使用抗gpr49抗體的癌癥的診斷和治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與GPR49蛋白結(jié)合、且對表達GPR49蛋白的細胞具有細胞增殖抑制活性的抗體。細胞增殖抑制活性是指抗體依賴性細胞毒和補體依賴性細胞毒等細胞毒活性。本發(fā)明還公開了含有本發(fā)明的抗體作為有效成分的藥物組合物、細胞增殖抑制劑和抗癌藥。癌癥例如為胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。本發(fā)明進一步公開了通過檢測GPR49蛋白或編碼GPR49蛋白的基因的表達來診斷癌癥的方法、以及用于該方法的診斷藥和試劑盒。
【專利說明】使用抗GPR49抗體的癌癥的診斷和治療
[0001] 本申請是原案申請日為2008年11月14日、原案申請?zhí)枮?00880125021.9(國際 申請?zhí)枮镻CT/JP2008/070751)、發(fā)明名稱為"使用抗GPR49抗體的癌癥的診斷和治療"的專 利申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及癌癥的診斷方法、治療方法和抗癌藥。

【背景技術】
[0003] GPR49分子是由人染色體12ql2的ENSG00000139292基因編碼的蛋白，該分子是G 蛋白偶聯(lián)7次膜結(jié)合蛋白的激素受體家族的LGR家族（富含亮氨酸GPCR家族、以下稱作LGR 家族）的成員，這由其氨基酸序列的特征即可明確（非專利文獻1)。LGR家族成員中，包括 LHR、TSHR、FSH等激素受體、以及以松弛素、胰島素樣肽3 (INSL3)等作為配體的LGR7、LGR8 等（非專利文獻2)。已知所有配體均包含不同的肽，主要傳遞由cAMP介導的信號。LGR家 族具有包含7次跨膜蛋白區(qū)和N末端長的胞外區(qū)的結(jié)構(gòu)，胞外區(qū)中存在9-17個由約25個氨 基酸構(gòu)成的重復的富含亮氨酸的區(qū)（富含亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat) :LRR)。 GPR49有17次LRR(非專利文獻1)。由TSHR等的分析可知：配體以高親和性與該細胞外 的LRR結(jié)合，并且與第2細胞外環(huán)狀區(qū)結(jié)合，從而進行與G蛋白偶聯(lián)的信號傳遞（非專利文 獻 3 ;Pharmacology&Therapeuticsl03,21(2004))。有關 GPR49 的配體尚未確定，但有報道 稱：與果蠅（Drosophila)近緣的LGR、即DLGR2的配體是包含作為BMP拮抗劑的家族分子 的Burs、Pburs (Bur的配偶體）的Bursicon，所以尚未明確配體的LGR4、LGR5 (GPR49)、LGR6 的配體也是BMP拮抗劑（非專利文獻4、非專利文獻2)。關于GPR49分子的功能，根據(jù)敲除 小鼠的分析，暗示其與舌粘連（ankylogenesis)有關（非專利文獻5)。另外，根據(jù)毛囊干細 胞的基因表達分析，還推測其參與干細胞的增殖（非專利文獻6)。
[0004] 有關GPR49分子與癌癥的關系，山本等人報道了：GPR49在肝細胞癌患者中高度表 達（非專利文獻7)，特別是在具有β -連環(huán)蛋白突變的患者中，GPR49在mRNA水平的表達 允進。此外，伊藤等人根據(jù)Affymetrix公司的Genechip數(shù)據(jù)分析，列舉GPR49作為在胃癌 患者中高度表達的分子之一（專利文獻1)。
[0005] 有報道稱：GPR49在大腸癌、卵巢癌中表達亢進，在大腸癌中有64% (25/39)的患 者可見mRNA水平的表達亢進，而在卵巢癌中有53% (18/33)的患者可見mRNA水平的表達 亢進（非專利文獻8)。有報道稱：在使用PoAb的免疫染色中，GPR49在正常組織中的胎盤、 骨骼肌中表達（非專利文獻8)。有關GPR49與癌化的關系，根據(jù)細胞灶形成試驗，在只進行 了基因?qū)氲腘IH3T3中4周沒有細胞灶形成，而在添加有培養(yǎng)SW620的培養(yǎng)上清（條件培 養(yǎng)基）的細胞中3周內(nèi)可見細胞灶形成。由此設想發(fā)生了依賴于配體的癌化。在siRNA實 驗中，可見subGl細胞的蓄積，發(fā)生了凋亡。這暗示：GPR49在大腸癌細胞中具有阻礙凋亡 誘導的功能。
[0006] 但是，還有報道稱：基于癌細胞株的表達，雖然GPR49在大腸癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、黑色素瘤中表達亢進，但在乳癌、肺癌中未見其表達亢進（非專利文獻8)。
[0007] 專利文獻 1 :W02000071710
[0008] 非專利文獻 1 :Mol. Endocrinologyl2,1830 (1998)
[0009] 非專利文獻 2 :Journal of Endocrinologyl87, 333 (2005)
[0010] 非專利文獻 3 :Pharmacology&Therapeuticsl03, 21 (2004)
[0011] 非專利文獻 4 :PNASl〇2,282〇(2〇〇5)
[0012] 非專利文獻 5 :Molecular and Cellular Biology，24,9736 (2004)
[0013] 非專利文獻 6 :Nature Biotechnology22,411 (2004)
[0014] 非專利文獻 7 :!fepatology37, 528 (2003)
[0015] 非專利文獻 8 :Cancer Biology&Therapy5,419 (2006)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 發(fā)明所要解決的課是頁
[0017] 本發(fā)明的目的在于：提供診斷癌癥的新方法、治療癌癥的新方法、新的細胞增殖抑 制劑和抗癌藥。
[0018] 解決課題的方法
[0019] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)：在胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì) 瘤等的癌細胞中，不僅GPR49的基因、就連GPR49的蛋白也高度表達。另外，本發(fā)明人等制 成了抗GPR49蛋白的單克隆抗體，并首次發(fā)現(xiàn)：將具有l(wèi)OOkDa的分子量的GPR49蛋白切斷， 分成60kDa和40kDa的片段。由于N末端側(cè)的60kDa的片段被切斷后分泌到細胞外，所以 其作為癌癥診斷用標志物是有用的。另外，認為C末端側(cè)的40kDa的片段作為治療用抗體 的靶是有用的。
[0020] 并且，本發(fā)明人等在測定抗GPR49抗體的補體依賴性細胞毒 (complement-dependent cytotoxicity ;CDC)活性以及抗體依賴性細胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ;ADCC)活性時，發(fā)現(xiàn)抗 GPR49 抗體 對GPR49表達細胞具有CDC活性和ADCC活性。進一步發(fā)現(xiàn)：利用結(jié)合有毒素的抗體，引起 GPR49表達細胞的細胞毒的活性。根據(jù)上述認識，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)：抗GPR49抗體對原發(fā)性 或轉(zhuǎn)移性的各種癌癥的診斷、預防和治療有效，從而完成了本發(fā)明。更具體而言，本發(fā)明人 等發(fā)現(xiàn)：GPR49可用作用于治療或診斷以胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤 和神經(jīng)膠質(zhì)瘤為代表的GPR49表達亢進的癌癥的手段，從而完成了本發(fā)明。
[0021] g卩，本發(fā)明提供與GPR49蛋白結(jié)合的抗體。本發(fā)明還提供與GPR49蛋白結(jié)合、且對 表達GPR49蛋白的細胞具有細胞毒活性的抗體。優(yōu)選該細胞毒活性為ADCC活性。還優(yōu)選 該細胞毒活性為CDC活性。本發(fā)明又提供結(jié)合有細胞毒性物質(zhì)的抗體。
[0022] 本發(fā)明還提供含有與GPR49蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的藥物組合物。本發(fā)明 還提供含有與GPR49蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的細胞增殖抑制劑。本發(fā)明又提供含有 與GPR49蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的抗癌藥。
[0023] 或者，本發(fā)明提供含有與GPR49蛋白結(jié)合的抗體和藥學上可接受的載體的藥物組 合物。更具體而言，本發(fā)明提供下述[1]?[21]。
[0024] [1]抗體，該抗體與GPR49蛋白結(jié)合、且對表達GPR49蛋白的細胞具有細胞增殖抑 制活性。
[0025] [2] [1]所述的抗體，其中細胞增殖抑制活性為細胞毒活性。
[0026] [3] [2]所述的抗體，其中細胞毒活性為抗體依賴性細胞毒活性。
[0027] [4] [2]所述的抗體，其中細胞毒活性為補體依賴性細胞毒活性。
[0028] [5] [1]?[4]中任一項所述的抗體，該抗體結(jié)合有細胞毒性物質(zhì)。
[0029] [6] [5]所述的抗體，該抗體具有內(nèi)化活性。
[0030] [7] [1]?[6]中任一項所述的抗體，該抗體抑制癌細胞的增殖。
[0031] [8] [7]所述的抗體，其中癌細胞為胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵 巢癌細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的任一種。
[0032] [9]以下（1)?（20)中任一項所述的抗體：
[0033] (1)抗體（2J18-1N)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0:5記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :6記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO : 7記載的氨基酸序列；
[0034] (2)抗體（2J18-1N)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :10 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO : 11記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :12記載的氨基酸序列；
[0035] (3)抗體，該抗體含有⑴所述的Η鏈和⑵所述的L鏈；
[0036] (4)抗體（2U1E-1)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :15記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :16記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :17記載的氨基酸序列；
[0037] (5)抗體（2U1E-1)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :20記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :21記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :22記載的氨基酸序列；
[0038] (6)抗體，該抗體含有⑷所述的Η鏈和（5)所述的L鏈；
[0039] (7)抗體（2U2E-2)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :25記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :26記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :27記載的氨基酸序列；
[0040] (8)抗體（2U2E-2)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :30記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :31記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :32記載的氨基酸序列；
[0041] (9)抗體，該抗體含有（7)所述的Η鏈和⑶所述的L鏈；
[0042] (10)抗體（2L13-3)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :35 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :36記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :37記載的氨基酸序列；
[0043] (11)抗體（2L13-3)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :40 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :41記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :42記載的氨基酸序列；
[0044] (12)抗體，該抗體含有（10)所述的Η鏈和（11)所述的L鏈；
[0045] (13)抗體（2L36-12)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :45 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :46記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :47記載的氨基酸序列；
[0046] (14)抗體（2L36-12)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :50 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :51記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID N0 :52記載的氨基酸序列；
[0047] (15)抗體，該抗體含有（13)所述的Η鏈和（14)所述的L鏈；
[0048] (16)抗體（2Τ15Ε-2)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :66 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :67記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :68記載的氨基酸序列；
[0049] (17)抗體（2T15E-2)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :71 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :72記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :73記載的氨基酸序列；
[0050] (18)抗體，該抗體含有（16)所述的Η鏈和（17)所述的L鏈；
[0051] (19)抗體，該抗體是在⑴?（18)中任一項所述的抗體中有一個或多個氨基酸被 取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗體，所得抗體與（1)?（18)中任一項所述的抗體具 有同等活性；
[0052] (20)抗體，該抗體與表位結(jié)合，所述表位與⑴?（18)中任一項所述的抗體所結(jié) 合的GPR49蛋白的表位相同。
[0053] [10] [1]?[9]中任一項所述的抗體，該抗體具有人恒定區(qū)。
[0054] [11] [10]所述的抗體，該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
[0055] [12]藥物組合物，其中含有[1]?[11]中任一項所述的抗體作為有效成分。
[0056] [13]細胞增殖抑制劑，其中含有[1]?[11]中任一項所述的抗體作為有效成分。
[0057] [14]抗癌藥，其中含有[1]?[11]中任一項所述的抗體作為有效成分。
[0058] [15] [14]所述的抗癌藥，其中，癌癥為選自胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巢癌、 尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的任一種癌。
[0059] [16]癌癥的診斷方法，其特征在于：檢測GPR49蛋白或編碼GPR49蛋白的基因。
[0060] [17] [16]所述的診斷方法，其特征在于：檢測GPR49蛋白。
[0061] [18] [17]所述的診斷方法，其中GPR49蛋白的檢測使用與GPR49蛋白結(jié)合的抗體 來進行。
[0062] [19]癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟：
[0063] (a)提供從受試者采集的試樣的步驟；
[0064] (b)使用與GPR49蛋白結(jié)合的抗體檢測（a)的試樣中所含的GPR49蛋白的步驟。
[0065] [20]癌癥的診斷方法，該方法包括以下步驟：
[0066] (a)將與GPR49蛋白具有結(jié)合活性、且用放射性同位素標記的抗體給予受試者的 步驟；
[0067] (b)檢測上述放射性同位素的累積的步驟。
[0068] [21] [16]?[20]中任一項所述的診斷方法，其中癌癥為選自胃癌、大腸癌、肝細 胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的任一種癌。
[0069] 本發(fā)明還提供下述[22]?[24]。
[0070] [22]抑制細胞增殖的方法，該方法使用[1]?[11]中任一項所述的抗體。
[0071] [23]癌癥的治療或預防方法，該方法包括給予[1]?[11]中任一項所述的抗體的 步驟。
[0072] [24] [1]?[11]中任一項所述的抗體在制造細胞增殖抑制劑或抗癌藥中的應用。
[0073] 發(fā)明效果
[0074] 本發(fā)明的抗GPR49抗體對GPR49表達細胞具有補體依賴性細胞毒活性以及抗體依 賴性細胞毒活性，并且，結(jié)合有毒素的抗體還具有引起GPR49表達細胞的細胞毒的活性，所 以對原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的各種癌癥的診斷、預防和治療有效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0075] 圖1顯示人GPR49在正常組織中的表達分布圖。下面的值表示通過外顯子芯片 (Exon Array)分析得到的值，值越高則mRNA的表達量越高。
[0076] 圖2顯示人GPR49在胃癌細胞株和胃癌摘出組織的腫瘤部位的表達分布圖。下面 的值表示通過外顯子芯片分析得到的值，值越高則mRNA的表達量越高。
[0077] 圖3顯示人GPR49在尤文肉瘤、小細胞肺癌、肺腺癌摘出組織的腫瘤部位的表達分 布圖。下面的值顯示通過外顯子芯片分析得到的值，值越高則mRNA的表達量越高。
[0078] 圖4顯示人GPR49在卵巢癌細胞株和卵巢癌摘出組織的腫瘤部位的表達分布圖。 下面的值顯示通過外顯子芯片分析得到的值，值越高則mRNA的表達量越高。
[0079] 圖5是利用單克隆抗體2U2E-2檢測被誘導表達的GPR49的照片。照片顯示：抗體 特異性識別通過添加1 μ L、10 μ L Dox (多西環(huán)素）而誘導的GPR49,并識別與利用抗HA標 簽抗體檢測附加在N末端的HA標簽所得的譜帶相同的譜帶。
[0080] 圖6是用單克隆抗體2U1E-U2U2E-2檢測GPR49蛋白的照片，所述GPR49蛋白存 在于用GPR49siRNA轉(zhuǎn)染GPR49強制表達DG44細胞以及大腸癌細胞株LoVo而得到的細胞 破碎液中。在導入有siRNA507、508、509的細胞中，GPR49的表達被抑制。（-)表示未導入 siRNA的細胞，"con"表示導入有對照siRNA的細胞。除lOOkDa的譜帶以夕卜，2U1E-1中用 箭頭顯示的40kDa的譜帶、2U2E-2中用箭頭顯示的60kDa的譜帶也均消失，所以這些譜帶均 來自GPR49。
[0081] 圖7是將2B10 (HA-GPR49表達DG44細胞）的細胞破碎液免疫沉淀后用單克隆抗 體檢測GPR49而得到的照片。在2U1E-1中檢測到lOOkDa和40kDa的譜帶，在2U2E-2中 檢測到lOOkDa和60kDa的GPR49的譜帶。使用HRP標記抗小鼠 IgG(H+L)抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司制備）作為二次抗體。
[0082] 圖8是將2B10 (HA-GPR49表達DG44細胞）的細胞破碎液免疫沉淀后用單克隆抗 體檢測GPR49而得到的照片。在2L系列的抗體中均檢測到60kDa的GPR49的譜帶。為了 區(qū)別來自用于免疫沉淀的抗體的Η鏈的譜帶和60kDa的GPR49的譜帶，使用HRP標記抗小 鼠 κ抗體（Southern Biotech公司制備）作為二次抗體。
[0083] 圖9是通過使用單克隆抗體的WB檢測各種癌細胞株的細胞破碎液的照片。照 片中的泳道表示樣品名稱，分別表示大腸癌細胞株LoVo、胃癌細胞株NUGC-4、肝細胞癌株 Alexander、肝細胞癌株Η印G2、肝細胞癌株Huh6、卵巢癌細胞株KURAM0CHI、卵巢癌細胞株 0VSAH0、神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、中國倉鼠卵巢細胞DG44、HA-GPR49表達DG44細胞株2B10。
[0084] 圖10是顯示GPR49抗體的⑶C活性的圖。
[0085] 圖11是顯示GPR49抗體對HA-GPR49表達DG44細胞的ADCC活性的圖。
[0086] 圖12是顯示使用了 Mab-Zap的抗體的內(nèi)化所產(chǎn)生的細胞殺傷活性的圖。3根棒圖 顯示通過WST8分析測定活細胞的比例的結(jié)果，其中，左：在GPR49誘導表達293細胞株B4 的非誘導細胞中加入有抗體和Mab-Zap的樣品；中：在GPR49表達誘導細胞中加入有抗體 和Mab-Zap的樣品；右：在GPR49表達誘導細胞中只加入抗體的樣品。
[0087] 圖13是顯示GPR49的結(jié)構(gòu)和缺失突變體、GST融合蛋白中所含的區(qū)的圖。
[0088] 圖14是顯示2U1E-U2T15E-2與GST融合蛋白通過WB的反應性的照片。
[0089] 圖15是顯示抗小鼠 GPR49單克隆抗體2U1E-U2U2E-2通過WB的反應性的照片。 均與人⑶和小鼠（M)的GPR49反應。
[0090] 圖16是顯示利用FACS (流式細胞術）評價結(jié)合活性的結(jié)果的圖。實線顯示的峰 表示與癌細胞株的反應性，陰影部分表示在沒有抗體的情況下反應時的峰。橫軸顯示利用 結(jié)合有FITC的抗體的結(jié)合度測定的信號的強度，縱軸顯示細胞數(shù)。

【具體實施方式】
[0091] GPR49
[0092] GPR49是7次跨膜型的LGR家族成員的蛋白。人GPR49的氨基酸序列和編碼該序 列的基因序列分別公開在NCBI檢索號NP_003658. 1(SEQ ID N0:1)和NM_003667. 2(SEQ ID NO :2)中。在本發(fā)明中，GPR49蛋白的含義包括全長蛋白及其片段兩者。片段是指含有GPR49 蛋白的任意區(qū)域的多肽，可以不具有天然GPR49蛋白的功能。片段的例子有：包括GPR49蛋 白的胞外區(qū)的片段。GPR49蛋白的胞外區(qū)在SEQ ID N0 :1的氨基酸序列中相當于第1-556 位、第615-637位、第704-722位、以及第792-800位?？缒^(qū)在SEQ ID N0 :1的氨基酸序 列中相當于第557-579位、第592-614位、第638-660位、第681-703位、第723-745位、第 769-791 位、以及第 801-823 位。
[0093] 抗GPR49抗體的制作
[0094] 本發(fā)明中使用的抗GPR49抗體只要與GPR49蛋白結(jié)合即可，不限定其來源、種類、 形狀等。具體可以使用非人動物的抗體（例如小鼠抗體、大鼠抗體、駱駝抗體）、人抗體、嵌 合抗體、人源化抗體等公知的抗體。本發(fā)明中，可以使用單克隆抗體或多克隆抗體作為抗 體，但優(yōu)選為單克隆抗體?？贵w與GPR49蛋白的結(jié)合優(yōu)選為特異性結(jié)合。
[0095] 本發(fā)明中使用的抗GPR49抗體，可以利用公知的方法，以多克隆或單克隆抗體的 形式獲得。本發(fā)明中使用的抗GPR49抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳 動物的單克隆抗體包括：由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體；以及利用基因工程的方法，由用含 有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的單克隆抗體等。
[0096] 產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤基本上可以采用公知技術如下制備。首先，使用GPR49 蛋白作為致敏抗原，按照常規(guī)的免疫方法對其進行免疫。按照常規(guī)的細胞融合法使由免疫 動物得到的免疫細胞與公知的親本細胞融合，得到雜交瘤。再利用通常的篩選法，從該雜交 瘤中篩選產(chǎn)生目標抗體的細胞，從而可以選擇產(chǎn)生抗GPR49抗體的雜交瘤。
[0097] 具體而言，單克隆抗體的制備可如下進行。首先，通過表達GPR49基因，可以獲 得用作取得抗體的致敏抗原的GPR49蛋白。GPR49基因的核苷酸序列公開在NCBI檢索號 NM_003667. 2(SEQ ID NO :2)等中。即，將編碼GPR49的基因序列插入公知的表達載體中，轉(zhuǎn) 化適當?shù)乃拗骷毎?，之后按照公知的方法，可以從其宿主細胞中或培養(yǎng)上清中純化目標人 GPR49蛋白。純化的天然GPR49蛋白也可同樣使用。另外，象本發(fā)明所使用的那樣，還可以 利用使GPR49蛋白的所需的部分多肽與不同的多肽融合的融合蛋白作為免疫原。為了制造 作為免疫原的融合蛋白，例如可以利用抗體的Fc片段或肽標簽等。表達融合蛋白的載體可 如下制作：通過使所需的編碼兩種或兩種以上多肽片段的基因進行符合讀框的融合，將該 融合基因插入表達載體中來制作。融合蛋白的制作方法例如記載在Molecular Cloning2nd ed. (Sambrook, J 等人,Molecular Cloning2nd ed. , 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)中。
[0098] 如此操作而純化的GPR49蛋白可以用作用于對哺乳動物進行免疫的致敏抗原。 GPR49的部分肽也可用作致敏抗原。例如，可以以下述肽作為致敏抗原。
[0099] 根據(jù)人GPR49的氨基酸序列通過化學合成獲得的肽；
[0100] 將GPR49基因的一部分整合到表達載體中，使其表達而獲得的肽；
[0101] 利用蛋白分解酶分解GPR49蛋白而獲得的肽。
[0102] 對用作部分肽的GPR49的區(qū)域和大小沒有限定。優(yōu)選的區(qū)域可以從構(gòu)成GPR49 的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列（SEQ ID N0 :1的氨基酸序列中第1-556位、第615-637位、第 704-722位、以及第792-800位）中選擇。構(gòu)成作為致敏抗原的肽的氨基酸數(shù)目優(yōu)選為至少 3以上、例如5以上或6以上。更具體而言，可以以8?50、優(yōu)選10?30個殘基的肽作為 致敏抗原。
[0103] 對用該致敏抗原免疫的哺乳動物沒有特別限定。為了利用細胞融合法得到單克隆 抗體，優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的適合性來選擇免疫動物。通常作為免疫動物， 優(yōu)選嚙齒類動物。具體可以以小鼠、大鼠、倉鼠或兔作為免疫動物。此外，猴等也可作為免 疫動物。
