?（7)的操作，根據(jù)步驟7的 結(jié)果檢查篩選出對(duì)葉螨有毒殺活性的有效藥劑種類(lèi)，進(jìn)而明確葉螨對(duì)各藥劑的敏感度。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK104062413SQ201410347602
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】王少麗, 王玲, 張友軍, 吳青君, 謝文, 徐寶云 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所