[0104] 可以按照公知的方法，利用致敏抗原免疫上述動物。例如常規(guī)方法為：通過腹腔 內(nèi)或皮下注射致敏抗原，可以對哺乳動物實施免疫。具體而言，每4?21天對哺乳動物多 次給予該致敏抗原。致敏抗原用PBS(磷酸緩沖鹽）或生理鹽水等按適當?shù)南♂尡堵氏♂?后用于免疫。并且，可以將致敏抗原與佐劑一同給藥。例如，可以將致敏抗原與弗氏完全佐 劑混合、乳化，作為致敏抗原。另外，用致敏抗原進行免疫時可使用適當?shù)妮d體。特別是使 用分子量小的部分肽作為致敏抗原時，優(yōu)選將該致敏抗原肽與白蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白 (keyhole limpet hemocyanin)等載體蛋白結(jié)合后進行免疫。
[0105] 另一方面，單克隆抗體還可以通過DNA免疫（DNA Immunization)而獲得。所謂DNA 免疫，是指將在免疫動物中以編碼抗原蛋白的基因能夠表達的方式構(gòu)建的載體DNA給予該 免疫動物，使免疫抗原在免疫動物體內(nèi)表達，從而賦予免疫刺激的方法。與給予蛋白抗原的 普通免疫方法相比，在DNA免疫中有望獲得下述優(yōu)勢。
[0106] -可以維持GPR49這樣的膜蛋白結(jié)構(gòu)不變而賦予免疫刺激
[0107] -不必純化免疫抗原
[0108] 但另一方面，在DNA免疫中難以與佐劑等免疫刺激手段組合。由于GPR49具有7次 跨膜型立體結(jié)構(gòu)這樣的結(jié)構(gòu)特征，所以預料難以在體內(nèi)保持天然存在的結(jié)構(gòu)不變的情況下 引發(fā)免疫反應。與由于這樣的結(jié)構(gòu)特征而難以獲得抗體的、屬于LGR家族的蛋白GPR49結(jié) 合的單克隆抗體通過DNA免疫而實際獲得，這是出乎意料的成果。
[0109] 通過DNA免疫獲得本發(fā)明的單克隆抗體時，首先，對免疫動物給予表達GPR49蛋白 的DNA。編碼GPR49的DNA可以通過PCR等公知方法來合成。將得到的DNA插入適當?shù)谋?達載體中，之后給予免疫動物。作為表達載體，例如可以使用pcDNA3. 1等市售的表達載體。 對生物體給予載體的方法也可采用通常使用的方法。例如，將吸附有表達載體的金顆粒通 過基因槍（gene gun)打入細胞內(nèi)，從而可以進行DNA免疫。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明人等的經(jīng)驗，由通過向腹腔內(nèi)給予GPR49強制表達細胞來進行免疫的 小鼠無法高效率地得到產(chǎn)生GPR49結(jié)合性抗體的雜交瘤，相對于此，由利用DNA免疫來進行 免疫的小鼠可以高效率地獲得產(chǎn)生GPR49結(jié)合性抗體的雜交瘤。特別是在DNA免疫后進一 步給予了 GPR49強制表達細胞的小鼠中，可以容易地獲得目標雜交瘤。即，在DNA免疫后利 用GPR49表達細胞來進行追加免疫（boost)，這是獲得本發(fā)明的單克隆抗體的優(yōu)選方法。
[0111] 如此地對哺乳動物進行免疫，確認血清中所需抗體量升高后，從哺乳動物采集免 疫細胞用于細胞融合。特別優(yōu)選使用脾細胞作為免疫細胞。
[0112] 與上述免疫細胞融合的細胞使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。優(yōu)選骨髓瘤細胞具備用 于篩選的適當?shù)倪x擇標志物。選擇標志物是指，可以（或者不可以）在特定的培養(yǎng)條件下 生存的特性。選擇標志物中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（以下簡記為HGPRT 缺陷）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（以下簡記為TK缺陷）等是公知的。存在HGPRT或TK缺 陷的細胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性（以下簡記為HAT感受性）。HAT感受性 的細胞在HAT選擇培養(yǎng)基中無法進行DNA合成而死亡，但與正常細胞融合時，利用正常細胞 的補救途徑可以繼續(xù)進行DNA的合成，所以在HAT選擇培養(yǎng)基中也能夠增殖。
[0113] HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞，各自可以在含有6-硫代鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤（以下 簡記為8AG)或5'-溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基中進行選擇。正常細胞由于將上述嘧啶類似物攝 入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的細胞由于不攝入上述嘧啶類似物，所以可以在選擇培 養(yǎng)基中生存。此外，被稱作G418耐性的選擇標志物由于新霉素耐性基因，提供對2-脫氧鏈 霉胺類抗生素（慶大霉素類似物）的耐性。適于細胞融合的各種骨髓瘤細胞是公知的。例 如，制造本發(fā)明的單克隆抗體時可以使用下述骨髓瘤細胞。
[0114] P3(P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123,1548-1550)；
[0115] P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)；
[0116] NS-1 (Kohler. G.和 Milstein，C.Eur.J. Immunol. (1976)6,511-519);
[0117] MPC-ll(Margulies.D.H.等人，Cell (1976)8,405-415);
[0118] SP2/0(Shulman，M.等人，Nature (1978) 276, 269-270);
[0119] F0 (de St. Groth，S. F.等人，J. Immunol. Methods (1980) 35,1-21);
[0120] S194 (Trowbridge, I. S.J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)；
[0121] R210(Galfre，G.等人，Nature (1979) 277,131-133)等
[0122] 基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法（Kohler. G.和 Milstein，C.、Methods Enzymol. (1981)73,3-46)等，進行免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融 合。
[0123] 更具體而言，例如在細胞融合促進劑的存在下、在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，可以實施 上述細胞融合。融合促進劑例如可以使用聚乙二醇（PEG)、仙臺病毒（HVJ)等。為了進一步 提高融合效率，根據(jù)需要，還可以添加二甲基亞砜等輔助劑。
[0124] 免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定。例如，優(yōu)選相對于骨髓瘤細胞， 使免疫細胞為1?10倍。用于上述細胞融合的培養(yǎng)液例如可以使用：適合上述骨髓瘤細胞 株增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及用于該種細胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)液。并且，可以 在培養(yǎng)液中添加胎牛血清（FCS)等血清補液。
[0125] 細胞融合可如下形成：將規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中充 分混合，再混合預先加熱至37°C左右的PEG溶液，從而形成目標融合細胞（雜交瘤）。在細 胞融合法中，通?？梢砸?0?60% (w/v)的濃度添加例如平均分子量為1000?6000左右 的PEG。接著，依次添加上述例舉的適當培養(yǎng)液，離心以除去上清，通過重復該操作，可除去 不利于雜交瘤生長的細胞融合劑等。
[0126] 如此操作而得到的雜交瘤，可以通過使用選擇培養(yǎng)液而進行選擇，所述選擇培養(yǎng) 液對應于用于細胞融合的雜交瘤所具有的選擇標志物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的細胞， 可通過在HAT培養(yǎng)液（含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)液）中培養(yǎng)來進行選擇。 艮P，將HAT感受性的骨髓瘤細胞用于細胞融合時，在HAT培養(yǎng)液中，成功地與正常細胞進行 細胞融合的細胞能夠選擇性地增殖。為了使目標雜交瘤以外的細胞（非融合細胞）死亡， 使用上述HAT培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)足夠的時間。具體而言，通常通過培養(yǎng)數(shù)天至數(shù)周，可以選擇 目標雜交瘤。接著，通過實施常規(guī)的極限稀釋法，可以實施產(chǎn)生目標抗體的雜交瘤的篩選和 單克隆?；蛘?，還可以按照國際公開W003/104453中所述的方法制備識別GPR49的抗體。
[0127] 目標抗體的篩選和單克隆可優(yōu)選按照基于公知的抗原抗體反應的篩選方法來實 施。例如，使抗原與用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等載體結(jié)合，再與雜 交瘤的培養(yǎng)上清反應。然后清洗載體，之后與用酶標記的二次抗體等反應。當培養(yǎng)上清中 含有與致敏抗原反應的目標抗體時，二次抗體經(jīng)由該抗體與載體結(jié)合。最終，通過檢測與載 體結(jié)合的二次抗體，可以確定培養(yǎng)上清中是否存在目的抗體。利用極限稀釋法等可以克隆 能與抗原結(jié)合的產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。此時，抗原不僅可以使用用于免疫的抗原，還可以 適當使用實質(zhì)上為相同性質(zhì)的GPR49蛋白。例如，可以使用表達GPR49的細胞株、GPR49的 胞外結(jié)構(gòu)域、或者包含構(gòu)成該區(qū)的部分氨基酸序列的寡肽作為抗原。
[0128] 除通過用抗原對人以外的動物進行免疫而獲得上述雜交瘤的方法外，對人淋巴細 胞進行抗原致敏，也可得到目標抗體。具體而言，首先，在體外用GPR49蛋白致敏人淋巴細 胞。然后，使免疫致敏的淋巴細胞與適當?shù)娜诤吓渑俭w融合。融合配偶體可以使用例如來 自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞（參照日本特公平1-59878號公報）。通過該方法 得到的抗GPR49抗體是與GPR49蛋白具有結(jié)合活性的人抗體。
[0129] 并且，通過對具有完全人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物給予作為抗原的 GPR49蛋白、或者用按照在該動物中表達GPR49的方式構(gòu)建的DNA進行免疫，也可得到抗 GPR49抗體。免疫動物的抗體產(chǎn)生細胞通過與適當?shù)娜诤吓渑俭w進行細胞融合、或者通過 EB病毒感染等處理，可以使之無限增殖?？梢詮娜绱瞬僮鞫玫降臒o限增殖細胞中分離抗 GPR49 蛋白的人抗體（參照國際公開 TO94/25585、TO93/12227、TO92/03918、TO94/02602)。 并且，通過克隆無限增殖的細胞，也可以克隆產(chǎn)生具有目標反應特異性的抗體的細胞。以轉(zhuǎn) 基因動物作為免疫動物時，該動物的免疫系統(tǒng)將人GPR49識別為異物。因此，可以容易地得 到抗人GPR49的人抗體。
[0130] 如此操作而制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可在常規(guī)培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)。還可以 在液氣中長期保存該雜受瘤。
[0131] 按照常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤，從其培養(yǎng)上清中可以獲得目標單克隆抗體?；蛘?，還 可以將雜交瘤給予與其具有適合性的哺乳動物以使其增殖，以其腹水的形式獲得單克隆抗 體。前一種方法適合獲得高純度的抗體。
[0132] 本發(fā)明中，還可以利用由抗體產(chǎn)生細胞克隆的抗體基因所編碼的抗體。將克隆的 抗體基因整合到適當?shù)妮d體中，再導入宿主中，從而可以以抗體的形式表達。用于抗體基因 的分離、載體的導入、以及宿主細胞的轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)確立（例如參照Vandamme，A.M.等 人·，Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767 ?775)。
[0133] 例如，可以從產(chǎn)生抗GPR49抗體的雜交瘤細胞中得到編碼抗GPR49抗體的可變區(qū) (V區(qū)）的cDNA。因此，通常首先從雜交瘤中提取總RNA。作為用于從細胞中提取mRNA的方 法，例如可以采用以下方法。
[0134] 狐超離心法（Chirgwin，J. M.等人·，Biochemistry (1979) 18, 5294 ?5299) ;AGPC 法（Chomczynski，Ρ·等人·，Anal. Biochem. (1987) 162,156 ?159)。
[0135] 所提取的mRNA可以用mRNA純化試劑盒（GE Healthcare Bio-Sciences制備）等 進行純化?；蛘撸驫uickPrep mRNA純化試劑盒（GE Healthcare Bio-Sciences制備）等那 樣，用于從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒也有市售。使用這種試劑盒，也可以從雜交瘤 中得到總mRNA?？梢允褂媚孓D(zhuǎn)錄酶，由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA?？梢允褂脧呐c 小鼠的抗體基因共通的序列中選出的任意15-30個堿基的序列作為引物。具體而言，通過 使用具有SEQ ID N0 :61?63所示的DNA序列的引物，得到編碼抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可 以通過AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈 cDNA 合成試劑盒（AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(生化學工業(yè)公司制備）等來合成。為了進行cDNA的合成和擴增， 可以采用5' -Ampli FINDER RACE試劑盒（Clontech制備）和使用PCR的5' -RACE法 (Frohman，M. A.等人·，Proc. Natl. Acid. Sci. USA (1988) 85,8998 ?9002、Belyavsky，A.等 人.，Nucleic Acids Res. (1989) 17,2919 ?2932)。并且，在上述 cDNA 的合成過程中，可 以向cDNA的兩個末端導入后述的適當?shù)南拗泼盖形稽c。
[0136] 由所得的PCR產(chǎn)物純化目標cDNA片段，接著與載體DNA連接。如上制備重組載體， 將其導入大腸桿菌等中，選擇集落后，可以由形成該集落的大腸桿菌制備所需的重組載體。 而且，cDNA的核苷酸序列可以通過公知的方法、例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等來確認。
[0137] 此外，為了得到編碼抗體可變區(qū)的基因，還可以利用cDNA引物。首先，以從抗體產(chǎn) 生細胞中提取的mRNA為模板合成cDNA，得到cDNA文庫。在cDNA文庫的合成中，使用市售 的試劑盒是便利的。實際上，由于僅由少數(shù)細胞得到的mRNA極其微量，所以若將其直接純 化則收率低。因此，通常是添加已明確不含抗體基因的載體RNA后再純化?；蛘撸诳梢蕴?取一定量的RNA時，即使僅是抗體產(chǎn)生細胞的RNA，也可以高效率地提取。例如從10以上、 或30以上、優(yōu)選50以上的抗體產(chǎn)生細胞中提取RNA時，有時不必添加載體RNA。
[0138] 已所得cDNA文庫為模板，利用PCR法擴增抗體基因。用于通過PCR法擴增抗體基 因的引物是公知的。例如，可以根據(jù)論文（J.Mol.Biol. (1991)222,581-597)等公開的內(nèi) 容，設計人抗體基因擴增用的引物。這些引物在每一免疫球蛋白的亞類都形成不同的核苷 酸序列。因此，以亞類不明確的cDNA文庫為模板時，考慮所有可能性后再進行PCR法。
[0139] 具體而言，例如為了取得編碼人IgG的基因時，可以使用可擴增編碼作為重鏈的 ?Y5、作為輕鏈的K鏈和λ鏈的基因的引物。為了擴增IgG的可變區(qū)基因，通常3' 側(cè)的引物中使用在相當于鉸鏈區(qū)的部分退火的引物。而5'側(cè)的引物中可以使用對應于各 亞類的引物。
[0140] 將由重鏈和輕鏈的各亞類的基因擴增用引物得到的PCR產(chǎn)物制成各自獨立的文 庫。利用如此合成的文庫，可以重構(gòu)包含重鏈與輕鏈的組合的免疫球蛋白。以重構(gòu)的免疫 球蛋白與GPR49的結(jié)合活性為指標，可以篩選目標抗體。
[0141] 例如，為了獲取抗GPR49抗體時，進一步優(yōu)選抗體與GPR49的結(jié)合為特異性的。與 GPR49結(jié)合的抗體例如可以如下篩選。
[0142] (1)使抗體與GPR49接觸的步驟，所述抗體含有由所得的cDNA編碼的V區(qū)；
[0143] (2)檢測GPR49與抗體的結(jié)合的步驟；以及
[0144] (3)選擇與GPR49結(jié)合的抗體的步驟。
[0145] 檢測抗體與GPR49的結(jié)合的方法是公知的。具體而言，使被檢抗體與固定在載體 上的GPR49反應，接下來使之與識別抗體的標記抗體反應。清洗后檢測出載體上的標記抗 體時，可以證明該被檢抗體與GPR49結(jié)合。標記中可以使用過氧化物酶或β-半乳糖苷酶 等酶活性蛋白、或FITC等熒光物質(zhì)。為了評價抗體的結(jié)合活性，還可以使用表達GPR49的 細胞的固定標本。
[0146] 作為以結(jié)合活性為指標的抗體的篩選方法，還可采用利用了噬菌體載體的淘選 法。按上述方式獲取抗體基因作為重鏈和輕鏈的亞類的文庫時，利用噬菌體載體的篩選法 是有利的。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因通過以適當?shù)慕宇^序列連接，可以形成單鏈 Fv(scFv)。將編碼scFv的基因插入噬菌體載體中時，可以得到在表面表達scFv的噬菌體。 使該噬菌體與目標抗原接觸，回收與抗原結(jié)合的噬菌體時，可以回收編碼具有目標結(jié)合活 性的scFv的DNA。根據(jù)需要重復該操作，可以濃縮具有目標結(jié)合活性的scFv。
[0147] 本發(fā)明中，編碼抗體的多核苷酸可以編碼抗體的全長、或者可以編碼抗體的一部 分?？贵w的一部分是指抗體分子的任意部分。以下，作為表示抗體的一部分的用語，有時 使用抗體片段。本發(fā)明中優(yōu)選的抗體片段包括抗體的互補鏈決定區(qū)（complementarity determination region;⑶R)。進一步優(yōu)選本發(fā)明的抗體片段包括構(gòu)成可變區(qū)的全部的3 個 CDR。
[0148] 獲得編碼目標抗GPR49抗體V區(qū)的cDNA后，通過識別插入到該cDNA的兩個末端 的限制酶切位點的限制酶消化該cDNA。優(yōu)選的限制酶識別、消化在構(gòu)成抗體基因的核苷酸 序列中出現(xiàn)的可能性低的核苷酸序列。為了進一步將單拷貝的消化片段按正確方向插入載 體中，優(yōu)選提供粘性末端的限制酶。通過將上述被消化的編碼抗GPR49抗體V區(qū)的cDNA插 入適當?shù)谋磉_載體中，可以得到抗體表達載體。此時，通過使編碼抗體恒定區(qū)（C區(qū)）的基 因與編碼上述V區(qū)的基因進行符合讀框的融合，可以得到嵌合抗體。此處的嵌合抗體是指 恒定區(qū)和可變區(qū)的來源不同。因此，除小鼠-人等的異種嵌合抗體外，人-人同種嵌合抗體 也包括在本發(fā)明的嵌合抗體中。預先將上述V區(qū)基因插入整合有編碼恒定區(qū)的DNA的表達 載體中，也可構(gòu)建嵌合抗體表達載體。
[0149] 具體而言，例如在保持有編碼所需抗體恒定區(qū)（C區(qū)）的DNA的表達載體的5'側(cè)， 可以預先配置消化上述V區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。用相同組合的限制酶消化兩 者，使之進行符合讀框的融合，從而構(gòu)建嵌合抗體表達載體。
[0150] 為了制備本發(fā)明中使用的抗GPR49抗體，可以將抗體基因整合到表達載體中，使 在表達控制區(qū)的控制下表達。用于表達抗體的表達控制區(qū)例如包括增強子和啟動子。接著， 使用該表達載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，由此可以獲得表達編碼抗GPR49抗體的DNA的重組 細胞。
[0151] 表達抗體基因時，可以將編碼抗體重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）的DNA分別整合到 另一表達載體中。將整合有Η鏈和L鏈的載體同時轉(zhuǎn)化（共轉(zhuǎn)染，co-transfect)到相同 的宿主細胞中，從而可以使具備Η鏈和L鏈的抗體分子表達?；蛘撸梢詫⒕幋aΗ鏈和L鏈 的DNA整合到單一的表達載體中，來轉(zhuǎn)化宿主細胞（參照國際公開W094/11523)。
[0152] 用于將分離的抗體基因?qū)脒m當?shù)乃拗髦幸灾苽淇贵w的宿主與表達載體的多個 組合是公知的。這些表達系統(tǒng)均可應用于本發(fā)明。使用真核細胞作為宿主時，可以使用動 物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，可用于本發(fā)明的動物細胞可以例示下述細胞：
[0153] (1)哺乳類細胞：CH0、C0S、骨髓瘤、ΒΗΚ(幼倉鼠腎）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、 HL-60、Jurkat、SK-HEP1 等；
[0154] (2)兩棲類細胞：非洲爪蟾卵細胞等；以及
[0155] (3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5 等。
[0156] 或者，作為植物細胞，來自煙草（Nicotiana tabacum)等煙草屬（Nicotiana)的細 胞產(chǎn)生的抗體基因的表達系統(tǒng)是公知的。在植物細胞的轉(zhuǎn)化中，可以使用進行了愈傷組織 培養(yǎng)的細胞。
[0157] 并且，作為真菌細胞，可以使用下述細胞。
[0158] 酵母：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)等酵母（Saccharomyces)屬、甲醇 營養(yǎng)型酵母（Pichia pastoris，巴斯德畢赤酵母）等畢赤酵母（Pichia)屬；
[0159] 絲狀菌：黑曲霉（Aspergillus niger)等曲霉（Aspergillue)屬。
[0160] 或者，使用原核細胞的抗體基因的表達系統(tǒng)也是公知的。例如，使用細菌細胞時， 可以將大腸桿菌（E. coli)、枯草桿菌等細菌細胞用于本發(fā)明。
[0161] 使用哺乳類細胞時，可以使polyA信號與常用的有效啟動子、要表達的抗體基因、 其3'側(cè)下游進行功能性結(jié)合來表達。例如，啟動子/增強子可以是人巨細胞病毒早期啟動 子/增強子。
[0162] 此外，可以將病毒啟動子/增強子、或人延伸因子la (HEFla)等來自哺乳類細胞 的啟動子/增強子等用于抗體表達。作為可以利用啟動子/增強子的病毒，具體可以例示： 逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)等。
[0163] 使用SV40啟動子/增強子時，可以采用Mulligan等人的方法（Nature (1979) 277， 108)。另外，利用 Mizushima 等人的方法（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)，可以容易 地將HEFla啟動子/增強子用于目標基因的表達。
[0164] 當為大腸桿菌時，使常用的有效啟動子、用于抗體分泌的信號序列和要表達的抗 體基因功能性連接，可以表達該基因。啟動子例如有l(wèi)acZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ 啟動子時，可以采用 Ward 等人的方法（Nature (1989) 341，544 ?546 ;FASEBJ. (1992)6， 2422 ?2427)?；蛘撸?Better 等人的方法（Science (1988) 240,1041 ?1043)，可以將 araB啟動子用于目標基因的表達。
[0165] 用于抗體分泌的信號序列在大腸桿菌的周質(zhì)中產(chǎn)生時，可以使用pel B信號序列 (Lei，S.P.等人，J.Bacteriol. (1987) 169,4379)。接著，分離在周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體，之后通 過使用尿素的胍鹽酸鹽這樣的蛋白改性劑，可重折疊抗體的結(jié)構(gòu)，使其具有所需的結(jié)合活 性。
[0166] 使用動物細胞來產(chǎn)生抗體時，作為用于向細胞外分泌所必需的信號序列，優(yōu)選使 用抗體的重鏈基因或輕鏈基因的信號序列。此外，還可以使用IL-3或IL-6等的分泌蛋白 所具有的信號序列。
[0167] 插入到表達載體中的復制起點可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病 毒（BPV)等的復制起點。并且，為了在宿主細胞體系中擴增基因拷貝數(shù)，可以向表達載體中 插入選擇標志物。具體可以使用下述選擇標志物：
[0168] 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（ΑΡΗ)基因；
[0169] 胸腺嘧啶核苷激酶（ΤΚ)基因；
[0170] 大腸桿菌黃噪呤-鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Ecogpt)基因；
[0171] 二氫葉酸還原酶（dhfr)基因等。
[0172] 將這些表達載體導入宿主細胞中，接下來，將轉(zhuǎn)化的宿主細胞在體外或體內(nèi)進行 培養(yǎng)，產(chǎn)生目標抗體。宿主細胞的培養(yǎng)可以按照公知的方法進行。例如，培養(yǎng)液可以使用 DMEM、MEM、RPMI1640、MDM，還可以結(jié)合使用胎牛血清（FCS)等血清補液。
[0173] 如上表達并產(chǎn)生的抗體，可以通過將常規(guī)蛋白質(zhì)純化中使用的公知方法單獨使用 或適當組合來進行純化。例如，可以通過適當選擇并組合蛋白A柱等親和柱、色譜柱、濾 器、超濾、鹽析、透析等，來分離、純化抗體（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow， David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,1988)〇
[0174] 另外，在重組型抗體的產(chǎn)生中，除了使用上述宿主細胞外，還可以使用轉(zhuǎn)基因動 物。即，將編碼目標抗體的基因?qū)雱游矬w內(nèi)，可以由該動物得到該抗體。例如，通過將抗 體基因符合讀框地插入到編碼乳汁中特性產(chǎn)生的蛋白的基因內(nèi)部，可以構(gòu)建融合基因。作 為乳汁中所分泌的蛋白，例如可以使用山羊β酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基 因的DNA片段注入到山羊胚胎中，再將該注入胚胎導入雌山羊體內(nèi)。接受了胚胎的山羊生 出轉(zhuǎn)基因山羊，從該轉(zhuǎn)基因山羊（或其后代）產(chǎn)生的乳汁中，可以以與乳汁蛋白形成的融合 蛋白的形式獲得所需抗體。另外，為了增加由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所需抗體的乳汁量，可 以將激素適當用于轉(zhuǎn)基因山羊（Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994) 12,699?702)。
[0175] 本發(fā)明的重組抗體的C區(qū)可以使用來自人以外的動物的抗體的C區(qū)。例如，小鼠 抗體的 Η鏈 C 區(qū)可以使用 CYl、Cy2a、CY2b、Cy3、Cy、CS、Ca l、Ca2、Ce，L鏈 C 區(qū)可 以使用Ck Χλ。另外，除小鼠以外的動物的抗體可以使用大鼠、兔、山羊、綿羊、駱駝、猴等 的抗體。它們的序列是公知的。為了改善抗體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，可以對C區(qū)進行修飾。
[0176] 本發(fā)明中，將抗體給予人時，為了降低對人的異種抗原性等，可以制成人工修飾的 基因重組型抗體?；蛑亟M型抗體例如包括：嵌合抗體、人源化抗體等。這些修飾抗體可以 采用公知的方法進行制備。
[0177] 嵌合抗體是指將來源互不相同的可變區(qū)和恒定區(qū)連接而成的抗體。例如，包含小 鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體是小鼠-人-異種嵌合 抗體。將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其整合到表達載 體中，從而可以制備表達嵌合抗體的重組載體。培養(yǎng)通過該載體轉(zhuǎn)化的重組細胞，使整合的 DNA表達，從而可以獲得培養(yǎng)中所產(chǎn)生的該嵌合抗體。在嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)使用 人抗體的C區(qū)。
[0178] 例如，在 Η 鏈中，可以使用 Cy 1、Cy2、Cy3、Cy4、Cu、CS、Ca l、Ca 2和 C ε 作 為C區(qū)。在L鏈中，可以使用Ck和CA作為C區(qū)。上述C區(qū)的氨基酸序列以及編碼該氨 基酸序列的核苷酸序列是公知的。為了改善抗體本身或抗體產(chǎn)生的穩(wěn)定性，可以對人抗體 C區(qū)進行修飾。
[0179] 通常，嵌合抗體由來自人以外的動物的抗體的V區(qū)和來自人抗體的C區(qū)構(gòu)成。相 對于此，人源化抗體由來自人以外的動物的抗體的互補性決定區(qū)（CDR)和來自人抗體的構(gòu) 架區(qū)（FR)、以及來自人抗體的C區(qū)構(gòu)成。由于人源化抗體在人體內(nèi)的抗原性降低，因此可用 作本發(fā)明的治療藥的有效成分。
[0180] 抗體可變區(qū)通常由夾在4個構(gòu)架區(qū)（FR)中的3個互補性決定區(qū)（⑶R)構(gòu)成。⑶R 實質(zhì)上是決定抗體的結(jié)合特異性的區(qū)。CDR的氨基酸序列富有多樣性。一方面，構(gòu)成FR的 氨基酸序列即使在具有不同結(jié)合特異性的抗體間往往也顯示出高度同源性。因此，通常通 過移植CDR，可以將某抗體的結(jié)合特異性移植到其它抗體中。
[0181] 人源化抗體也稱作重構(gòu)（reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物例如小鼠 抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于得到人源化抗體的常規(guī)基因重 組方法也是已知的。
[0182] 具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，例如重疊序列延 伸PCR(0verlap Extension PCR)是公知的。在重疊序列延伸PCR中，將該移植的編碼小鼠 抗體CDR的核苷酸序列附加在用于合成人抗體FR的引物上。分別準備4個FR的引物。通 常，向人FR中移植小鼠 CDR時，選擇與小鼠的FR同源性高的人FR，這對維持CDR的功能有 利。即，通常優(yōu)選利用包含與該移植的小鼠 CDR相鄰的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸 序列的人FR。
[0183] 另外，被連接的核苷酸序列設計成彼此符合讀框地進行連接。利用各自的引物分 別合成人FR。其結(jié)果，得到在各FR中附加有編碼小鼠 CDR的DNA的產(chǎn)物。各產(chǎn)物的編碼 小鼠 CDR的核苷酸序列設計成相互重疊。接著，使以人抗體基因為模板合成的產(chǎn)物的重疊 ⑶R部分相互退火，進行互補鏈合成反應。通過該反應，人FR經(jīng)由小鼠⑶R序列進行連接。
[0184] 最終，連接有3個⑶R和4個FR的全長V區(qū)基因使用下述引物進行擴增，所述引 物為對其5'末端和3'末端退火且附加有適當?shù)南拗泼缸R別序列。將如上得到的DNA與編 碼人抗體C區(qū)的DNA插入表達載體中，使符合讀框地融合，從而可以制備人型抗體表達用載 體。將該載體導入宿主中，建立重組細胞，之后培養(yǎng)該重組細胞，使編碼人源化抗體的DNA 表達，從而在該培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生該人源化抗體（參照歐洲專利公開EP239400、國 際公開 W096/02576)。
[0185] 通過定性或定量測定并評價如上制備的人源化抗體與抗原的結(jié)合活性，可以適當 選擇經(jīng)由CDR連接時該CDR形成良好的抗原結(jié)合部位的人抗體的FR。根據(jù)需要，還可以置 換FR的氨基酸殘基，使重構(gòu)人抗體的CDR形成適當?shù)目乖Y(jié)合部位。例如，應用用于向人 FR中移植小鼠 CDR的PCR法，可以向FR中導入氨基酸序列的突變。具體而言，可以向?qū)R 退火的引物中導入一部分核苷酸序列的突變。利用這樣的引物合成的FR中，導入了核苷酸 序列的突變。通過用上述方法測定并評價取代了氨基酸的突變型抗體與抗原的結(jié)合活性， 可以選擇具有所需性質(zhì)的突變FR序列（Sato, K.等人，Cancer Res，1993, 53,851?856)。
[0186] 另外，人抗體的獲得方法也是已知的。例如，在體外用所需抗原或表達所需抗原的 細胞致敏人淋巴細胞。接著，使致敏淋巴細胞與人骨髓瘤細胞融合，從而可以獲得與抗原具 有結(jié)合活性的所需人抗體（參照日本特公平1-59878)。在作為融合配偶體的人骨髓瘤細胞 中，例如可以使用U266等。
[0187] 通過用所需抗原對具有完全人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物進行 免疫，可以獲得所需的人抗體（參照國際公開W093/12227、W092/03918、W094/02602、 W094/25585、W096/34096、W096/33735)。并且，還已知使用人抗體文庫，通過淘選獲得人抗 體的技術。例如，利用噬菌體展示法，使人抗體的V區(qū)作為單鏈抗體（scFv)在噬菌體表面表 達，可以選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。通過分析所選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原 結(jié)合的人抗體V區(qū)的DNA序列。確定了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列后，使該V區(qū)序列與所 需人抗體C區(qū)序列進行符合讀框的融合，之后插入適當?shù)谋磉_載體中，從而可以制備表達 載體。將該表達載體導入上述例舉的優(yōu)選的表達細胞中，使編碼該人抗體的基因表達，從而 可以獲得該人抗體。這些方法已經(jīng)公知（國際公開W092/01047、W092/20791、W093/06213、 TO93/11236、TO93/19172、TO95/01438、W095/15388)。
[0188] 因此，作為本發(fā)明中使用的抗體的優(yōu)選方式之一，可以列舉具有人恒定區(qū)的抗體。
[0189] 本發(fā)明的抗體，只要與GPR49蛋白結(jié)合即可，不僅包括IgG所代表的二價抗體，還 包括一價抗體或IgM所代表的多價抗體。本發(fā)明的多價抗體包括：具有完全相同的抗原結(jié) 合部位的多價抗體、或具有一部分或完全不同的抗原結(jié)合部位的多價抗體。本發(fā)明的抗體 并不限于抗體的全長分子，只要與GPR49蛋白結(jié)合即可，可以是小分子抗體或其修飾物。
[0190] 小分子抗體包括全長抗體（whole antibody,例如全長IgG等）的一部分缺失的抗 體片段。只要與GPR49抗原具有結(jié)合能力即可，允許抗體分子的部分缺失。本發(fā)明中的抗體 片段優(yōu)選含有重鏈可變區(qū)（VH)和/或輕鏈可變區(qū)（VL)。此外，本發(fā)明中的抗體片段優(yōu)選含 有⑶R。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加和/或插入。并且，只要與GPR49 抗原具有結(jié)合能力即可，可以缺失VH和/或VL的一部分。另外，可變區(qū)可以進行嵌合化或 人源化。抗體片段的具體例子例如有：？ &13 4&13'4(&13'）24￥等。小分子抗體的具體例子 例如有：Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv、scFv (單鏈 Fv)、雙抗體、sc(Fv)2(單鏈（Fv)2)等。這些 抗體的多聚體（例如二聚體、三聚體、四聚體、多聚體）也包含在本發(fā)明的小分子抗體中。
[0191] 抗體片段可以通過用酶處理抗體生成抗體片段而得到。作為生成抗體片段 的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纖溶酶等是公知的?；蛘撸瑯?gòu)建編碼這些抗體片 段的基因，將其導入表達載體中，之后可以在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_（例如參照Co， Μ· S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976、Better，Μ·和 Horwitz，A. Η· Methods in Enzymology(1989) 178,476-496、Plueckthun，A.和 Skerra，A. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496、Lamoyi, E. , Methods in Enzymology(1989) 121,652-663、 Rousseaux，J.等人，Methods in Enzymology(1989) 121,663-669、Bird, R.E.等人， TIBTECH(1991)9,132-137)。
[0192] 消化酶切斷抗體片段的特定位置，給予下述特定結(jié)構(gòu)的抗體片段。對上述酶解得 到的抗體片段應用基因工程方法時，可以使抗體的任意部分缺失。
[0193] 木瓜蛋白酶消化：F(ab) 2或Fab
[0194] 胃蛋白酶消化：F(ab'）2或Fab'
[0195] 纖溶酶消化：Facb
[0196] 因此，本發(fā)明中的小分子抗體只要與GPR49具有結(jié)合親和性即可，可以是缺失了 任意區(qū)的抗體片段。并且，特別是在本發(fā)明的癌癥等細胞增殖性疾病的治療中，優(yōu)選抗體維 持其效應子活性。即，本發(fā)明中優(yōu)選的小分子抗體具有與GPR49的結(jié)合親和性和效應子功 能兩者。抗體的效應子功能包括ADCC活性和CDC活性。本發(fā)明中的治療用抗體，特別優(yōu)選 具有ADCC活性和/或⑶C活性作為效應子功能。
[0197] 雙抗體（Diabody)是指通過基因融合構(gòu)建的二價抗體片段（Holliger P等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444 ?6448 (1993) ;EP404,097 號；W093/11161 號等）。雙抗 體是由兩條多肽鏈構(gòu)成的二聚體。通常，構(gòu)成二聚物的多肽鏈，各自在同一條鏈中VL和VH 通過接頭進行結(jié)合。雙抗體中的接頭通常短至VL和VH無法相互結(jié)合。具體而言，構(gòu)成接 頭的氨基酸殘基例如為5個殘基左右。因此，編碼在同一條多肽鏈上的VL和VH無法形成 單鏈可變區(qū)片段，而是與另一單鏈可變區(qū)片段形成二聚體。其結(jié)果，雙抗體具有兩個抗原結(jié) 合部位。
[0198] scFv可通過連接抗體的Η鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)而得到。在scFv中，Η鏈V區(qū)和L鏈V 區(qū)經(jīng)由接頭、優(yōu)選肽接頭進行連接（Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acid. Sci. U. S. Α. 1988， 85, 5879?5883)。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以是來自本說明書中記載的任何抗體。 對連接V區(qū)的肽接頭沒有特別限定。例如可以使用包含3?25個殘基左右的任意單鏈肽 作為接頭。具體而言，例如可以使用后述的肽接頭等。
[0199] 兩鏈的V區(qū)例如可以按照上述PCR法進行連接。為了利用PCR法連接V區(qū)，首先， 在下述DNA中，以編碼全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作為模板：
[0200] 編碼抗體Η鏈或Η鏈V區(qū)的DNA序列；以及
[0201] 編碼抗體L鏈或L鏈V區(qū)的DNA序列。
[0202] 編碼Η鏈和L鏈的V區(qū)的DNA分別利用PCR法進行擴增，所述PCR法使用具有與 應擴增的DNA兩端的序列對應的序列的一對引物。接著，準備編碼肽接頭部分的DNA。編 碼肽接頭的DNA也可利用PCR來合成。在此時使用的引物的5'側(cè)附加可與另外合成的各 V區(qū)的擴增產(chǎn)物連接的核苷酸序列。接著，利用[Η鏈V區(qū)DNA]-[肽接頭DNA]-[L鏈V區(qū) DNA]的各DNA和裝配PCR用的引物進行PCR反應。
[0203] 裝配PCR用的引物包含在[H鏈V區(qū)DNA]的5'側(cè)退火的引物和在[L鏈V區(qū)DNA] 的3'側(cè)退火的引物的組合。即，裝配PCR用引物是指可以擴增編碼應合成的scFv的全長 序列的DNA的引物組。另一方面，[肽接頭DNA]中附加有可與各V區(qū)DNA連接的核苷酸序 列。其結(jié)果，連接上述DNA，再利用裝配PCR用引物，最終以擴增產(chǎn)物的形式生成scFv的全 長。暫且制作編碼scFv的DNA，按照常規(guī)方法可以獲取含有上述DNA的表達載體和通過該 表達載體轉(zhuǎn)化的重組細胞。其結(jié)果，培養(yǎng)所得的重組細胞，使編碼該scFv的DNA表達，從而 可獲得該scFv。
[0204] scFv-Fc是使Fc區(qū)與包含抗體的Η鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的scFv融合得到的小分子 抗體（Cellular&Molecular Immunology2006 ;3 :439-443)。對 scFv-Fc 中使用的 scFv 的 來源沒有特別限定，例如可以使用來自IgM的scFv。此外，對Fc的來源也沒有特別限定，例 如可以使用小鼠 IgG2(小鼠 IgG2a等）、人IgG(人IgGl等）。因此，作為scFv-Fc的優(yōu)選 方式的例子，可以列舉：IgM抗體的scFv片段和小鼠 IgG2a的CH2(例如Cy2)和CH3(例 如C γ 3)通過小鼠 IgG2a的鉸鏈區(qū)（Η γ )連接而成的scFv-Fc、或IgM抗體的scFv片段和 人IgGl的CH2和CH3通過人IgGl的鉸鏈區(qū)連接而成的scFv-Fc。
[0205] sc (Fv) 2是兩個VH和兩個VL通過接頭等連接形成單鏈的小分子抗體（Hudson等 人，J Immunol.Methodsl999;231:177 ?189)。sc(Fv)2 例如可以通過用接頭連接 scFv 來 制備。
[0206] 優(yōu)選具有以下特征的抗體，所述特征為：2個VH和2個VL以單鏈多肽的N末端側(cè) 為基點，按照VH、VL、VH、VL ([VH]-接頭-[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VL])的順序排列。
[0207] 2個VH和2個VL的順序并不特別限于上述排列，可以按照任何順序進行排列。例 如包括以下排列：
[0208] [VL]-接頭-[VH]-接頭-[VH]-接頭-[VL]
[0209] [VH]-接頭-[VL]-接頭-[VL]-接頭-[VH]
[0210] [VH]-接頭-[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VL]
[0211] [VL]-接頭-[VL]-接頭-[VH]-接頭-[VH]
[0212] [VL]-接頭-[VH]-接頭-[VL]-接頭-[VH]
[0213] 連接抗體可變區(qū)的接頭可以使用能夠通過基因工程導入的任意肽接頭、或化學合 成接頭（例如參照Protein Engineering,9(3),299?305,1996)中公開的接頭等。本發(fā) 明中優(yōu)選肽接頭。對肽接頭的長度沒有特別限定，本領域技術人員可以根據(jù)目的適當選擇。 通常，構(gòu)成肽接頭的氨基酸殘基為1?100個氨基酸，優(yōu)選3?50個氨基酸，進一步優(yōu)選 5?30個氨基酸，特別優(yōu)選為12?18個氨基酸（例如15個氨基酸）。
[0214] 構(gòu)成肽接頭的氨基酸序列，只要不阻礙scFv的結(jié)合作用即可，可以形成任意序 列。例如，當為肽接頭時，可以使用下述氨基酸序列。Ser
[0215] Gly · Ser
[0216] Gly · Gly · Ser
[0217] Ser · Gly · Gly
[0218] Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :53)
[0219] Ser · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :54)
[0220] Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :55)
[0221] Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :56)
[0222] Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :57)
[0223] Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :58)
[0224] Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :59)
[0225] Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :60)
[0226] (Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :53)) n
[0227] (Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :54) )n
[0228] [n為1以上的整數(shù)]
[0229] 關于肽接頭的氨基酸序列，本領域技術人員可以根據(jù)目的適當選擇。例如，決定上 述肽接頭長度的η通常為1?5,優(yōu)選1?3,更優(yōu)選為1或2。
[0230] 因此，本發(fā)明中特別優(yōu)選的sc(Fv)2的方式例如有以下sc(Fv)2。
[0231] [VH]_肽接頭（15個氨基酸）_[VL]_肽接頭（15個氨基酸）_[VH]_肽接頭（15個 氨基酸） _[VL]
[0232] 或者，還可以利用化學合成接頭（化學交聯(lián)劑）來連接V區(qū)。本發(fā)明中可以使用通 常用于交聯(lián)肽化合物等的交聯(lián)劑。例如下述化學交聯(lián)劑是公知的。這些交聯(lián)劑均有銷售。
[0233] N-羥基琥珀酰亞胺（NHS);
[0234] 二琥珀酰亞氨基辛二酸酯（DSS);
[0235] 雙（磺基琥珀酰亞氨基）辛二酸酯（BS3);
[0236] 二硫代雙（琥珀酰亞氨基丙酸酯）（DSP);
[0237] 二硫代雙（磺基琥珀酰亞氨基丙酸酯）（DTSSP);
[0238] 雙（琥珀酰亞氨基琥珀酸）乙二醇酯（EGS);
[0239] 雙（磺基琥珀酰亞氨基琥珀酸）乙二醇酯（磺基-EGS);
[0240] 二琥珀酰亞氨基酒石酸鹽（DST);
[0241] 二磺基琥珀酰亞氨基酒石酸鹽（磺基-DST);
[0242] 雙[2_(琥珀酰亞胺氧基羰基氧基）乙基]砜（BS0C0ES);以及
[0243] 雙[2_(磺基琥珀酰亞胺氧基羰基氧基）乙基]砜（磺基-BS0C0ES)等。
[0244] 連接4個抗體可變區(qū)時，通常需要3個接頭。多個接頭可以使用相同的接頭，也可 以使用不同的接頭。本發(fā)明中，優(yōu)選的小分子抗體為雙抗體或sc(Fv)2。為了獲得這樣的 小分子抗體，可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等處理抗體，生成抗體片段；或者構(gòu)建編 碼這些抗體片段的DNA，將其導入表達載體中，之后在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_即可（例如參 照 Co, M. S.等人，J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ;Better，Μ·和 Horwitz，A. Η·，Methods Enzymol. (1989)178,476-496 ;Pluckthun,A.和 Skerra,A·,Methods Enzymol. (1989)178， 497-515 ;Lamoyi，E.，Methods Enzymol. (1986) 121,652-663 ;Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol. (1986) 121,663-669 ;Bird，R.E.和 Walker，B.W.，Trends Biotechnol. (1991)9， 132-137)。
[0245] 本發(fā)明的抗體不僅包括一價抗體，還包括多價抗體。本發(fā)明的多價抗體包括具有 完全相同的抗原結(jié)合部位的多價抗體、或者具有一部分或完全不同的抗原結(jié)合部位的多價 抗體。
[0246] 作為抗體修飾物，還可以使用與聚乙二醇（PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。而且， 抗體上還可以結(jié)合化療藥物、毒性肽或放射性化學物質(zhì)等細胞毒性物質(zhì)。上述抗體修飾物 (以下稱為抗體綴合物）可以通過對所得抗體施行化學修飾而獲得。尚需說明的是，抗體的 修飾方法在該領域中已經(jīng)確立。如后所述，還可以以雙特異性抗體（bispecific antibody) 等分子型的形式獲取，所述雙特異性抗體通過基因重組技術設計成不僅識別GPR49蛋白、 還識別化療藥物、毒性肽、放射性化學物質(zhì)等細胞毒性物質(zhì)的形式。本發(fā)明中的"抗體"也 包括這些抗體。
[0247] 與抗GPR49抗體結(jié)合、發(fā)揮細胞毒活性作用的化療藥物可以例示如下述化療藥 物：阿扎立平、阿那曲唑、5-氮雜胞苷、博來霉素、硼替佐米（bortezomib)、苔蘚抑素-1、白 消安、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂德、苯丁酸氮芥、順鉬、伊立替康、卡鉬、克拉 屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、多西他賽、放線菌素 D、道諾霉素葡萄糖醛酸苷、柔紅 霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星、炔雌醇、雌莫司 汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、氟尿苷、氟達拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、吉 西他濱、己酸羥孕酮、羥基尿、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕 酮、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸 苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類、泰素、 丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏拉莫司汀、長春堿、長春瑞 濱、長春新堿。
[0248] 本發(fā)明中，優(yōu)選的化療藥物為小分子化療藥物。小分子化療藥物與抗體結(jié)合后，其 干涉抗體功能的可能性也小。本發(fā)明中，小分子化療藥物通常具有1〇〇?2000、優(yōu)選200? 1000的分子量。此處例示的化療藥物均為小分子化療藥物。本發(fā)明中的這些化療藥物包括 在機體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性化療藥物的前體藥物。前體藥物的活化可以是酶轉(zhuǎn)化，也可以是非酶 轉(zhuǎn)化。
[0249] 另外，還可以用毒性肽修飾抗體。毒性肽的例子有下述物質(zhì)：白喉毒素 A鏈 (Langone J. J.,等人，Methods in Enzymology，93, 307-308,1983)、綠胺桿菌外毒素 (Nature Medicine，2, 35〇_353,1"6)、菌麻毒蛋白 A 鏈（Fulton R. J.,等人，J. Biol. Chem.，261，5314-5319,1986 ;Sivam G.，等人，Cancer Res.，47, 3169-3173,1987 ;Cumber A. J.等人，J. Immunol. Methods，135,15-24,1990 ;Wawrzynczak E. J.，等人，Cancer Res.， 50,7519-7562，1990 ;Gheeite V.，等人，J. Immunol. Methods，142, 223-230,1991)、無糖鏈 蓖麻毒蛋白 A 鏈（Thorpe P.E·，等人，Cancer 1^8.，47,5924-5931，1987)、相思子毒素八 鏈（Wawrzynczak E. J.，等人，Br. J. Cancer，66, 361-366,1992 ;Wawrzynczak E. J.，等人， Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ;Sivam G.,等人，Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ; Thorpe P.E.，等人，Cancer Res.，47, 5924-5931，1987)、多花白樹毒蛋白（Sivam G.，等人， Cancer Res·，47, 3169-3173,1987 ;Cumber A. J.等人，J. Immunol. Methods，135,15-24， 1990 ;Wawrzynczak E.J·，等人，Cancer Res·，50, 7519-7562,1990 ;Bolognesi A.，等人， Clin. exp. Immunol.，89, 341-346,1992)、美洲商陸抗病毒蛋白（PAPs) (Bolognesi A.，等 人，Clin. exp. Immunol. , 89, 341-346,1992)、Briodin (Bolognesi A.,等人，Clin. exp. Immunol. ,89, 341-346,1992)、阜草毒蛋白（Bolognesi A.，等人，Clin. exp. Immunol. ,89， 341-346,1992)、地膚子皂苷（Cumber A. J·，等人，J. Immunol. Methods，135,15-24,1990; Wawrzynczak E.J.，等人，Cancer Res.，50, 7519-7562,1990 ;Bolognesi A.，等人，Clin, exp. Immunol.，89, 341-346,1992)、木鳘根蛋白（Bolognesi A.，等人，Clin. exp. Immunol.， 89, 341-346,1992)、石竹素 32 (Bolognesi A.，等人，Clin. exp. Immunol.，89, 341-346， 1992)、石竹素 30(Stirpe F.，Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195，1-8，1986)、塑蓮根毒蛋白 II (Stirpe F.，Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195,1-8,1986)、懈寄生凝集素 （Stirpe F.， Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195,1-8,1986)、塑蓮根毒蛋白 I (Stirpe F.，Barbieri L.， FEBS letter 195,1-8,1986)、商陸毒蛋白（Stirpe F·，Barbieri L·，F(xiàn)EBS letter 195， 1-8,1986)、小麥毒蛋白（Stirpe F.，Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195,1-8,1986)、軟瓜蛋白 (Stirpe F.，Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195，1-8，1986)、括樓素（〇3861138?.，等人4111·. J.Biochem.l76,581_588，1988;Bolognesi A.，等人，Clin. exp. Immunol.，89,341_346， 1992)。
[0250] 在本發(fā)明中，放射性化學物質(zhì)是指含有放射性同位素的化學物質(zhì)。對放射性同位 素沒有特別限定，可以使用任何放射性同位素，例如可以使用 32P、14C、125I、3H、131I、 186Re、188Re 等。在另一方式中，將一種或兩種以上的小分子化療藥物與毒性肽分別組合，可以用于修飾 抗體。抗GPR49抗體與上述小分子化療藥物的結(jié)合可以使用共價鍵或非共價鍵。結(jié)合有這 些化療藥物的抗體的制作方法是公知的。
[0251] 并且，蛋白性藥物或毒素可以通過基因工程方法與抗體結(jié)合。具體而言，例如使編 碼上述毒性肽的DNA與編碼抗GPR49抗體的DNA進行符合讀框的融合并整合到表達載體 中，可以構(gòu)建重組載體。將該載體導入適當?shù)乃拗骷毎校笈囵B(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化細胞，使重 組的DNA表達，可以以融合蛋白的形式得到結(jié)合有毒性肽的抗GPR49抗體。得到與抗體的 融合蛋白時，通常將蛋白性藥物或毒素配置在抗體的C末端側(cè)。還可以使肽接頭介于抗體 與蛋白性藥物或毒素之間。
[0252] 并且，本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體（bispecific antibody)。雙特異性抗體 是指，在同一抗體分子內(nèi)具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體。本發(fā)明中，雙特異性抗體可以 具有識別GPR49分子上的不同表位的抗原結(jié)合部位。這樣的雙特異性抗體相對于1分子的 GPR49可以結(jié)合2分子的抗體分子。其結(jié)果，有望獲得更強效的細胞毒作用。
[0253] 或者，還可以形成其中一個抗原結(jié)合部位識別GPR49、另一個抗原結(jié)合部位識別細 胞毒性物質(zhì)的雙特異性抗體。細胞毒性物質(zhì)具體包括化療藥物、毒性肽或放射性化學物質(zhì) 等。這樣的雙特異性抗體與表達GPR49的細胞結(jié)合，同時捕獲細胞毒性物質(zhì)。其結(jié)果，可以 使細胞毒性物質(zhì)直接作用于表達GPR49的細胞。即，利用識別細胞毒性物質(zhì)的雙特異性抗 體，可以特異性殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞的增殖。
[0254] 在本發(fā)明中，還可以組合識別GPR49以外的抗原的雙特異性抗體。例如，可以組合 識別非GPR49抗原的雙特異性抗體，所述非GPR49抗原與GPR49 -樣在作為靶的癌細胞的 細胞表面特異性表達。
[0255] 用于制備雙特異性抗體的方法是公知的。例如，使識別不同抗原的兩種抗體結(jié)合， 可以制作雙特異性抗體。進行結(jié)合的抗體可以是各自具有Η鏈和L鏈的1/2分子，也可以 是僅包含Η鏈的1/4分子?；蛘?，使產(chǎn)生不同的單克隆抗體的雜交瘤融合，也可以制備產(chǎn)生 雙特異性抗體的融合細胞。并且，利用基因工程方法可以制備雙特異性抗體。
[0256] 測定抗體的抗原結(jié)合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow，David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)時，可以采用公知的方法。例如可以使用 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法）、EIA(酶免疫測定法）、RIA (放射免疫測定法）或熒光免疫 法等。
[0257] 本發(fā)明的抗體可以是糖鏈被修飾的抗體。已知通過修飾抗體的糖鏈，可以增強抗 體的細胞毒活性。作為糖鏈被修飾的抗體，例如以下抗體是公知的。
[0258] 進行糖基化修飾的抗體（W099/54342等）；
[0259] 附加在糖鏈上的巖藻糖缺失的抗體（W000/61739、W002/31140等）；
[0260] 具有具等分GlcNAc的糖鏈的抗體（W002/79255等）等。
[0261] 抗體是否對表達GPR49蛋白的細胞具有細胞增殖抑制活性，這可以利用本領域技 術人員所公知的方法來測定。例如，在對象抗體的存在下和不存在下（或陰性對照抗體存 在下）培養(yǎng)表達GRP49蛋白的細胞，并測定其活細胞數(shù)，從而可以進行測定。只要抑制細胞 的增殖即可，對抑制的比例沒有特別限定，優(yōu)選的例子有：與對象抗體不存在下的活細胞數(shù) 相比，對象抗體存在下的活細胞數(shù)為90%以下、70%以下、50%以下等。對表達GPR49蛋白 的細胞沒有特別限定，可以列舉：用編碼GPR49蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細胞、胃癌、大腸癌、肝細 胞癌、肺癌、卵巢癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。
[0262] 為了治療目的而使用本發(fā)明的抗體時，抗體優(yōu)選為具有細胞毒活性的抗體。
[0263] 本發(fā)明中的細胞毒活性例如有：抗體依賴性細胞介導的細胞毒（ADCC)活性、補體 依賴性細胞毒（CDC)活性等。本發(fā)明中，CDC活性是指由補體系統(tǒng)產(chǎn)生的細胞毒活性。而 ADCC活性是指，特異性抗體附著于靶細胞的細胞表面抗原上時，保有Fcy受體的細胞（免 疫細胞等）經(jīng)由Fc γ受體與其Fc部位結(jié)合，給靶細胞帶來傷害的活性。
[0264] 抗GPR49抗體是否具有ADCC活性、或者是否具有⑶C活性，這可以利用公知的方 法進行測定（例如Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan 等人，John Wiley&Sons，Inc.，（1993)等）。
[0265] 具體而言，首先，制備效應細胞、補體溶液、靶細胞。
[0266] (1)效應細胞的制備
[0267] 從CBA/N小鼠等中摘出脾臟，在RPMI1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司制備）中分離 脾細胞。用含有10%胎牛血清（FBS、HyClone公司制備）的相同培養(yǎng)基清洗，之后將細胞 濃度調(diào)整至5 X 106個細胞/mL，即可制備效應細胞。
[0268] (2)補體溶液的制備
[0269] 將幼兔補體（Baby Rabbit Complement) (CEDARLANE 公司制備）用含有 10% FBS 的培養(yǎng)基（Invitrogen公司制備）稀釋10倍，可以制備補體溶液。
[0270] (3)靶細胞的制備
[0271] 將表達GPR49蛋白的細胞與0· 2mCi的51Cr-鉻酸鈉 （GE Healthcare Bio-Sciences公司制備）一起在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中、在37°C下培養(yǎng)1小時，從 而可以放射性標記該靶細胞。表達GPR49蛋白的細胞可以使用以編碼GPR49蛋白的基因轉(zhuǎn) 化的細胞、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巢癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。放射性標記后，將細胞用 含有10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗3次，將細胞濃度調(diào)整至2 X 105個細胞/mL，從而可 以制備該靶細胞。
[0272] ADCC活性或⑶C活性可以利用下述方法測定。測定ADCC活性時，在96孔U底板 (Becton Dickinson公司制造）中分別加入50 μ L靶細胞和抗GPR49抗體，在冰上反應15 分鐘。之后，加入100 μ L效應細胞，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時?？贵w的終濃度為0或 10yg/mL。培養(yǎng)后，回收100yL上清，用γ射線計數(shù)儀（C0BRAII AUT0-GAMMA，型號D5005， Packard Instrument Company公司制造）測定放射活性。細胞毒活性（％)可以使用所 得值、根據(jù)算式（A-CV(B-C)XIOO來計算。A表示各試樣的放射活性（cpm)，B表示加入了 1 % NP-40 (nacalai tesque公司制備）的試樣的放射活性（cpm)，C表示只含祀細胞的試樣 的放射活性（cpm)。
[0273] 另一方面，測定⑶C活性時，向96孔平底板（Becton Dickinson公司制造）中分 別加入50 μ L靶細胞和抗GPR49抗體，在冰上反應15分鐘。之后，加入100 μ L補體溶液， 在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時?？贵w的終濃度為0或Syg/mL。培養(yǎng)后，回收lOOyL上 清，用Y射線計數(shù)儀測定放射活性。細胞毒活性可以和ADCC活性的測定同樣計算。
[0274] 而當測定抗體綴合物的細胞毒活性時，向96孔平底板（Becton Dickinson公司制 造）中分別加入50 μ L靶細胞和抗GPR49抗體綴合物，在冰上反應15分鐘。在二氧化碳培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1?4小時。使抗體的終濃度達到0或3 μ g/mL。培養(yǎng)后，回收100 μ L上清，用 Υ射線計數(shù)儀測定放射活性。細胞毒活性可以和ADCC活性的測定同樣計算。作為本發(fā)明 中使用的抗體的另一方式，可以列舉具有內(nèi)化活性的抗體。在本發(fā)明中，"具有內(nèi)化活性的 抗體"是指，與細胞表面上的GPR49結(jié)合時被輸送到細胞內(nèi)（細胞質(zhì)內(nèi)、小泡內(nèi)、其他小器官 內(nèi)等）的抗體。
[0275] 抗體是否具有內(nèi)化活性，這可以利用本領域技術人員所公知的方法來確認，例如 可以采用下述方法進行確認：使結(jié)合有標記物質(zhì)的抗GPR49抗體與表達GPR49的細胞接觸， 之后確認該標記物質(zhì)是否被攝入細胞內(nèi)的方法；使結(jié)合有細胞毒性物質(zhì)的抗GPR49抗體與 表達GPR49的細胞接觸，之后確認是否誘導了該GPR49表達細胞的細胞死亡的方法等。更 具體而言，利用下述實施例中記載的方法等，可以確認抗體是否具有內(nèi)化活性。
[0276] 具有內(nèi)化活性的抗體，例如可以通過結(jié)合上述細胞毒性物質(zhì)，以抗癌藥等藥物組 合物的形式使用。
[0277] 本發(fā)明的抗體可以使用識別GPR49的任意抗體。例如，優(yōu)選的抗體可以例示以下 (1)?（20)所述的抗體。這些抗體例如可以是全長抗體、小分子抗體、動物抗體、嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。
[0278] (1)抗體（2J18-1N)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0:5記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :6記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO : 7記載的氨基酸序列。
[0279] (2)抗體（2J18-1N)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :10 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO : 11記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :12記載的氨基酸序列。
[0280] (3)抗體，該抗體含有⑴所述的Η鏈和⑵所述的L鏈。
[0281] ⑷抗體（2U1E-1)，該抗體含有H鏈，所述H鏈具有作為CDR1的SEQIDN0:15記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID Ν0 :16記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :17記載的氨基酸序列。
[0282] (5)抗體（2U1E-1)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :20記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :21記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :22記載的氨基酸序列。
[0283] (6)抗體，該抗體含有（4)所述的Η鏈和（5)所述的L鏈。
[0284] (7)抗體（2U2E-2)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :25記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :26記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :27記載的氨基酸序列。
[0285] (8)抗體（2U2E-2)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :30記 載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID N0 :31記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :32記載的氨基酸序列。
[0286] (9)抗體，該抗體含有（7)所述的Η鏈和⑶所述的L鏈。
[0287] (10)抗體（2L13-3)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID NO :35 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :36記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :37記載的氨基酸序列。
[0288] (11)抗體（2L13-3)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :40 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :41記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :42記載的氨基酸序列。
[0289] (12)抗體，該抗體含有（10)所述的Η鏈和（11)所述的L鏈。
[0290] (13)抗體（2L36-12)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :45 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :46記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :47記載的氨基酸序列。
[0291] (14)抗體（2L36-12)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0:50 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :51記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :52記載的氨基酸序列。
[0292] (15)抗體，該抗體含有（13)所述的Η鏈和（14)所述的L鏈。
[0293] (16)抗體（2Τ15Ε-2)，該抗體含有Η鏈，所述Η鏈具有作為CDR1的SEQ ID Ν0 :66 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :67記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :68記載的氨基酸序列。
[0294] (17)抗體（2T15E-2)，該抗體含有L鏈，所述L鏈具有作為CDR1的SEQ ID N0 :71 記載的氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO :72記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO :73記載的氨基酸序列。
[0295] (18)抗體，該抗體含有（16)所述的Η鏈和（17)所述的L鏈。
[0296] (19)抗體，該抗體是在（1)?（18)中任一項所述的抗體中有1個或多個氨基酸被 取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗體，所得抗體與（1)?（18)中任一項所述的抗體具 有同等活性。
[0297] (20)抗體，該抗體與表位結(jié)合，所述表位與⑴?（18)中任一項所述的抗體所結(jié) 合的GPR49蛋白的表位相同。
[0298] 本發(fā)明中，與本發(fā)明的抗體具有同等活性是指，與GPR49的結(jié)合活性和/或?qū)Ρ磉_ GPR49的細胞的細胞毒活性同等。
[0299] 向多肽中導入突變的方法，是用于制備與某種多肽功能相同的多肽的、本 領域技術人員所熟知的方法之一。例如，本領域技術人員可采用位點特異性誘變法 (Hashimoto-Gotoh，Τ.等人·（1995)Genel52, 271-275、Zoller，MJ，和 Smith，Μ. (1983) Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer，W.等人·（1984)Nucleic Acids Res. 12， 9441-9456、Kramer W,和 Fritz HJ (1987)Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel, TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82,488-492, Kunkel (1988)Methods Enzymol. 85, 2763-2766)等，向本發(fā)明的抗體中導入適當?shù)耐蛔儯瑥亩梢灾苽渑c該抗體功能相同的抗 體。另外，氨基酸的突變在自然界中也可發(fā)生。如上所述，在本發(fā)明抗體的氨基酸序列中， 具有1個或多個氨基酸發(fā)生突變的氨基酸序列、且與該抗體功能相同的抗體也包含在本發(fā) 明的抗體中。
[0300] 上述突變體中，突變的氨基酸數(shù)目通常為50個氨基酸以內(nèi)，優(yōu)選為30個氨基酸以 內(nèi)，進一步優(yōu)選為10個氨基酸以內(nèi)（例如5個氨基酸以內(nèi)）。
[0301] 在突變的氨基酸殘基中，優(yōu)選突變成保存有氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的其它氨基酸。例 如，根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，確立以下分類：
[0302] 疏水性氨基酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V);
[0303] 親水性氨基酸（R、D、N、C、E、Q、G、Η、K、S、T);
[0304] 具有脂族側(cè)鏈的氨基酸（G、Α、V、L、I、Ρ);
[0305] 具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸（S、T、Y);
[0306] 具有含硫原子側(cè)鏈的氨基酸（C、M);
[0307] 具有含羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸（D、N、E、Q);
[0308] 具有含堿性側(cè)鏈的氨基酸（R、K、H);
[0309] 具有含芳族側(cè)鏈的氨基酸（H、F、Y、W)
[0310] (括號內(nèi)均表示氨基酸的單字母符號）。
[0311] 已知具有對某一氨基酸序列通過1個或多個氨基酸殘基的缺失、添加和/或 用其它氨基酸的取代進行修飾的氨基酸序列的多肽維持其生物學活性（Mark，D.F.等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81，5662-5666、Zoller，M. J.和 Smith，M.， Nucleic Acids Research (1982) 10,6487-6500、Wang，A.等人，Science224,1431-1433、 Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982) 79,6409-6413)。即，通常 構(gòu)成某多肽的氨基酸序列中，被分成各組的氨基酸在相互取代時，該多肽的活性得以保持 的可能性高。本發(fā)明中，將上述氨基酸組的組內(nèi)氨基酸間的取代稱作保守取代。
[0312] 本發(fā)明還提供與表位結(jié)合的抗體，所述表位與本發(fā)明所公開的抗GPR49抗體所結(jié) 合的表位相同。即，本發(fā)明涉及識別與2J18、2L13、2L36、2U1E、2U2E所識別的表位相同的表 位的抗體及其用途。上述抗體例如可以通過以下方法獲得。
[0313] 被檢抗體與某抗體共有表位，這可通過兩者對同一表位的競爭來確認?？贵w間的 競爭通過交叉阻斷測定等進行檢測。例如，競爭ELISA測定為優(yōu)選的交叉阻斷測定。
[0314] 具體而言，在交叉阻斷測定中，在候選的競爭抗體的存在或非存在下，預溫育包被 在微量板的孔上的GPR49蛋白，之后添加本發(fā)明的抗GPR49抗體。與孔中的GPR49蛋白結(jié) 合的本發(fā)明的抗GPR49抗體的量與對相同表位競爭性結(jié)合的候選競爭抗體（被檢抗體）的 結(jié)合能力間接相關。即，被檢抗體與相同表位的親和性越大，則本發(fā)明的抗GPR49抗體與包 被GPR49蛋白的孔的結(jié)合量越降低，而被檢抗體與包被GPR49蛋白的孔的結(jié)合量越增加。
[0315] 關于與孔結(jié)合的抗體量，通過預先標記抗體，可以容易地測定。例如，生物素標記 的抗體可通過使用抗生物素蛋白過氧化物酶綴合物和適當?shù)牡孜飦頊y定。將利用了過氧化 物酶等酶標記的交叉阻斷測定特別地稱作競爭ELISA測定。抗體可以用可檢測或可測定的 其它標記物標記。具體而言，放射標記或突光標記等是公知的。
[0316] 并且，當被檢抗體具有來自與本發(fā)明的抗GPR49抗體不同種的恒定區(qū)時，還可以 通過識別任一恒定區(qū)的標記抗體來測定與孔結(jié)合的任一種抗體。或者，即使是來自同種的 抗體，當類別（class)不同時，可以利用識別各類別的抗體測定與孔結(jié)合的抗體。
[0317] 與在候選競爭抗體非存在下實施的對照試驗中得到的結(jié)合活性相比，候選抗體可 以阻斷至少20%、優(yōu)選至少30%、進一步優(yōu)選至少50%的抗GPR49抗體的結(jié)合時，該候選競 爭抗體是與本發(fā)明的抗GPR49抗體實質(zhì)上結(jié)合在同一表位上、或者是競爭結(jié)合在同一表位 上的抗體。
[0318] 上述（4)?（6)中的任一種抗體所識別的表位的例子有：人GPR49蛋白（SEQ ID NO :1)的第517位氨基酸?第537位氨基酸的區(qū)。另外，上述（16)?（18)中的任一種抗 體所識別的表位的例子有：人GPR49蛋白（SEQ ID NO :1)的第510位氨基酸?第529位氨 基酸的區(qū)。
[0319] 藥物纟目合物
[0320] 從另一角度來看，本發(fā)明提供含有與GPR49蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的藥物 組合物。此外，本發(fā)明涉及含有與GPR49蛋白結(jié)合的抗體作為有效成分的細胞增殖抑制劑、 特別是抗癌藥。優(yōu)選將本發(fā)明的細胞增殖抑制劑和抗癌藥給予罹患癌癥的對象或有可能罹 患癌癥的對象。由于GPR49的表達水平在腦以外的正常細胞中非常低，而在癌細胞中亢進， 由此認為：通過給予抗GPR49抗體，可以得到癌細胞特異性的細胞毒作用。
[0321] 對本發(fā)明的藥物組合物（例如抗癌藥）中使用的抗GPR49抗體沒有特別限定，可 以是任何抗GPR49抗體，例如可以使用上述抗GPR49抗體。
[0322] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)：將GPR49蛋白切斷，分成60kDa和40kDa的片段，N末端側(cè)的 60kDa的片段被切斷后分泌到細胞外。因此，對本發(fā)明的藥物組合物中使用的抗GPR49抗體 沒有特別限定，但優(yōu)選其識別C末端側(cè)的40kDa的片段。C末端側(cè)的40kDa的片段的例子 有：包含SEQ ID N0 :1的第510位氨基酸?第907位氨基酸序列的片段等。
[0323] SEQ ID N0 :1的第510位氨基酸?第907位氨基酸序列中，胞外區(qū)形成第510位 氨基酸?第556位氨基酸的區(qū)、第615位氨基酸?第637位氨基酸的區(qū)、第704位氨基酸? 第722位氨基酸的區(qū)、第792位氨基酸?第800位氨基酸的區(qū)。因此，雖然沒有特別限定， 但識別這些區(qū)的抗體作為藥物組合物特別有用。
[0324] 本發(fā)明中，"含有與GPR49結(jié)合的抗體作為有效成分"是指，含有抗GPR49抗體作為 主要活性成分，并不限定抗GPR49抗體的含有率。
[0325] 當本發(fā)明的藥物組合物的治療對象疾病為癌癥時，對作為對象的癌癥沒有特別限 定，但優(yōu)選為胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤（例 如成膠質(zhì)細胞瘤），特別優(yōu)選胃癌。癌癥可以是原發(fā)病灶，也可以是轉(zhuǎn)移病灶。
[0326] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過口服、胃腸外給藥中的任一種途徑給予患者。優(yōu)選 為胃腸外給藥。所述給藥方法具體有：注射給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)肺給藥、經(jīng)皮給藥等。注射 給藥的例子有：例如可以通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等全身或局部 給予本發(fā)明的藥物組合物。還可以根據(jù)患者的年齡、癥狀選擇適當?shù)慕o藥方法。給藥量例 如可以在每次、每kg體重0. OOOlmg?lOOOmg的范圍內(nèi)選擇。或者，例如可以在每位患者 0. OOlmg?lOOOOOmg/個體的范圍內(nèi)選擇給藥量。但本發(fā)明的藥物組合物并不限于上述給 藥量。
[0327] 本發(fā)明的藥物組合物可以按照常規(guī)方法制成制劑（例如Remington ' s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U. S. A),可 以同時含有藥學上可接受的載體或添加劑。例如有表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、保存 劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。并 不限于這些，可以進一步適當使用其它常用的載體。載體具體有：輕質(zhì)硅酸酐、乳糖、結(jié)晶纖 維素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纖維素鈣、羧甲纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚 乙烯基縮醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫 化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽類等。
[0328] 本發(fā)明還提供：通過使GPR49表達細胞和與GPR49蛋白結(jié)合的抗體接觸，而在 GPR49表達細胞中引發(fā)毒性的方法或抑制細胞增殖的方法。
[0329] 對本發(fā)明的方法中使用的抗體沒有特別限定，例如可以使用上述抗體。抗GPR49 抗體所結(jié)合的細胞只要是表達GPR49的細胞即可，沒有特別限定。本發(fā)明中優(yōu)選的GPR49 表達細胞為癌細胞。更優(yōu)選為胃癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、 卵巢癌細胞、尤文肉瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（例如成膠質(zhì)細胞瘤細胞）。本發(fā)明的方法對上述 癌癥的原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶均適用。進一步優(yōu)選的癌細胞為原發(fā)性胃癌和轉(zhuǎn)移性胃癌的細 胞。
[0330] 本發(fā)明中，"接觸"例如可以通過向在試管內(nèi)培養(yǎng)的GPR49表達細胞的培養(yǎng)液中添 加抗體來進行。在本發(fā)明中，"接觸"還可以通過對將GPR49表達細胞移植到體內(nèi)的非人動 物、或具有內(nèi)源性表達GPR49的癌細胞的動物進行給藥來進行。
[0331] 作為評價或測定通過抗GPR49抗體的接觸在GPR49表達細胞中引發(fā)的細胞毒的方 法，優(yōu)選采用以下方法。在試管內(nèi)評價或測定該細胞毒活性的方法有：上述抗體依賴性細 胞介導的細胞毒（ADCC)活性、補體依賴性細胞毒（CDC)活性等的測定方法。抗GPR49抗體 是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，這可以利用公知方法來測定（例如Current protocols in Immunology,Chapter 7. Immunologic studies in humans,Editor,John E, Coligan等人，John Wiley&Sons，Inc. , (1993)等）。測定活性時，以具有與抗GPR49抗體 相同的同種型、但不具有該細胞毒活性的結(jié)合抗體作為對照抗體，與抗GPR49抗體同樣地 加以使用，根據(jù)抗GPR49抗體顯示出較對照抗體強的細胞毒活性，可以判定活性。
[0332] 抗體的同種型由該抗體的氨基酸序列的Η鏈恒定區(qū)的序列來規(guī)定。在機體內(nèi)，根 據(jù)產(chǎn)生抗體的Β細胞成熟時發(fā)生的染色體上的基因重組所產(chǎn)生的類別轉(zhuǎn)換，最終決定抗體 的同種型。同種型的不同反映在抗體的生理、病理性功能的不同。具體而言，例如已知細胞 毒活性的強度和抗原的表達量同時受抗體的同種型影響。因此，測定上述細胞毒活性時，用 作對照的抗體優(yōu)選使用與被檢抗體相同的同種型。
[0333] 此外，為了在機體內(nèi)評價或測定細胞毒活性，例如將表達GPR49的癌細胞移植到 非人被檢動物的皮內(nèi)或皮下，之后從當天或第二天起每天或間隔數(shù)天靜脈或腹腔內(nèi)給予被 檢抗體。通過每天測定腫瘤的大小，可以判定細胞毒活性。與試管內(nèi)的評價同樣，給予具有 相同同種型的對照抗體，根據(jù)抗GPR49抗體給藥組的腫瘤大小明顯小于對照抗體給藥組的 腫瘤大小，可以判定具有細胞毒活性。使用小鼠作為非人被檢動物時，可適當使用遺傳性缺 失胸腺從而缺失其Τ淋巴細胞的功能的裸小鼠（nu/nu)。通過使用該小鼠，在評價、測定給 予的抗體所產(chǎn)生的細胞毒活性時，可以排除被檢動物中T淋巴細胞的干預。
[0334] 本發(fā)明還提供癌癥的診斷方法，其特征在于：檢測GPR49蛋白或編碼GPR49蛋白 的基因。確認GPR49在各種癌組織或癌細胞株中明顯表達亢進，相對于此，在正常細胞中 GPR49的表達在除腦以外的臟器中非常低。因此，GPR49作為用于特異性檢測癌癥的標志物 是有用的。
[0335] 在本發(fā)明方法的一個方式中，通過檢測試樣中的GPR49蛋白來進行癌癥的診斷。 優(yōu)選檢測GPR49蛋白的胞外區(qū)。GPR49蛋白的檢測優(yōu)選使用識別GPR49蛋白的抗體來進行。
[0336] 作為本發(fā)明的診斷方法的具體例之一，可以列舉包括以下步驟的癌癥的診斷方 法。
[0337] (a)提供從受試者采集的試樣的步驟；
[0338] (b)使用與GPR49蛋白結(jié)合的抗體檢測采集的試樣中所含的GPR49蛋白的步驟。
[0339] 本發(fā)明中，檢測包括定量或定性的檢測。例如，定性檢測可以是下述測定：
[0340] 僅測定是否存在GPR49蛋白；
[0341] 測定是否存在一定量以上的GPR49蛋白；
[0342] 將GPR49蛋白的量與其它試樣（例如對照試樣等）進行比較的測定等。
[0343] 而定量檢測可以是：GPR49蛋白濃度的測定、GPR49蛋白量的測定等。
[0344] 本發(fā)明中的被檢試樣只要是可能含有GPR49蛋白的試樣即可，沒有特別限定。具 體優(yōu)選從哺乳類等生物的體內(nèi)采集的試樣。進一步優(yōu)選的試樣為從人體內(nèi)采集的試樣。被 檢試樣的具體例子可以例示如：血液、間質(zhì)液、血漿、血管外液、腦脊髓液、滑液、胸膜液、血 清、淋巴液、唾液、尿、組織、腹水、腹腔內(nèi)清洗液等。優(yōu)選的試樣為由下述被檢試樣得到的試 樣，所述被檢試樣為：將從生物體內(nèi)采集的組織或細胞固定而得到的標本或細胞的培養(yǎng)液 等。
[0345] 將GPR49蛋白切斷，分成約60kDa的N末端肽和約40kDa的C末端肽，N末端肽分 泌到血液中。因此，在本發(fā)明的診斷方法中，可以檢測切斷后的N末端肽或C末端肽。例如， 可以檢測血液或血清等試樣中所含的分泌的N末端肽。
[0346] 對根據(jù)本發(fā)明診斷的癌癥沒有特別限定，可以是任何癌癥。具體有肝細胞癌、肺 癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤（例如成膠質(zhì)細胞瘤）等。本發(fā)明中，對上述 癌癥的原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶均可診斷。本發(fā)明中，特別優(yōu)選的癌癥為原發(fā)性胃癌和轉(zhuǎn)移性 胃癌。
[0347] 本發(fā)明中，當在被檢試樣中檢測出蛋白時，以其水平為指標來診斷癌癥。具體而 言，與陰性對照或正常者相比，被檢試樣中檢測出的GPR49蛋白的量多時，顯示受試者患有 癌癥、或者將來罹患癌癥的可能性高。即，本發(fā)明涉及癌癥的診斷方法，該方法包括以下步 驟：
[0348] (1)檢測從受試者采集的生物樣品中GPR49的表達水平的步驟；知
[0349] (2)當⑴中檢測的GPR49的表達水平與對照相比高時，顯示受試者患有癌癥的步 驟。
[0350] 本發(fā)明中，對照是指作為比較基準的試樣，包括陰性對照和正常者的生物樣品。陰 性對照可以通過采集正常者的生物樣品，并根據(jù)需要進行混合而得到。對照的GPR49表達 水平可以和受試者的生物樣品中的GPR49表達水平同時檢測?；蛘?，可以預先檢測多名正 常者的生物樣品中的GPR49表達水平，再對正常者中的標準表達水平進行統(tǒng)計學判定。具 體而言，例如還可以使用平均值±2X標準偏差（S. D.)、或平均值±3X標準偏差（S. D.) 作為標準值。在統(tǒng)計學上，平均值±2X標準偏差（S.D.)包括80%的正常者的值，而平均 值±3X標準偏差（S.D.)包括90%的正常者的值。
[0351] 或者，可以利用R0C曲線設定對照中的GPR49的表達水平。R0C曲線（receiver operating characteristic curve;接收者操作特性曲線）是縱軸表示檢測靈敏度、橫軸 表示假陽性率（即"1-特異度"）的曲線圖。本發(fā)明中，當連續(xù)改變用于判定生物樣品中的 GPR49表達水平的基準值時，通過將靈敏度和假陽性率的變化作圖，可以得到ROC曲線。
[0352] 需要說明的是，用于得到R0C曲線的"基準值"，是為了進行統(tǒng)計學分析而暫時使 用的數(shù)值。用于得到R0C曲線的"基準值"通常在可以覆蓋可選擇的所有基準值的范圍內(nèi)連 續(xù)變化。例如可以使基準值在所分析的集團的GPR49測定值的最小值與最大值之間變化。
[0353] 基于所得的R0C曲線，可以選擇可以期待所需的檢測靈敏度以及精度的標準值。 根據(jù)R0C曲線等在統(tǒng)計學上設定的標準值也稱為截斷值（cut-off值）?；诮財嘀档陌?癥的檢測方法為：在上述步驟（2)中，將（1)中檢測的GPR49的表達水平與截斷值比較。而 且，當⑴中檢測的GPR49的表達水平比截斷值高時，表示受試者被檢測出癌癥。
[0354] 本發(fā)明中，GPR49的表達水平可以通過任意方法來確定。具體而言，通過評價 GPR49的mRNA的量、GPR49蛋白的量、以及GPR49蛋白的生物學活性，可以知道GPR49的表 達水平。GPR49的mRNA和蛋白的量可以通過本說明書中所述的方法來確定。
[0355] 本發(fā)明中，可以以表達GPR49蛋白的任意動物種作為受試者。例如已知黑 猩猩（Pan troglodytes)(ENSPTRG00000005223(XR_021586.1))、恒河猴（Macaca mulatta)(ENSMMUG00000020942)、小鼠 （Mus musculus)(ENSMUSG00000020140)、大鼠 (Rattus norvegicus)(ENSRN0G00000004221(L0C687868))、豚鼠 （Cavia porcellus) (ENSCP0G00000009492)、狗（Canis familiaris)(ENSCAFG00000000451)、貓（Felis caius) (ENSFCAG00000008064)、雞（Gallus gallus)(ENSGALG00000010163)等人以外的多種哺乳 類表達GPR49蛋白。因此，本發(fā)明中的受試者包括這些動物。特別適合的受試者是人。需 要說明的是，以人以外的動物作為受試者時，當然可以檢測該動物種的GPR49蛋白。
[0356] 對被檢試樣中所含的GPR49蛋白的檢測方法沒有特別限定，優(yōu)選通過使用抗 GPR49抗體的、以下例示的免疫學方法進行檢測：
[0357] 放射免疫測定（RIA);
[0358] 酶聯(lián)免疫測定（EIA);
[0359] 熒光免疫測定（FIA);
[0360] 發(fā)光免疫測定（LIA);
[0361] 免疫沉淀法（IP);
[0362] 免疫比濁法（ΤΙA);
[0363] 蛋白質(zhì)印跡法（WB);
[0364] 免疫組織化學法（IHC);以及
[0365] 免疫擴散法（SRID)。
[0366] 上述方法中，作為癌癥的診斷方法，免疫組織化學（IHC)法是優(yōu)選的免疫學測定 方法之一，該方法包括以下步驟：將從罹患癌癥的患者取得的組織或細胞固定在切片上，之 后檢測切片上的GPR49蛋白。免疫組織化學（IHC)法等上述免疫學方法為本領域技術人員 所公知。
[0367] S卩，GPR49是癌細胞中特異性表達增強的膜蛋白，因此利用抗GPR49抗體可以檢測 癌細胞或癌組織。通過上述免疫組織學分析，檢測從機體內(nèi)采集的細胞或組織中所含的癌 細胞。
[0368] 在另一優(yōu)選方式中，還可以利用抗GPR49抗體來檢測機體內(nèi)的癌組織。即，本發(fā) 明涉及癌癥的檢測方法，該方法包括：（1)給予受試者用放射性同位素等標記物標記的與 GPR49蛋白結(jié)合的抗體的步驟；以及（2)檢測上述標記物的累積的步驟。為了追蹤給予到機 體內(nèi)的抗體，可以標記抗體以能夠進行檢測。例如，可以追蹤用熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或放射 性同位素標記的抗體在機體內(nèi)的行為。用熒光物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)標記的抗體，可以使用內(nèi)視 鏡或腹腔鏡來觀察。至于放射性同位素，通過追蹤其放射活性，可以將抗體的定位圖像化。 本發(fā)明中，機體內(nèi)的抗GPR49抗體的定位表示癌細胞的存在。
[0369] 為了檢測機體內(nèi)的癌癥，標記抗體的放射性同位素可以使用正電子發(fā)射核素。例 如可以用 18F、55C〇、64Cu、66Ga、 68Ga、76Br、89Zr和1241這樣的正電子發(fā)射核素標記抗體。利用這 些正電子發(fā)射核素標記抗GPR49抗體時，可采用公知的方法（Acta Oncol. 32,825?830， 1993)。
[0370] 將用正電子發(fā)射核素標記的抗GPR49抗體給予人或動物后，使用PET (正電子斷層 攝影裝置）從體外計測該放射性核素放射的放射線，通過計算機層析成像的方法轉(zhuǎn)換為圖 像。PET是用于非侵襲性地獲得有關藥物的體內(nèi)行為等的數(shù)據(jù)的裝置。利用PET可以將放 射強度以信號強度的形式定量圖像化。通過按上述方式使用PET，無需從患者體內(nèi)采集試 樣，即可檢測在特定癌癥中高度表達的抗原分子。抗GPR49抗體除了用上述核素標記外，還 可以利用使用 nC、13N、150、18F、45Ti等正電子發(fā)射核素的短壽命核素進行放射標記。
[0371] 使用由醫(yī)療用回旋加速器得到的上述核素的短壽命核素的生產(chǎn)、短壽命放射標記 化合物的制備技術等相關研究開發(fā)得到推進。利用這些技術，可以用各種放射性同位素標 記抗GPR49抗體。給予患者的抗GPR49抗體，根據(jù)抗GPR49抗體對各部位的病理組織的特 異性而累積在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中?？笹PR49抗體用正電子發(fā)射核素標記時，檢測其放射活 性，從而根據(jù)放射活性的定位，檢測該原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的存在。用于該診斷用途時，可適當 使用25?4000keV的γ粒子或正電子放射量的活性值。另外，選擇適當?shù)暮怂亍⒃俅罅拷o 予時，也有望獲得治療效果。為了得到放射線產(chǎn)生的抗癌作用，可以使用給予70?700keV 的Y粒子或正電子放射量值的核素。
[0372] 在本發(fā)明方法的另一方式中，檢測GPR49的基因的表達。本發(fā)明中，對所檢測的基 因沒有特別限定，但優(yōu)選mRNA。本發(fā)明中，檢測包含定量或定性檢測。例如，定性檢測的例 子有：下述測定操作。
[0373] 僅測定是否存在GPR49mRNA ;
[0374] 測定是否存在一定量以上的GPR49mRNA ;
[0375] 將GPR49mRNA的量與其它試樣（例如對照試樣等）進行比較的測定等。
[0376] 而定量檢測可以是：GPR49mRNA濃度的測定、GPR49mRNA量的測定等。
[0377] 作為本發(fā)明中的被檢試樣，可以使用可能含有GPR49mRNA的任意試樣。優(yōu)選從哺 乳類等生物的體內(nèi)采集的試樣，進一步優(yōu)選為從人體內(nèi)采集的試樣。被檢試樣的具體例子 可以例示如：血液、間質(zhì)液、血漿、血管外液、腦脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、 尿、組織、腹水、腹腔內(nèi)清洗液等。本發(fā)明的被檢試樣還包括優(yōu)選的試樣、即由下述被檢試樣 得到的試樣，所述被檢試樣為將從生物體內(nèi)采集的組織或細胞固定而得到的標本或細胞的 培養(yǎng)液等。
[0378] 使用由將從生物體內(nèi)采集的組織或細胞固定而得到的標本或細胞的培養(yǎng)液等的、 從被檢試樣得到的試樣時，優(yōu)選采用原位雜交法。原位雜交法是作為確認細胞或組織內(nèi)是 否存在特定的DNA或RNA、或分布及其表達的強弱的方法而發(fā)展起來的。其原理是利用了 下述性質(zhì)：具有與細胞內(nèi)的特定核酸序列互補的核苷酸序列的探針核酸特異性地形成復合 體。通過預先將放射性同位素（RI)或抗原物質(zhì)（半抗原）等標記在該探針上，通過檢測該 標記，即可識別雜交的部位，因此原位雜交法被用于細胞內(nèi)DNA或RNA等的檢測等。作為探 針的標記，優(yōu)選使用利用RI進行的標記。作為進一步優(yōu)選的例子，可以使用利用了非放射 性物質(zhì)的生物素或洋地黃毒苷等的半抗原等的熒光標記。作為特別優(yōu)選的例子，采用利用 被稱作FISH的突光原位雜交（fluorescence in situ hibridization)進行的檢測法。
[0379] 對所要診斷的癌癥沒有特別限定。具體有胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前列腺 癌、卵巢癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤（例如成膠質(zhì)細胞瘤）等。本發(fā)明中，對上述癌癥的原發(fā)病灶和轉(zhuǎn) 移病灶均可診斷。
[0380] 本發(fā)明中，可以以表達GPR49蛋白的任意動物種作為受試者。例如已知小鼠、大 鼠、恒河猴、黑猩猩等人以外的多種哺乳類表達GPR49。特別適合的受試者是人。需要說明 的是，當以人以外的動物種作為受試者時，檢測該動物種的GPR49mRNA。
[0381] 以下給出檢測方法的具體方式。首先，由受試者制備試樣。然后，檢測該試樣中所 含的GPR49mRNA。本發(fā)明中，還可檢測由mRNA合成的cDNA。本發(fā)明中，在被檢試樣中檢測 出GPR49mRNA或編碼GPR49的cDNA時，判定可能患有癌癥。例如，與陰性對照或正常者相 t匕，在被檢試樣中檢測出的GPR49mRNA或編碼GPR49的cDNA的量多時，顯示受試者患有癌 癥、或者將來罹患癌癥的可能性大。
[0382] 檢測mRNA的方法是公知的。在本發(fā)明中，具體可以利用例如RNA印跡法、RT-PCR 法、DNA芯片法等。
[0383] 上述本發(fā)明的檢測方法，還可以使用各種自動檢查裝置自動進行。通過自動化，可 以在短時間內(nèi)檢查多個試樣。
[0384] 本發(fā)明還提供用于診斷癌癥的診斷試劑或試劑盒，所述診斷試劑或試劑盒含有用 于檢測被檢試樣中的GPR49蛋白的試劑。本發(fā)明的診斷試劑至少含有抗GPR49抗體。
[0385] 通過將本發(fā)明的癌癥診斷用試劑與用于檢測GPR49的其它要素組合，可以制成用 于診斷癌癥的試劑盒。即，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，該試劑盒含有：與GPR49結(jié) 合的抗體、和檢測該抗體與GPR49結(jié)合的試劑，還可以進一步含有對照試樣，所述對照試樣 包含含GPR49的生物樣品。本發(fā)明的試劑盒，還可以在試劑盒中附帶用于說明測定操作的 說明書。
[0386] 需要說明的是，本說明書中引用的所有在先技術文獻均作為參照而納入本說明書 中。
[0387] 實施例
[0388] 以下，利用實施例來進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術范圍并不受這些實 施例的限定。
[0389] [實施例11利用人外顯子1. 0ST芯片講行的GPR49mRNA表汰分析
[0390] 為了明確人GPR49mRNA在臨床癌癥、癌細胞株、各種正常臟器中的表達分布，使用 原本為了進行剪接變體分析而開發(fā)的人外顯子1. 0ST芯片（Affymetrix公司）進行表達分 析。利用人外顯子1. 0ST芯片進行表達分析的優(yōu)點在于：與基本上每個基因在3'側(cè)只有1 個探針組的、Affymetrix公司的現(xiàn)有表達芯片相比，在人外顯子L 0ST芯片中基因的每個 外顯子可設定至少1個探針組，所以使用本芯片對每個基因進行表達分析時，每個基因可 以得到多個探針組的表達數(shù)據(jù)，每個基因的表達數(shù)據(jù)的可靠性均有所提高。
[0391] 此次表達分析中，使用來自22例肺腺癌摘出組織的腫瘤部分、13例胃癌摘出組織 的腫瘤部分、5例尤文肉瘤組織的腫瘤部分、20例卵巢癌摘出組織的腫瘤部分、19種肺腺癌 細胞株、4種小細胞肺癌細胞株、16種胃癌細胞株、20種卵巢癌細胞株和71種正常組織（從 Clontech 公司、Ambion 公司、STRATAGENE 公司、Cell APPLICATIONS 公司、Panomics 公司、 CHEMIC0N 公司、BioChain Institute 公司購入）的總 RNA。
[0392] 對于所有臨床癌摘出組織（已取得知情同意）的腫瘤部分、正常部分和癌細胞株 (從 ATCC、JCRB、理研 BIOSOURCE CENTER CELL BANK 購入），使用 Trizol (Invitrogen)，按 照產(chǎn)品附錄的方法提取總RNA。
[0393] 使用1 μ g上述總RNA，根據(jù)GeneChip全轉(zhuǎn)錄物（WT)有義靶標記測定指南 (Affymetrix)進行基因表達分析實驗，人外顯子1. 0ST芯片數(shù)據(jù)的數(shù)值化使用Affymetrix 公司提供的exact(外顯子芯片計算工具）軟件來進行。
[0394] 存在21個相對于人外顯子1. 0ST芯片的人GPR49的核心探針組，其探針組ID 為 3422146、3422162、3422166、3422167、3422175、3422177、3422179、3422180、3422181、 3422182、3422189、3422191、3422194、3422195、3422197、3422198、3422199、3422200、 3422201。
[0395] 探針組ID3422201在正常組織中的表達數(shù)據(jù)見圖1，在胃癌細胞株、胃癌摘出組織 的腫瘤部分的表達數(shù)據(jù)見圖2,在尤文肉瘤、小細胞肺癌、肺腺癌摘出組織腫瘤部分的表達 數(shù)據(jù)見圖3,在卵巢癌細胞株、卵巢癌摘出組織的腫瘤部分的表達數(shù)據(jù)見圖4。
[0396] 由圖1?4可知：人GPR49轉(zhuǎn)錄物在正常組織中的表達僅限于間腦、延髓、末梢神 經(jīng)、骨骼肌、子宮、胎盤、胎兒大腸等中。而其在擔心藥物毒性的臟器、即肺、腎臟、肝臟、骨 髓、末梢血中的表達低，有望將副作用抑制在低水平。在癌組織中，觀察到其在胃癌、尤文肉 瘤、小細胞肺癌、肺腺癌、卵巢癌中高度表達，期待以人GPR49為靶的抗腫瘤藥對這些癌癥 有效。
[0397] [實施例21全長人GPR49表汰細朐的律立
[0398] 分別以NCBI檢索號NP_003658. 1(SEQ ID N0 :1(氨基酸序列））和 NM_003667. 2 (SEQ ID N0 :2 (核苷酸序列））為基礎，通過PCR法分離全長人GPR49cDNA，并 將其克隆到哺乳細胞表達用載體（pcDNA5/FRT/T0) (Invitrogen公司）中。pcDNA5/FRT/ T0是一種在雜交人CMV/Tet02啟動子下插入基因能夠誘導表達、且整合有新霉素耐性基因 作為耐藥性標志物的載體。再使用僅在四環(huán)素或多西環(huán)素存在下能夠進行表達誘導的表達 系統(tǒng)Flpln系統(tǒng)（Invitrogen公司），向293FlpIn T-Rex細胞中進行全長人GPR49cDNA的 基因?qū)?。向?]\^11(高糖）/10(%卩133/1004 8/1]1]^26〇(3；[11111(1鮮;[1：1'0區(qū)611公司）/154區(qū)/ ml殺稻癌素（Invitrogen公司）中培養(yǎng)的293FlpIn T-Rex細胞中導入表達載體時，使用 Fugene6 (Roche公司）。按照操作指南，同時進行表達Flp重組酶的pOG44載體和pcDNA5/ FRT/GPR49載體的基因?qū)?，?0μ g/mL潮霉素 B(Invitrogen公司）進行選擇，建立導入 了全長人GPR49基因的人GPR49誘導表達細胞株、B2、B4。在插入到表達載體中的GPR49基 因的N末端導入有HA標簽，所以利用抗HA抗體（Sigma公司）來檢測選擇細胞。
[0399] 使用BioRad GenePulser，向來自中國倉鼠卵巢的細胞、即DG44細胞株中導入基 因，得到HA-GPR49表達細胞株2B10。
[0400] 再構(gòu)建導入有GPR49基因的載體，將其用于DNA免疫。表達載體pMCN是一種在小 鼠 CMV啟動子（ACCESSION No. U68299)下插入基因能夠誘導表達、且整合有新霉素耐性基 因作為耐藥性標志物的載體。按照常規(guī)方法將GPR49基因克隆到pMCN中，由此制作作為 GPR49 表達載體的 pMCN-GPR49。
[0401] [實施例31通討DNA免疫講行的抗GPR49單克降抗體的制作
[0402] 利用基因槍粒子（GeneGun Particle)法向小鼠中導入基因，進行DNA免疫。該方 法按照BioRad公司的操作指南來進行。將1mm的金顆粒（BioRad公司）與pMCN-GPR49DNA 混合，包被在管內(nèi)部，由此制作DNA免疫用彈丸。對于6周齡雌性MRL/lpr小鼠，以 200-300psi的壓力，使用Helios基因槍（BioRad公司），將包被有pMCN-GPR49DNA的彈丸 打入腹部皮膚中，由此進行基因?qū)?。認為通過被導入到存在于皮膚中的角化細胞、郎格漢 斯細胞、真皮樹突細胞（dermal dendritic cell)中的基因表達GPR49蛋白，使這些細胞成 為抗原提示細胞（APC)，引起了免疫（Methods31，232-242 (2003) immunization with DNA through the skin)。以1周的間隔進行6次DNA免疫。最終免疫是指將表達GPR49的DG44 細胞株2B10的100萬個細胞用PBS稀釋后進行尾靜脈內(nèi)給藥。抗體效價的測定通過使用 2B10細胞的FACS分析來進行。比較已免疫的小鼠的血清與在2B10細胞的細胞膜表面上 表達的GPR49蛋白的反應。對反應性最高的小鼠進行最終免疫，將其用于細胞融合。最終 免疫的3天后，摘出該脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞P3-X63Ag8Ul (P3U1、從ATCC購入）混合， 達到2 : 1的比例。細胞融合通過緩慢加入PEG1500( 口 ；二?夕Μ 7夕'' 7 74 V夕公 司）來進行，制作雜交瘤細胞。通過小心加入RPMI1640培養(yǎng)基（GIBC0 BRL公司）來稀釋 PEG1500的濃度，之后通過離心操作除去PEG1500。接下來，將雜交瘤細胞懸浮于含有10% FBSUXHAT培養(yǎng)基添加劑（SIGMA公司）、0.5XBM-Condimed Η1雜交瘤克隆添加劑（口 ； 二?夕Μ 7夕'' y 74 V夕公司）的RPMI164〇培養(yǎng)基（以后記作HAT培養(yǎng)基）中，之后接 種在96孔培養(yǎng)板上，使達到200 μ L/孔。接種時的細胞濃度根據(jù)所用的P3U1細胞數(shù)目來 稀釋，將雜交瘤細胞在96孔培養(yǎng)板中、于37°C、5% C02中、在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)約1周。分 泌抗體到培養(yǎng)上清中的雜交瘤的篩選通過流式細胞術來進行。
[0403] [實施例41 sGPR49Fc的制各
[0404] 利用PCR擴增含有GPR49蛋白的第1-555位氨基酸的片段，之后構(gòu)建載體，使擴增 的片段與小鼠 IgG2a的Fc蛋白以融合蛋白的形式表達。將構(gòu)建的載體導入DG44細胞中，選 擇sGPR49Fc的融合蛋白能夠表達的細胞作為新霉素耐性株。大量培養(yǎng)所得的細胞株2D3， 之后回收培養(yǎng)上清，純化sGPR49Fc蛋白。將通過蛋白A柱以Fc融合蛋白的形式被親和純 化的sGPR49Fc蛋白供給蛋白免疫的抗原或雜交瘤的篩選抗原。
[0405] [實施例51利用sGPR49Fc蛋白免疫來制作抗GPR49抗體
[0406] 將50 μ g親和純化sGPR49Fc蛋白與弗氏完全佐劑混合，進行免疫，再將50 μ g二 次親和純化sGPR49Fc蛋白與弗氏不完全佐劑混合，將所得混合物通過皮下對小鼠進行免 疫以誘導抗體，對與GPR49蛋白的反應性最高的小鼠從尾靜脈注射25 μ g sGPR49Fc蛋白，3 天后供給細胞融合，如上操作來制備雜交瘤。
[0407] [實施例61利用FACS (流式細朐術）評價結(jié)合活件
[0408] 使用所得的雜交瘤，利用流式細胞術評價與人GPR49/DG44細胞（2B10)的結(jié)合。將 懸浮于FACS緩沖液（2 % FBS/PBS/0. 05 % NaN3)中的人GPR49表達細胞株用FACS緩沖液稀 釋至1 X 106個細胞/mL，之后按50 μ L/孔分別注入Falcon353910圓底96孔板中。向加入有 細胞的孔中加入稀釋至適當濃度的雜交瘤的培養(yǎng)上清，使之在冰上反應60分鐘。接下來， 用FACS緩沖液清洗細胞1次。向加入有細胞的孔中添加作為二次抗體的山羊F(aV )2片 段抗小鼠 IgG(H+L)-FITC (Beckman Coulter公司），之后使之在冰上反應30分鐘。反應后， 通過離心除去上清，之后將懸浮于100 μ L FACS緩沖液中的細胞供給流式細胞術。在流式 細胞術中使用FACS Calibur(夕卜> V今> 乂 >公司）。根據(jù)前向角散射（forward scatter)和側(cè)向角散射（side scatter)的斑點印跡在活細胞集團中設定閾值，選FL1的直 方圖，評價該集團中所含的細胞的結(jié)合活性。
[0409] 使雜交瘤的上清與作為誘導表達GPR49的DG44細胞的2B10、作為其母株的DG44 分別反應時，得到了與GPR49表達細胞發(fā)生特異性反應的雜交瘤。利用極限稀釋法將這 些孔的雜交瘤單克隆化。使用IsoStrip (注冊商標）小鼠單克隆抗體同種型試劑盒（口 ;二?夕Μ 7夕·' y 747 )分析各抗體的同種型。其結(jié)果，2J18-1N、2J18_3是IgM， 而 2L7-8、2L9-3、2L10-19、2L13-3、2L15-12、2L16-15、2L18-15、2L33-6、2L34-5、2L36-12、 2T4E-6、2T9E1#14、2T15E-2、2T42E-4、2T54-2、2T65-3、2T37-16、2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11 是 IgGl。擴大培養(yǎng)被單克隆化的雜交瘤，之后使用蛋白G柱，按照操作指南從培養(yǎng)上清中純化 抗體。至于IgM抗體，使用蛋白L柱按照操作指南進行純化。已純化的抗體通過DC蛋白測 定等進行蛋白定量。
[0410] [實施例71抗原某閔的克降
[0411] 對于顯示 ADCC 活性和 CDC 活性的 2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、 2T15E-2這6種雜交瘤，確定抗體可變區(qū)基因的序列。對于抗體的基因，使用從分別產(chǎn)生 抗 GPR49 抗體 2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、2T15E-2 的雜交瘤中提取的總 RNA，通過 RT-PCR 法進行擴增。以下，將各抗體 2J18-1N、2U1E-1、2U2E-2、2L13-3、2L36-12、 2T15E-2 的基因名稱簡記為 2J18、2UlE、2U2E、2L13、2L36、2T15E基因。使用RNeasyPlant Mini試劑盒（QIAGEN公司），從1X10 7個細胞的雜交瘤中提取總RNA。通過使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒（CL0NTECH公司），利用1 μ g總RNA構(gòu)建RACE文庫。作為IgM抗 體的2J18-1N使用與小鼠 IgM恒定區(qū)序列互補的合成寡核苷酸MHC-IgM(SEQ ID N0 :61 ; CCACCAGATTCTTATCAGACAGG)，其他抗體基因則使用與小鼠 IgGl恒定區(qū)序列互補的合成寡 核苷酸 MHC-IgGl(SEQ ID N0:62;GGGCCAGTGGATAGACAGATG)、或與小鼠 κ 鏈恒定區(qū)核苷酸 序列互補的合成寡核苷酸κ (SEQ ID NO :63 ;GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG)，從而擴增編碼該 雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的基因的5'末端側(cè)基因片段。在42°C下進行1小時30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄 反應。50μ L PCR溶液中含有5μ L10XAdvantage2PCR緩沖液、5μ L10X通用引物A Mix、 0· 2mM 的 dNTPs (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1 μ L Advantage2 聚合酶 Mix (以上由 CL0NTECH 公司制備）、2. 5μ L逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物、lOpmol合成寡核苷酸MHC-IgM、MHC-IgGl或κ。PCR 反應如下進行：在94°C的初溫下反應30秒后，重復94°C下5秒、72°C下3分鐘的反應循環(huán) 5次，接下來，重復94°C下5秒、70°C下10秒、72°C下3分鐘的反應循環(huán)5次，再重復94°C 下5秒、68°C下10秒、72°C下3分鐘的反應循環(huán)25次。最后，將反應產(chǎn)物在72°C下加熱7 分鐘。使用QIAquick凝膠提取試劑盒（QIAGEN公司制備），從瓊脂糖凝膠中純化各PCR產(chǎn) 物。之后，將該PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體（Promega公司制備）中，確定其核苷酸 序列。
[0412] 2J18的Η鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID NO :3、氨基酸序列見SEQ ID NO :4、L 鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID N0:8、氨基酸序列見SEQ ID N0:9。2J18的重鏈CDR1的 氨基酸序列見SEQ ID NO :5、重鏈CDR2的氨基酸序列見SEQ ID NO :6、重鏈CDR3的氨基酸 序列見SEQ ID N0:7、輕鏈CDR1的氨基酸序列見SEQ ID勵：10、輕鏈〇?2的氨基酸序列見 SEQIDN0:11、輕鏈CDR3的氨基酸序列見SEQIDN0:12。
[0413] 2U1E的Η鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID N0:13、氨基酸序列見SEQ ID N0:14、 L鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQIDN0:18、氨基酸序列見SEQIDN0:19。2U1E的重鏈CDR1 的氨基酸序列見SEQ ID NO :15、重鏈CDR2的氨基酸序列見SEQ ID NO :16、重鏈CDR3的氨 基酸序列見SEQ ID N0 :17、輕鏈CDR1的氨基酸序列見SEQ ID N0 :20、輕鏈CDR2的氨基酸 序列見SEQ ID N0 :21、輕鏈CDR3的氨基酸序列見SEQ ID N0 :22。
[0414] 2U2E的Η鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID NO :23、氨基酸序列見SEQ ID NO :24、 L鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQIDN0:28、氨基酸序列見SEQIDN0:29。2U2E的重鏈CDR1 的氨基酸序列見SEQ ID NO :25、重鏈CDR2的氨基酸序列見SEQ ID NO :26、重鏈CDR3的氨 基酸序列見SEQ ID NO :27、輕鏈CDR1的氨基酸序列見SEQ ID NO :30、輕鏈CDR2的氨基酸 序列見SEQ ID N0 :31、輕鏈CDR3的氨基酸序列見SEQ ID N0 :32。
[0415] 2L13的Η鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID NO :33、氨基酸序列見SEQ ID NO :34、 L鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQIDN0:38、氨基酸序列見SEQIDN0:39。2L13的重鏈CDR1 的氨基酸序列見SEQ ID NO :35、重鏈CDR2的氨基酸序列見SEQ ID NO :36、重鏈CDR3的氨 基酸序列見SEQ ID NO :37、輕鏈CDR1的氨基酸序列見SEQ ID NO :40、輕鏈CDR2的氨基酸 序列見SEQ ID N0 :41、輕鏈CDR3的氨基酸序列見SEQ ID N0 :42。
[0416] 2L36的Η鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID NO :43、氨基酸序列見SEQ ID NO :44、 L鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQIDN0:48、氨基酸序列見SEQIDN0:49。2L36的重鏈CDR1 的氨基酸序列見SEQ ID NO :45、重鏈CDR2的氨基酸序列見SEQ ID NO :46、重鏈CDR3的氨 基酸序列見SEQ ID N0 :47、輕鏈CDR1的氨基酸序列見SEQ ID N0 :50、輕鏈CDR2的氨基酸 序列見SEQ ID N0 :51、輕鏈CDR3的氨基酸序列見SEQ ID N0 :52。
[0417] 2T15E的Η鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID NO :64、氨基酸序列見SEQ ID NO: 65、L鏈可變區(qū)的核苷酸序列見SEQIDN0:69、氨基酸序列見SEQIDN0:70。2T54E的重鏈 CDR1的氨基酸序列見SEQ ID NO :66、重鏈CDR2的氨基酸序列見SEQ ID NO :67、重鏈CDR3 的氨基酸序列見SEQ ID NO :68、輕鏈CDR1的氨基酸序列見SEQ ID NO :71、輕鏈CDR2的氨 基酸序列見SEQ ID N0 :72、輕鏈CDR3的氨基酸序列見SEQ ID N0 :73。
[0418] 「實施例81 #用強制表汰細朐株的細朐破碎液講行的蛋白質(zhì)印跡分析
[0419] 使用HA-GPR49表達DG44細胞株2B10的細胞破碎液，篩選可進行蛋白質(zhì)印跡的抗 體時，在2U1E-1、2U2E-2、2U4E-11、2T15E-2、2T65_3等中，通過蛋白質(zhì)印跡法分析可以檢測 出預想為GPR49蛋白的分子量為100kDa的譜帶。為了確認所檢測出的100kDa的譜帶來自 人GPR49,通過蛋白質(zhì)印跡法分析與293細胞B2的非誘導時、誘導時的細胞破碎液的反應 性，所述293細胞B2表達通過多西環(huán)素可以誘導表達的HA-GPR49。結(jié)果見圖5。293、B2的 〇表示非誘導時的細胞破碎液，1和10表示表達誘導時的細胞破碎液。在利用單克隆抗體 2U2E-2進行的檢測中誘導表達的泳道上特異性地確認到100kDa的譜帶。該譜帶與利用HA 標簽檢測的HA-GPR49的譜帶、S卩100kDa的譜帶大小相同，由此斷定：單克隆抗體2U2E-2是 識別GPR49的抗體。
[0420] [實施例91利用siRNA確認識別抗體的抗原
[0421] 為了進一步確認lOOkDa的譜帶來自GPR49,通過轉(zhuǎn)柒siRNA來剔除GPR49的表 達，確認抗體所識別的譜帶消失。按照操作指南，將從Invitrogen公司購入的抗GPR49的 siRNA (Cat. No. 1299003) LGR5-HSS112507、LGR5-HSS112508、LGR5-HSS112509(以下簡記為 siRNA507、508、509)導入2B10細胞株或GPR49高度表達大腸癌細胞株、即LoVo細胞中，利 用蛋白質(zhì)印跡法分析其細胞破碎液。結(jié)果如圖6所示，在siRNA507、508、509這3種siRNA 中，發(fā)現(xiàn)在508、509中GPR49的相當于予想分子量lOOkDa蛋白的譜帶明顯消失，由此認為： lOOkDa的譜帶識別GPR49。
[0422] 并且，如圖6所示，2U1E-U2U2E-2的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了與由于siRNA 的導入而消失的lOOkDa蛋白的譜帶同時消失的新的譜帶。在抗體2U1E-1的檢測中，除 lOOkDa蛋白的譜帶外，發(fā)現(xiàn)約40kDa蛋白的譜帶也由于siRNA而消失。還發(fā)現(xiàn)：在抗體 2U2E-2的檢測中，除lOOkDa蛋白的譜帶外，約60kDa蛋白的譜帶也由于siRNA而消失。這 兩個譜帶的大小總計正好為全長l〇〇kDa，由此認為：GPR49蛋白在某處被切斷，生成60kDa、 40kDa的蛋白。另外，在作為大腸癌細胞株的LoVo細胞中也檢測到60kDa、40kDa的譜帶。
[0423] [實施例101利用免疫沉淀法檢測切斷片段
[0424] 為了確認通過蛋白質(zhì)印跡法檢測的40kDa蛋白、60kDa蛋白的譜帶的存在，使用 GPR49單克隆抗體進行免疫沉淀實驗。作為發(fā)生免疫沉淀的樣品，使用用NP40裂解緩沖液 (0· 5% NP40,50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，蛋白酶抑制劑 complete mini (Roche 公 司））增溶表達HA-GPR49的DG44細胞株2B10而制成的細胞破碎液。以BSA作為標準品， 通過DC蛋白測定來定量細胞破碎液中所含的蛋白量。向500yL含100μ g蛋白的細胞破 碎液中加入2yg抗體溶液，使之在4°C下反應1小時。再加入20yL蛋白A/G Plus瓊脂 糖（Santa Cruz公司），使之反應一夜。以1000 Xg的離心力離心1分鐘，使瓊脂糖珠粒 沉淀，用lmL PBS清洗2次，之后加入50 μ L2X SDS-樣品緩沖液，在60°C下保溫30分鐘， 從而洗脫與抗體結(jié)合的抗原。以1000Xg的離心力離心1分鐘，將所得上清中的15μ L供 給SDS-PAGE。利用submarine法轉(zhuǎn)錄到S U 7公司的Immobilon-P上，利用單克隆抗體 2U1E-U2U2E-2進行檢測。結(jié)果見圖7、圖8。如在2L13-3、2L36-12中發(fā)生免疫沉淀的樣品 流過的泳道中之所見，除lOOkDa的譜帶外，確實在2U1E-1中還可檢測到40kDa的譜帶、在 2U2E-2中還檢測到60kDa的譜帶，由此可知：GPR49除了以具有l(wèi)OOkDa的分子量的分子形 式存在外，還以具有顯示為約60kDa、約40kDa的大小的分子量的分子形式存在。圖7使用 作為二次抗體的 HRP 標記抗小鼠 IgG (H+L)抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司制備），圖8使用作為二次抗體的HRP標記抗小鼠 κ抗體（Southern Biotech公司制 備），以區(qū)別來自用于免疫沉淀的抗體的Η鏈的譜帶和60kDa的GPR49的譜帶。
[0425] 「實施例111 #用各種癌細朐株的細朐破碎液講行的蛋白質(zhì)印跡分析
[0426] 使用單克隆抗體2U2E-2檢測各種癌細胞株的細胞破碎液。如圖9所示，在大腸癌 細胞株LoVo、肝細胞癌株Alexander、H印G2、卵巢癌細胞株KURAM0CHI、0VSAH0、神經(jīng)膠質(zhì)瘤 U251中，GPR49蛋白的表達特別顯著地亢進。箭頭顯示100kDa、60kDa的GPR49蛋白的譜帶。 照片中的泳道顯示出樣品名稱，分別顯示大腸癌細胞株Lovo、胃癌細胞株NUGC-4、肝細胞 癌株Alexander、肝細胞癌株Η印G2、肝細胞癌株Huh6、卵巢癌細胞株KURAM0CHI、卵巢癌細 胞株OVSAHO、神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、中國倉鼠卵巢細胞DG44、HA-GPR49表達DG44細胞株2B10。
[0427] [實施例121抗GPR49單克降抗體的CDC活件的測定
[0428] 通過以產(chǎn)生細胞毒的細胞中7-AAD的攝入程度為指標，測定⑶C活性。
[0429] 使GPR49表達DG44細胞或DG44細胞與單克隆抗體以10μ g/mL的濃度在4°C下反 應 30 分鐘。接下來，添加幼兔補體（Baby Rabbit Complement) (CEDARLANE LABORATORIES 公司），使其最終濃度達到1%或5%，在37°C下繼續(xù)反應90分鐘。加入7-AAD(Beckman Coulter公司），使其最終濃度達到1 μ g/mL，之后在室溫下靜置10分鐘。之后，用FACS緩沖 液清洗細胞，然后用FACSCalibur分析產(chǎn)生細胞毒的細胞的比例。％ FL3的值表示用7-AAD 染色的、損傷細胞的比例，在表達HA-GPR49的DG44細胞中，利用抗GPR49抗體2J18-1N確認 到特異性補體依賴性細胞毒（complement-dependent cytotoxicity(Q)C))活性（圖10)。
[0430] [實施例1312 T18scFv_Fc表汰載體的構(gòu)律
[0431] 由于抗人GPR49單克隆抗體2J18是IgM，所以無法評價ADCC活性。于是，使抗體 基因以scFv-Fc的形式表達。對于如實施例7那樣克隆的2J18抗體基因，通過PCR擴增Η 鏈、L鏈的可變區(qū)，并經(jīng)由作為接頭的氨基酸GGGGS使之結(jié)合，之后連接小鼠的IgG2a的Η鏈 的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)、CH3區(qū)，制成以scFv-Fc形式表達的抗體分子。
[0432] 具體使用以下引物進行PCR。
[0433] KozakATG-2J18VH
[0434] GCGAATTCCACCATGGGATG(SEQ ID NO ：74)
[0435] 2J18VH-GS1
[0436] TGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAG(SEQ ID NO ：75)
[0437] GS1-2J18VL
[0438] GGTGGCGGTGGCTCACAGATTGTTCTCACCCAGTC(SEQ ID NO ：76)
[0439] 2J18VH-GS2
[0440] ACTCCCACCACCGCCTTTTATTTCCAATTTTGTCCCCG(SEQ ID NO ：77)
[0441] GS2-mIgG2a_ 鉸鏈
[0442] GGCGGTGGTGGGAGTGAGCCCAGAGGGCCCAC(SEQ ID NO ：78)
[0443] NX-mG2a-3
[0444] CTCTAGAGCGGCCGCTTATC(SEQ ID NO ：79)
[0445] 將其插入表達載體中，完成2J18scFV-FC表達載體的構(gòu)建。
[0446] [實施例14l2T18scFv_Fc蛋白的制各
[0447] 使2J18scFV-FC表達載體在293T細胞中一過性表達，使用蛋白G柱從其培養(yǎng)上 清中親和純化。將18 μ g質(zhì)粒DNA和54 μ L FugeneHD (Roche公司制備）一同在900yL 0pti-MEM(Invitorogen公司制備）中混合，靜置15分鐘，之后添加到200萬個在T75燒杯 中培養(yǎng)的293T細胞（從ATCC購入）細胞上，將基因?qū)爰毎?。?% C02培養(yǎng)箱中、37°C 下培養(yǎng)3天，之后回收培養(yǎng)上清，使用蛋白G柱，按照操作指南純化2J18scFV-Fc。
[0448] [實施例151人IgGl嵌合2L13抗體的制作
[0449] 對于如實施例7那樣克隆的抗人GPR49單克隆抗體2L13的抗體基因，通過PCR擴 增Η鏈、L鏈的可變區(qū)，之后將其與人IgGl的Η鏈恒定區(qū)、L鏈恒定區(qū)連接，以人IgGl嵌合分 子的形式插入表達載體中，使其能夠表達。所得載體基因?qū)氲酱笫蠊撬枇黾毎鸜B2/0 (從 八丁〇：購入）中，建立新霉素耐性株。在1^]\〇-1640/10%?85/50(^8/1^661^^丨(^116/青霉 素?鏈霉素存在下培養(yǎng)，使用蛋白A柱，按照操作指南從培養(yǎng)上清中純化人IgGl嵌合抗體。 將已純化的抗體2L13/YB供給ADCC活性的測定。
[0450] [實施例161抗GPR49單克降抗體的ADCC活件的測定
[0451] 利用鉻釋放法研究對抗人GPR49單克隆抗體中的GPR49強制表達DG44細胞2B10 的ADCC活性。將作為靶細胞的2B10用添加有鉻-51的培養(yǎng)液（CHO-S SFM Ildnvitrogen 公司制備））培養(yǎng)數(shù)小時，之后除去培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液清洗細胞，之后將懸浮于新的培養(yǎng)液 中的細胞添加到96孔圓底板中，使達到1 X 104個細胞/孔。接著，添加抗體，使最終濃度 達到1 μ g/mL、0. 1 μ g/mL，向各孔中的與靶細胞相比為約5倍量的效應細胞（NK-92(ATCC， CRL-2407)中添加強制表達含有小鼠 Fc-γ受體3(NM_010188)的胞外區(qū)和人γ鏈 (NM_004106)的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的嵌合蛋白的重組細胞（日本特愿2007-20155))，將板在 5% 0)2培養(yǎng)箱中、于37°C下靜置4小時。靜置后將板離心，從各孔中回收一定量的上清，使 用Y射線計數(shù)儀Wallacl480測定放射活性，使用下式求出特異性的鉻游離率（％)。
[0452] 特異性的鉻游離率（％ ) = (A-C) XKW(B-C)
[0453] 其中，A表示各孔中的放射活性，B表示以終濃度1% Nonidet P-40進行細胞溶解 后釋放到培養(yǎng)基中的放射活性平均值，C表示僅添加培養(yǎng)基時的放射活性平均值。
[0454] 其結(jié)果如圖11所示，在用于試驗的抗人GPR49單克隆抗體中，特別是2T54-2、 2T15E-2、2L13-3、2L36-12 和 2J18scFv-Fc 對人 GPR49 表達細胞 2B10 誘導非常強的 ADCC 活 性。此結(jié)果顯示：抗體治療對以人GPR49為靶的腫瘤非常有用。
[0455] 測定人IgGl嵌合抗體2L13/YB的ADCC活性時，使用與上述相同的2B10細胞作為 靶細胞，向與靶細胞相比為約5倍量的效應細胞（NK-92(ATCC，CRL-2407)中添加強制表達 人Fc-γ受體3(NM_000569)的重組細胞（日本特愿2007-20155))，將板在5% C02培養(yǎng)箱 中、于37°C下靜置4小時。靜置后將板離心，從各孔中回收一定量的上清，使用γ射線計 數(shù)儀Wallacl480測定放射活性，使用下式算出特異性的鉻游離率（％ )。其結(jié)果如圖11所 示，確認2L13/YB對人GPR49表達細胞產(chǎn)生非常高的ADCC活性。
[0456] [實施例171 #用了 Mab-ZaD的內(nèi)化所產(chǎn)牛的細朐殺傷效果
[0457] 使用結(jié)合有名為阜草毒蛋白的毒素的二次抗體、Mab-Zap (Advanced Targeting Systems公司制備）作為具有下述作用機理的抗體藥物的開發(fā)模型，評價對GPR49表達細 胞的殺傷能力，所述作用機理為：使毒素等與抗體結(jié)合，在細胞內(nèi)抗體與靶細胞結(jié)合后內(nèi)化 進入細胞內(nèi)，之后利用綴合毒素的作用殺傷靶細胞。細胞使用誘導表達HA-GPR49的M、未 誘導表達HA-GPR49的Μ細胞。每孔中加入100ng抗體和100ng Mab-Zap，在37°C、5% C02 培養(yǎng)箱中保溫3天，之后通過使用活細胞測定試劑SF(于力9 4 T 7々公司制備）的WST8 測定分析活細胞數(shù)。結(jié)果見圖12。除2T42E-4、2U2E-2、2U4E-11外，在所分析的抗體中均可 確認到細胞毒活性。
[0458] [實施例181GST融合蛋白的表汰和表位的分析
[0459] 構(gòu)建缺失突變體的GPR49表達載體，通過WB分析識別40kDa譜帶的2U1E-1，結(jié)果 表明：在第495-537位氨基酸中存在表位。于是，為了縮小范圍，作為GST融合蛋白，使第 495-537、495-516、510-529、517-537位的氨基酸與GST蛋白融合并表達。各GST融合蛋白 所含有的GPR49的氨基酸序列見圖13。結(jié)果如圖14所示，使用表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡法進 行分析，結(jié)果表明：2U1E-1以517-537的氨基酸區(qū)作為表位。另外，同樣進行識別40kDa的 2T15E-2抗體的表位分析時，在510-529的氨基酸區(qū)存在表位。該結(jié)果表明：通過切斷而產(chǎn) 生的40kDa的蛋白是含有至少直至第510位氨基酸的序列的分子。
[0460] [實施例191抗GPR49單克降抗體與小鼠 GPR49的反應件
[0461] 將小鼠 GPR49整合到表達載體中，使其在293T細胞中一過性表達，通過WB分析其 細胞破碎液時，如圖15所示，結(jié)果表明：其與小鼠的GPR49也發(fā)生反應。
[0462] [實施例201利用FACS(流式細朐術）評價結(jié)合活件
[0463] 利用流式細胞術分析抗體2T15E-2與人癌細胞株的反應性。將懸浮于FACS緩沖 液（2 % FBS/PBS/0. 05 % NaN3)中的人癌細胞株用FACS緩沖液稀釋至1 X 106個細胞/mL，之 后以50 μ L/孔分別注入Falcon353910圓底96孔板中。加入濃度稀釋至10 μ g/mL的抗體 2T15E-2,使之在冰上反應60分鐘。接下來，用FACS緩沖液清洗細胞1次。向加入有細胞 的孔中加入作為二次抗體的山羊F(at/ )2片段抗小鼠 IgG(FcY)-FITC(Beckman Coulter 公司），之后使之在冰上反應30分鐘。反應后，通過離心除去上清，之后將懸浮于100 μ L 含有PI (碘化丙錠）的FACS緩沖液中的細胞供給流式細胞術。在流式細胞術中使用FACS Calibur(夕卜v r 4 v y V公司）。根據(jù)前向角散射（forward scatter)和側(cè)向角 散射（side scatter)的斑點印跡在活細胞集團中設定閾值，取FL1的直方圖，評價該集團 中所含的細胞的結(jié)合活性。
[0464] 在使用卵巢癌細胞株0VSAH0、肝癌細胞株Alexander、胃癌細胞株NUGC-4的流式 細胞術分析中，與不含一次抗體的峰相比，觀察到明顯的峰的移動，由此可知：在這些細胞 株中GPR49分子存在于細胞膜上（圖16)。以實線表示的峰顯示與癌細胞株的反應性，陰影 部分則表示在沒有抗體的情況下進行反應時的峰。橫軸顯示結(jié)合有FITC的抗體的結(jié)合度 所產(chǎn)生的信號的強度，縱軸顯示細胞數(shù)。
[0465] 產(chǎn)業(yè)實用性
[0466] 本發(fā)明的GPR49蛋白特異性抗體可以用作胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前列腺 癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的診斷藥。本發(fā)明的診斷藥對原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥的 診斷有用。具體而言，通過檢測從患者采集的生物樣品中所含的GPR49蛋白，可以判定癌癥 的可能性?；蛘?，通過檢測機體內(nèi)的GPR49表達細胞的定位，可以檢測機體內(nèi)胃癌、大腸癌、 肝細胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的存在。
[0467] 另外，本發(fā)明的具有細胞毒活性的抗GPR49抗體對治療或預防表達GPR49蛋白的 癌癥有用。具體而言，根據(jù)本發(fā)明，提供胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤 文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等各種癌細胞的細胞毒性劑或細胞增殖抑制劑。本發(fā)明的癌細胞的細 胞毒性劑或細胞增殖抑制劑還可適用于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的任一種癌。
[0468] 并且，本發(fā)明的具有細胞毒活性的抗GPR49抗體可以用作胃癌、大腸癌、肝細胞 癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等各種癌癥的治療藥。本發(fā)明中，抗 GPR49抗體還可用作原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的任一種癌癥的治療藥。
[0469] 此外，編碼本發(fā)明的抗體的基因和通過該基因轉(zhuǎn)化的重組細胞可用于制作發(fā)揮上 述效果或更佳效果的重組抗體。
[0001] CPCH1462138D 序 歹? 表_ <110〉株式會社未來創(chuàng)藥研究所 <120〉使用抗GPR49抗體的癌癥的診斷和治療 <130> C1-AD71IP <150> JP 2007 295341 <151> 2007-11-14 <160> 79 <170> Patentin version 3.4 <210> 1 <211> 907 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Thr Ser Arg Leu Gly Val Leu Leu Ser Leu Pro ￥al Leu Leu 1 δ 10 15 Gin Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ser Pro Arg Ser Gly Val Leu Leu Arg 20 25 30 Gly Cys Pro Thr His Cys His Cys Glu Pro Asp Gly Arg Met Leu Leu 35 40 45 Arg Val Asp Cys Ser Asp Leu Gly Lou Set* Glu Leu Pro Ser Asn Leu 50 55 60 Ser Val Phe Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn lie Ser Gin 65 70 75 80 Leu Leu Pro Asn Pro Leu Pro Ser Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu x^rg 85 90 95 Leu Ala Gly Asn Ala Leu Thr Tyr lie Pro Lys Gly Ala Phe Thr Gly 100 105 110
[0002] Leu Tyr Ser Leii Lys Val Leu Met Leu Gin Asn Asn Gin Leu Arg His 115 120 125 Val Pro Thr Glu Ala Leu Gin Asn Leu Arg Ser Leu Gin Ser Leu x^rg 130 135 140 Leu Asp Ala Asn His lie Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser G1y 145 150 155 160 Leu His Ser Iahi Arg His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Lon Thr Glu 165 170 175 lie Pro Val Gin Ala Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gin Ala Met Thr 180 185 190 Leu Ala Leu Asn Lys lie His His lie Pro Asp Tyr Ala Phe Gly ksn 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Va-l Val Leu His Leu His Asn Asn Arg lie His Ser 210 215 220 Leu Gly Lys Lys Cys Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp 225 230 23d 240 Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala lie Arg Thr Leu 245 250 255 Ser Asn Leu Lys Glu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn lie Arg Ser lie 260 285 270 Pro Glu Lys Ala Phe Val Gly Asn Pro Ser Leu lie Thr lie His Phe 275 280 285 Tyr Asp Asn Pro Lie Gin Phe Val Gly Arg Ser Ala Phe Gin His Leu 290 295 300
[0003] Pro Glu Leu Arg Thr Leu Thr Leu Asu Gly Ala Ser Gin He Thr Glu 305 310 315 320 Phe Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ala Asn Leu Glu Ser Leu Thr Leu Thr 325 330 335 Gly Ala Gin He Ser Ser Leu Pro Glii Thr ￥al Cys Asn Gin Leu Pro 340 345 350 Asn Leu Gin Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Glu Asp Leu Pro 355 360 365 Ser Fhe Sat' ￥ai Cys Gin Lys Leu Gin Lys lie Asp Leu Arg His Asn 370 375 380 Glu lie iyr Glu lie Lys Vai Asp 1 hr rhe Gin Gin Leu Leu Scr Leu 385 390 395 400 Arg Ser Leu Asn Leu Ala Trp Asn Lys lie Ala lie lie Ilis Pro Asn 405 410 415 Ala Phe Ser Thr Leu Pro Ser Leu lie Lys Leu Asp Leu Ser Ser Asn 420 425 430 Leu i.eu Ser Ser Phe Pro lie Thr Gly l.eu His Gly I.eu Thr His Leu 435 440 445 Lys Leu Thr Gly Asn His Ala Leu Gin Ser Leu lie Ser Ser Glu Asn 450 455 460 Phe Pro Glu Leu Lys Val lie Glu Met Pro Tyr Ala Tyr Gin Cys Cys 466 470 475 480 Ala Phe Gly Val Cys Glu Asn Ala Tyr Lys He Ser Asn Gin Trp Asn 485 490 495 Lys Gly Asp Asn Ser Ser Met Asp Asp Leo His Lys Lys Asp Ala Gly
[0004] 500 505 510 Met Phe Gin Ala Gin Asp Glu Arg Asp Leu Glu Asp Phe Leu Leu Asp 515 520 525 Phe Giu Glu Asp Leu Lys Ala Leu His Ser Vai Gin Cys Sar Pro Ser 530 535 540 Pro Gly Pro Phe Lys Pro Cys Glu His Leu Leu Asp Gly Trp Leu lie 545 550 555 560 Arg Tie Gly Val Trp Thr lie Ala ￥al Leu Ala Leu Thr Cys Asn Ala 565 570 575 Leu Val Thr Ser Thr Val Phe Arg Ser Pro I.eu Tyr Lie Ser Pro lie 580 585 590 I.ys Leu Leu lie Gly Val He Ala Ala Val Asn Met Lou Thr Gly Val 595 600 805 Ser Ser Ala Val Leu Ala Gly Val Asp Ala Phe Thr Phe Gly Ser Phe 610 615 620 Ala Arg His Gly Ala Trp Trp Glu Asn Gly ￥al Gly Cys His Yal lie 625 630 635 640 Gly rhe Leu ber lie Fhe Ma ber Wu ber her Val rhe Leu Leu Ihr 645 650 655 Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gly Phe Ser Val Lys Tyr Ser Ala Lys Phe 660 665 670 Glu Thr Lys Ala Pro Phe Ser Ser Leu Lys Val lie lie Leu Leu Cys 675 680 685 Ala Leu Leu Ala Leu Thr Met Ala Ala Val Pro Leu Leu Gly Gly Ser 690 695 700
[0005] Lys Tyr Gly Ala Ser Pro Leu Cys Leu Pro Leu F5ro Phe Gly Glu Pro 705 710 715 720 Ser T'hr Met Gly Tyr Met Val Ala Leu lie Leu Leo Asn Ser Leu Cys 725 730 735 Phe Leu Met Met Thr lie Ala Tyr Thr Lys Leu Tyr C}rs Asn Leu Asp 740 745 750 Lys Gly Asp Iahi Glu Ash lie Trp Asp Cys Ser Met Val Lys His He 755 760 765 Ala Leu Leu Leu Phe Thr Asn Cys lie Leu Asn Cys Pro Val Ala Phe 770 775 780 Leu Ser Phe Ser Ser Leu lie Asn Leu Thr Phe lie Ser Pro Glu Val 785 790 795 800 lie Lys Phe lie Leu Leu Val Val Val Pro Leu Pro Ala Cys Leu Asn 805 810 815 Pro Leu Leu Tyr lie Leu Phe Asn Pro His Phe Lys Glu Asp Leu Val 820 825 830 Ser Leu Arg Lys Gin Thr Tyr Val Trp Thr Arg Ser Lys Ilis Pro Ser 835 840 845 Leu Met Ser He Asn Ser Asp Asp Val Glu Lys Gin Ser Cys Asp Ser 850 855 860 Thr Gin Ala Leu Val Thr Phe Thr Ser Ser Ser He Thr Tyr Asp Leu 865 870 875 880 Pro Pro Ser Ser Val Pro Ser Pro Ala Tyr Pro Val Thr Glu Ser C\s 885 890 895
[0006] His Leu Ser Ser Val Ala Phe Val Pro Cys Leu 900 905 <210> 2 <2i：l> 2880 <212/ DNA <213> Homo sapiens <400> 2 t:.gctgctctc cgceegegtc eggctcgtgg ccccctaett cgggcaccat ggacacctcc 60 cggct.cgglg tgct.cetgtc citgcclglg ctgctgcagc tggcgaccgg gggcagctct 120 cccaggtotg gtgtgttgct gaggggctgc cccacaeact gtcattgcga gcccgacggc 180 aggatgttgc tcagggt-gga ctgctccgac ctggggctct cggagctgcc ttccaacctc 210 agcgtcttca cctc-ctacct agacctcagt a.tgaacaaca tcagtcagct gctcccgaat 300 cccctgccca gtctccgctt cctggaggag ttacgtcttg cgggaaacgc tctgacatac 360 at-tcccaagg gagcattcae t.ggcctttac agtcttaaag ttcttatgct gcagaataat 120 cagctaagac ar-gtacocae agaagetctg cagaatttgc gaagcettca atccctgcgt 480 ctggatgcta aecacatoag ctatgtgccc ccaagctgtt tcagtggcct gcattccctg 540 aggcacctgt ggctggatga caatgegtta acagaaatec ccgtccaggc ttttagaagt 600 ttateggcat tgcaagceat gaoettggcc ctgaacaaaa tacaccacat accagactat 660 gcctttggaa acctctccag cttggtagtt ctacatctcc ataacaatag aatccactcc 720 ctgggaaaga aatgcttt-ga tgggctccac agcctagaga ctttagattt aaattacaat 780 aaccttgatg aattecccac tgcaattagg acactctcca accttaaaga actaggattt 840
[0007] catageaaca atatcaggtc gatacctgag aaagcatttg taggcaaccc ttctcttatt 900 acaatacatt. tctatgacaa tcccatccaa tttgttggga gatctgcttt tcaacattta 960 ccl.gaac1aa gaacac1gac telgaalggt gccIcacaaa taactgaatt tcetgattta 1020 actggaactg caaacctgga gagtctgact ttaactggag cacagatctc atctcttcct 1080 caaaccgtct gcaatcagtt acct.aatctc caagtgctag atctgtctta caacctatta 1140 gaagatttac ccagtttttc agt.ctgccaa aagcttcaga Maitgacct aagacataa^ 1200 gaaatctacg aaattaaagt tgaeactttc1 cageagttgc ttagcctccg atcgctgaat 1260 tl:.ggcl:.igga acaaaa.ttge tatlattcac cceaatgcat 11 tccaeitt gccatcccia 1320 ataaagctgg acctat:cgtc eaacetcctg tr.gtcttttc ciat.aact.gg gttaratggt 1380 ttaactcact taaaattaac aggaaatcat gccttacaga gettgatatc atctgaaaac 1440 tttccagaac tcaaggttat agaaatgoct tatgcttacc agtgctgtgc atttggagtg 1500 tgtgagaatg cctataagat ttctaatcaa tggaataaag gtgacaacag cagtatggac 1560 gacctt.cata agaaagatgc tggaatgttt caggctcaag atgaacgtga ccttgaagat 1620 ttcctgcttg actttgagga agacctgaaa gcccttcatt cagtgcagtg ttcaccttcc 1680 ccaggccccl tcaaaccctg f gaaeacctg cttgatggci ggctgateag aat tggagtg 1740 t-ggaecatag cagitctggc aettactigl aatgetttgg t gact;tca-<ic ag111teaga. i 800 tcccctctgt aoatttcccc cattaaactg ttaattgggg tcatcgcagc agtgaacatg 1860 ctcacgggag tctccagtgc cgtgctggct ggtgtggatg cgttcactt.t tggcagcttt 1920
[0008] gcacgacatg gtgcctggtg ggagaatggg gttggttgcc atgtcattgg ttttttgtcc 1980 atttttgctt cagaatcatc tgttttcctg cttactctgg cagccctgga gcgtgggttc 2040 tc.tgtgaaat airtctgc.aaa att.tgaaacg aaagctccat tttctagcct gaaa.gtaatc 2100 attttgctct gtgccctgct ggccttgacc atggccgcag ttcccctgct gggtggca.gc 2160 aagta.tggcg cctcccctct ctgcctgcct ttgccttttg gggagcccag caccatgggc 2220 tacatggtcg ctctcatctt getcaattcc etttgcttcc t cat gat gac < 11 go c t a c 2280 accaagctct actgcaattt ggacaaggga gacctggaga alal-ttggga ctgctctatg 2340 gtaaaacaca ttgccctgtt gctcttcacc aactgcatcc taaactgccc tgtggctttc 2400 ttgtccttct cctcirttaat aaacct.t.aca tttatcagtc ctgaegta^at taagtttatc 2460 cttctggtgg tagtcccact tcctgcatgt ctcaatcccc ttctctacat cltgttcaal 2520 cctcacttta a.ggaggatct ggtgagcctg agaaagcaaa cctacgtctg gacaagatca 2580 aaacaceeaa gettgatgtc aattaaetct gatgatgtcg aaaaacagtc ctgtgactca 2640 actcaagcct- tggtaacctt taccagctcc agcatcactt atgacctgcc tcccagttcc 2700 gtgccatcac cagcttatcc agtgactgag agctgccatc tttcctctgt ggcatttgtc 2760 r \ ? I i /*> I ΓΛ O I T ΓΛ A O I A -- O fT^T Ο Ο Ο Ο ?* Γτ4 4 ^ A' Ο /"T f't I 4 (? Ο (? Ο O /? ? -- Ο Ο Ο Ο T ΓΤ T */ >< ( 1 OOd Lg LC LL- L d.c±l Ld.clla.Lg, Lg?a<lgg<ad,cla> Lg L L L LOcicla, gg, L Lgclg<xa.G L· b^<x〇.d.d. Lg L ?〇Δ\) gagattgagt atatcagagc agtaattaat aagaagagct gaggtgaaac tcggtttaaa 2880 <210> 3 <211> 354 <212> DNA <213> 小家鼠
[0009] <400> 3 ga.ggtGcagc t.gcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggattc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta. cacattcact gactactaca. tggactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat att-tatccta acaatggtgg tacta'gcta'c 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct. attactgtgc aagaccatac 300 tatagtaact cgtttgctta clggggccaa gggaclctgg tcactgletc tgea 354 <210〉 4 <211> 118 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 4 Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Tyr lie Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
[0010] Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 5 <211> δ <2I2> PRT <213> 小家鼠 <400> 5 Asp Tyr Tyr Met Asp i 5 <210> 6 <21i> 17 <212> PRT <213〉小家鼠 <400〉 6 Tyr lie Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15 Gly <210> 7 <211〉 9
[0011] <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 7 Pro Tyr Tyr Ser Asn Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 8 <211> 324 <212> DM <213〉小家鼠 <400> 8 cagattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gggccagcte aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatctt. cceceaaaet etgga.tttat agcaeatcca acctggct.tc agga.gtccca 180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactcte tcacaatcag c'aglgtggag 240 gctgaggatg ctgccactta ttactgccag cagtatgata gttccccatt cacgttcggc 300 acggggacaa. aattggaaat aaaa 324 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 9 Gin Tie Val Len Thr Gin Ser Pro Ala Tie Met Ser Ala Ser f3ro Gly 1 5 10 15
[0012] Glu Lys ￥al Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser ￥al Ser Ser Ser 20 2o 30 Tyr Leu Ilis Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala. Glu As]〕Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Ser Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 10 <211> 12 <212> HRT <213〉小家鼠 <400> 10 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> FRT <213〉小家鼠 <400> 11
[0013] Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210〉 12 <211> 9 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 12 Gin Gin Tyr Asp Ser Ser Pro Phe Thr 1 o <210> 13 <211〉 360 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 13 caggtccagc tgcagcagcc tggggctgaa ctggtggagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactata tgtactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gr-ct-t:gagtg gattgggggg attaatccta acaatggtgg tactaacttc 180 aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 at.gcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aggaatctac 300 tataggtaca actggcacit cggtgtcLgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 14 <211> 120
[0014] <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400〉 14 GJrs Val Glri Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu VaJ. Glu Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glv Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Gly He Asn Pro Asn Asn Glv Glv Thr Asn F^he Asn Glu I.ys F-^he 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Gly lie Tyr Tyr Arg Tyr Asn Trp His Phe Gly Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Tlir Val Tlir Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211〉 5 <212> PRT <2i3> 小家鼠 <400> 15
[0015] Asn Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 16 <211> 17 <212； PRT <213> 小家鼠 <400> 16 Gly lie Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Sei <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 17 lie T'yr Tyr Ai'g Tyr Asn Trp His Phe Gly ￥al 1 5 10 <210> 18 <211> 336 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 18 gatgttf tgo. tgacccaaac t.ccactclcc ctgcctgTca glct tggaga tcaggcctcc 60
[0016] atctcttgca gatctagtca gaccattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgeaga 腿ecaggcoa gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc c盼ccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac arfraagatc 240 tacagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tggacattcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 19 Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15 Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Thr lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Scr Asn Arg Phc Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Tyr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly He Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 Ser His Vai Fro Trp Thr Pile Gly Gly Giy Tlir Lys Leu Glu lie Ljs
[0017] 100 105 110 <210> 20 <2Π > 16 <212> FRT <213〉小家鼠 <400> 20 Arg Ser Ser Gin Thr lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 21 <21I> 7 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 21 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 22 Pile Gin Gly Ser Ifis Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 23
[0018] <211> 342 <212〉DM <213〉小家鼠 <400> 23 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgca.g cctctggatt cattttcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagatt 120 ccaga.gaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtcctg atgg言aacac cttctatcca 180 gacagtctga. agggccgatt caccatctcc agagataatg tcaggaacat cctgtacctg 240 cagatgagca gtctcaggtc tgaggaeacg gecatgtatt actgtgca.gt tactgggacg 300 tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtatctg ga 342 <210> 24 <211> 114 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 24 Glu ￥al Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu ￥al Lys Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ale Ser Gly Phe lie Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin lie Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser lie Ser Pro Asp Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Leu Lys 50 55 60
[0019] Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn lie Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gin Mot Sor Ser l.eu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Val Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr ￥al 100 105 110 Ser Gly <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 25 Thr Tyr AJa ^ef Ser 丄 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 26 Ser lie Ser Pro Asp Gly Asn Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 6
[0020] <212> PRT <213> 小家鼠 <400〉 27 Thr Gly Thr Phe Ala Tyr 1 5 <210> 28 <211> 336 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 28 gatgttttga tgaeccaaac tccactctcc ctacctgtca gtcttggaga tcaagcetcc 60 atctcttgca gatctagtca gaacattcta catagtgatg gaaacaccta tttagagtgg 120 tttctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct t.caaaatt.tc caaccgattt 180 cdggggtcc cagacaggit cagtggcagt ggatcaggga cagattteae actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tactactgct ttcaaagttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <2〗3>小瘃鼠 <400> 29 Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Lcni Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
[0021] Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn lie Leu His Ser 20 2o 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu lie Phe Lys lie Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 16 <212> HRT <213〉小家鼠 <400> 30 Arg Ser Ser Gin Asn lie Leu His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15 <210> 31 <211> 7 <212> FRT <213〉小家鼠
[0022] <400> 31 Lys He Ser Asn Arg Pile Pro 1 δ <2i0> 32 <211> 9 <212〉 PRT <213>小家鼠 <400> 32 Phe Gin Ser Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 33 <211〉 348 <212> DNA <213〉小家鼠 <400 33 caggtecagc tgeagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggaottc agtgaagatg 60 toctgcaagg ctgctggata caccttcact aactcctgga taggttgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gr-ct.tgagtg gattggagat atttaocctg gaggt.gat.t.a tactaactac 180 aatgagaaat tcaagggcaa ggccacactg actgca.gaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac gctgccatct attactgtac aagaggtgat 300 ggttactttg a.ctactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210 34 <211> 116
[0023] <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 34 Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser GJy Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser 20 25 30 Trp lie Gly Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Ilis Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Asp lie Tyr Pro G：ly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu I.ys Phe 50 55 60 Lys Gly l,ys Ala TItr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211〉 5 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 35
[0024] Asn Ser Trp lie Gly 1 5 <210> 36 <211> 17 <212； PRT <213> 小家鼠 <400> 36 Asp lie Tyr Ρχ-〇 Gly Glv Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 37 Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 38 gacaivtgtga tgacccaglc tcacaaaitc at.giccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
[0025] atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt attga.tgtag cctggtatca acaga'gacca 120 ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtatactgg agtocctgat 180 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccgtcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgteagcaa cattatagta. ctcctcogac gttcggtgga 300 ggcaocaagc tggaaatcaa. a. 321 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213〉 小家鼠 <400> 39 Asp lie Val Met Thr Gin Ser Ilis Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Set He Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser lie Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 5B 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val Ser Ser ￥al Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys GJji Gin His Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
[0026] 100 105 <210> 40 <211〉 11 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 40 Lys Ala Ser Gin Asp ￥al Ser lie Asp Val Ala 1 5 10 <210> 41 <211〉 7 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 41 Ser Ala Ser Tyr Arg Tjr Thr 1 5 <210> 42 <2il> 9 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 42 Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 43
[0027] <2Π > 357 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 43 caggiccagc tgcagcagie tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgaaggtg 80 tcc'tgcaagg cttctggata cgacttcact aattacttga tagagtgggt a'aatcagagg 1L0 cct.ggacagg gccttgagtg gattggagtg attaatcctg gaagtggtgg tactaactac 180 aatgagaagl tcaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240 atgcagetca gcagcctga_c atctgatgac tctgcggtct atetctgtgc aagatattcc 300 ccgtalggla aciaclilga etactggggc caaggeaeca ctctcacagt olee tea 357 <210> 44 <21D 1?9 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 44 Gin ￥al Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu ￥al Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Vol Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu He Glu Trp Val Asn Gin Arg Fro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 Gly Val lie Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
[0028] Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Sor Sor Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala ￥al Tyr Leo Cjs 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gl}r Gin Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 45 Asn Tyr Leu He Glu 1 5 <210> 46 <211> 17 <212〉 PRT <213>小家鼠 x400,> 46 Val lie Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly
[0029] <210> 47 <21i> 10 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 47 Tyr Ser Pro Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 321 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 48 gacattgtga tgacccagtc tcacaaatt c atgtc'-cacat cagfaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca gggccagtca ggatgtgggt, actgctgtgg cctggtatca acaga.aacca 120 gggcaatctc ctaaacttct gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtocctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattaacaa tgtgcagtct 240 gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atcctccgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 49 <211〉 107 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 49
[0030] Asp He ￥al Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Glj 15 10 15 Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu He 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 80 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Asn Val Gin Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 50 Arg Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213>小家鼠
[0031] <400> 51 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210〉 52 <211> 9 <212> PRT <213〉小家鼠 <4(30 52 Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 53 <211〉 4 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成肽序到 <400〉 53 (jiy Ciiy (ι丄y ber <210> 54 <2I1> 4 <212> PRT <213〉人工序列
[0032] <220> <223〉人工合成肽序列 <400〉 54 γλ /-V -1 f, ~t Ser Gly Gly Gly 1 <210> 55 <211> δ <212> PRT <213〉人丄序列 <22(5> <223〉人丄合成肽序列 <400> 55 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213〉人IE序列 <220> <223>人丄合成肽序列 <400> 56 Ser Gly Gly Gly Gly I 5
[0033] <210> 57 <211〉 6 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>人工合成肽序列 <400> 57 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 58 <211〉 6 <212> PRT <213>人:C序列 <220> <223>人工合成肽序列 <40()> 58 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213〉人IE序列 <220> <223〉人工合成肽序列 <400> 59
[0034] e\ ·] f, -i /', r\ -| /x -| f. i r·' Giy Giy GJLy Giy Gly Ser 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220> 〈223>人工合成肽序列 :100/60 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成寡核苷酸序列 <400> 61 ccaccagatt ettatcagac agg 23 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220>
[0035] <223〉人工合成寡核苷酸序列 <400> 62 gggccagtggata.gaca.gatg 21 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213〉人丄序歹 <220> <223〉人丄合成寡核苷酸序列 <400> 63 gctc-aclgga Igglgggfciag atg 23 <210> 64 <211> 366 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 64 gaagtgeagc tggtggagte tgggggaggc ttagtgaagc etggagggtc cotgaaaatc 60 toctgigcag cciclggatt caccicoagi aactatgcca tgtottgggi tcgicagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaaoc attagtagtg gtggtggtta cacctactat 180 ccagacagtg agaaggggcg attcgccatt tccagagaoa atgccaagaa cfjccctgtac 240 ctgcagatga gcggtctgag gtct.gaggac acggccatgt attactgtgc aaracagcfr 300 tactataggt cccattacta ttctatggar tactggggtc aaggatcctc agtcaccgtc 360 tcctca 366
[0036] <210> 65 <211> 122 <212〉 PRT <2L3> 小家鼠 <400> 65 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser G]v Gly Gly Leu Val Lys Pro Glv Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Ser Aso Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Glu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tjr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gin Leu Tyr Tyr Arg Ser His Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 5 <212〉 PRT
[0037] <213〉小家鼠 <400> 66 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210〉 67 <211> 17 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 67 Thr lie Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Glu 1 VvS 1 5 10 15 01' <210> 68 <211> 13 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400> 68 /-1 -I Τ /Τ' ΓΠ h i'' IT* ι~< II , A Gin Leu lyr lyr Arg ber His lyr lyr ber Met Asp lyr 1 5 10 <210> 69 <211> 318 <212> DNA <213>小家鼠
[0038] <400> 69 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtataagt tatatgcact ggtaccagca. gaagtca.ggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tecaaact:gg cttctggagt ccctgct：cgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg ga.cctettac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgag 240 gatgotgcca cttattactg ccagcagtgg catagtaaac cagccacgtt eggtgctggg 300 accaagctgg agetgaaa 318 <210> 70 <211〉 106 <212> PRT <213>小家鼠 <400/ 70 Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser lie Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Lou Ala Ser Gly Val Pro Al<t Arg Flic Sor Gly Se)：· 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tvr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
[0039] Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Glri Trp His Ser Lys Pro Ala Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 71 Ser Ala Ser Ser Ser lie Ser Tyr Met： His 1 5 10 <210> 72 <211> 7 <2i2> PRT <213> 小家鼠 <100 72 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 73 <211> 9 <2I2> PRT <213〉小家鼠 <400> ?3 Gin Gin Trp His Ser Lys Pro Ala Thr
[0040] 1 5 <210> 74 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>人工合成引物序列 <400> 74 gcgaa t tcca cca l.gggalg 20 <210> 75 <211> 35 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成引物序列 <400> 75 tgagcca.ccg ccacctgcag agacagtgac cagag 35 <210> 76 <211> 3n <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成引物序列 <400> 76 ggtggcggtg gctcacagat tgttctcacc cagtc 35
[0041] <210> 77 <211〉 38 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成引物序列 <400> 77 actcccacca ccgcctttta tttccaattt tgtccccg 38 <210> 78 <211〉 32 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成引物序列 <400> 78 ggcggtggtg ggagtgagcc cagagggccc ac 32 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工合成引物序列 <400> 79 c I:c tagagcg gccgc i taf.c 20
【權(quán)利要求】
1. 選自以下（1Γ(6)中任一項所述的抗GPR49抗體： (1)抗體，該抗體含有Η鏈和L鏈，所述Η鏈具有作為⑶R1的SEQ ID NO: 45記載的 氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO: 46記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO: 47記載的氨基酸序列，所述L鏈具有作為⑶R1的SEQ ID NO: 50記載的氨基酸序列、作為 ⑶R2的SEQ ID NO: 51記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO: 52記載的氨基酸 序列，即抗體2L36 ; ⑵抗體，該抗體含有Η鏈和L鏈，所述Η鏈具有作為⑶R1的SEQ ID NO: 25記載的 氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO: 26記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO: 27記載的氨基酸序列，所述L鏈具有作為⑶R1的SEQ ID NO: 30記載的氨基酸序列、作為 CDR2的SEQ ID NO: 31記載的氨基酸序列、以及作為CDR3的SEQ ID NO: 32記載的氨基酸 序列，即抗體2U2E-2 ; ⑶抗體，該抗體含有Η鏈和L鏈，所述Η鏈具有作為⑶R1的SEQ ID NO: 35記載的 氨基酸序列、作為⑶R2的SEQ ID NO: 36記載的氨基酸序列、以及作為⑶R3的SEQ ID NO: 37記載的氨基酸序列，所述L鏈具有作為⑶R1的SEQ ID NO: 40記載的氨基酸序列、作為 CDR2的SEQ ID NO: 41記載的氨基酸序列、以及作為CDR3的SEQ ID NO: 42記載的氨基酸 序列，即抗體2L13-3 ; (4) 抗體，該抗體與表位結(jié)合，所述表位與（1)、（2)或（3)中所述的抗體所結(jié)合的 GPR49蛋白表位相同； (5) (1)?（3)中任一項所述的抗體，其中，該抗體含有人恒定區(qū)； (6) (5)中所述的抗體，其中，該抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
2. 藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的抗體作為有效成分。
3. 細胞增殖抑制劑，其中含有權(quán)利要求1所述的抗體作為有效成分。
4. 權(quán)利要求1所述的抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。
5. 權(quán)利要求4所述的應用，其中，癌癥為選自胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巢癌、 尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的任一種癌。
6. 權(quán)利要求1所述的抗體在制備用于診斷癌癥的試劑盒中的應用，其中，癌癥為選自 胃癌、大腸癌、肝細胞癌、肺癌、卵巢癌、尤文肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的任一種癌。
【文檔編號】G01N33/574GK104109208SQ201410356832
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月14日
【發(fā)明者】舟橋真一 申請人:中外制藥株式會社