阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用；通過基因工程的方法以及雜交瘤技術(shù)得到了雜交瘤細(xì)胞株C232C（保藏號為CCTCCNO：C2014102），并獲得了以阪崎腸桿菌OmpA為抗原的單克隆抗體，同時設(shè)計出了基于該單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，通過該試劑盒可以簡便、快速而又經(jīng)濟的實現(xiàn)食品、臨床及環(huán)境檢測領(lǐng)域中阪崎腸桿菌的免疫學(xué)檢測，特別適合于大量樣本的初步篩查。
【專利說明】阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii),現(xiàn)克羅諾桿菌(Cronobacter spp.),是奶粉中新發(fā)現(xiàn)的一種食源性條件致病菌。該菌能引起新生兒及嬰幼兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，死亡率高達(dá)40 %~80 %。阪崎腸桿菌能引起各年齡段人群感染，尤其是對早產(chǎn)兒、出生體重偏低、免疫力低下的嬰幼兒造成的危害是不可逆的。國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會將其定為“嚴(yán)重危害特定人群，威脅生命或?qū)е侣詫嵸|(zhì)性后遺癥”的細(xì)菌。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌廣泛的存在于自然界中，目前已經(jīng)從嬰幼兒配方奶粉、奶酪、UHT殺菌乳、谷類食物、香腸、香辛料、蔬菜等食品中發(fā)現(xiàn)了阪崎腸桿菌。此外，阪崎腸桿菌還廣泛存在于醫(yī)療環(huán)境中，食品加工廠各種儀器以及環(huán)境中。阪崎腸桿菌的廣泛存在嚴(yán)重的威脅了人類的生命健康，因此迫切需要建立一些簡單、高效、快速、準(zhǔn)確的阪崎腸桿菌檢測方法。
[0004]目前，應(yīng)用于阪崎腸桿菌檢測領(lǐng)域的方法主要有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和PCR檢測方法。但是這些方法都存在檢測周期長、操作繁瑣等缺點，因而實現(xiàn)難以對污染源的快速診斷。近年來，微生物快速檢測技術(shù)取得了突飛猛進的發(fā)展，其中基于單克隆抗體的免疫學(xué)檢測方法呈現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。免疫學(xué)檢測方法依賴于抗原和抗體間的特異性反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記在反應(yīng)物上的示蹤物，對抗原或抗體進行定性或定量檢測。免疫學(xué)檢測技術(shù)具有高選擇性、靈敏、快速、一次可檢測多個樣品、操作簡單等特點，特別適合于大批量樣本的檢測，已廣泛應(yīng)用于食源性致病微生物的快速檢測。
[0005]酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(Enzyme-linkedimmuosorbent assay, ELISA)是目前免疫學(xué)檢測方法中應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)最為成熟的方法。ELISA以酶或者輔酶作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或者抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫學(xué)反應(yīng)，并且利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板吸附抗原或者抗體，使其固相化，在其中進行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。ELISA具有選擇性好、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、實用性強、樣品處理量大等優(yōu)點，彌補了經(jīng)典化學(xué)分析方法和其他儀器測試手段的不足。ELISA可以應(yīng)用于致病菌快速檢測，關(guān)于沙門氏菌、單增生李斯特菌的ELISA檢測方法已經(jīng)應(yīng)用于食品的檢測中。
[0006]然而國內(nèi)外針對阪崎腸桿菌單克隆抗體的研究較少，迫切需要一種能夠特異性識別阪崎腸桿菌的單克隆抗體制備技術(shù)，并將該單克隆抗體應(yīng)用于ELISA檢測技術(shù)，以實現(xiàn)對食品、臨床及環(huán)境中阪崎腸桿菌的檢測和監(jiān)測。阪崎腸桿菌的外膜蛋白A(C)Utermembrane protein A, OmpA)在遺傳上具有較高的保守性,并且暴露于菌體表面,具有高的免疫原性，不僅可激發(fā)機體的體液免疫，而且還可誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，因而可作為一種良好的免疫原。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問題
[0008]針對現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是通過基因工程的方法以及雜交瘤技術(shù)得到雜交瘤細(xì)胞株，并獲得以阪崎腸桿菌OmpA為抗原的單克隆抗體，同時設(shè)計出了基于該單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，為實現(xiàn)對阪崎腸桿菌的快速、靈敏、高通量的快速檢測提供了檢測手段與方法。
[0009]技術(shù)方案
[0010]本發(fā)明是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的:
[0011]一種雜交瘤細(xì)胞株，于2014年5月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏名稱為雜交瘤細(xì)胞株C232C，保藏號為CCTCC NO:C2014102，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，郵編為430072。
[0012]一種阪崎腸桿菌單克隆抗體，由以上所述的雜交瘤細(xì)胞株制備得到。
[0013]一種以上所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，按照以下步驟進行:
[0014](I)阪崎腸桿菌OmpA蛋白的制備:采用PCR技術(shù)從阪崎腸桿菌基因組中擴增OmpA，克隆至表達(dá)載體中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白OmpA，經(jīng)純化后作為免疫原；
[0015](2)動物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的選擇:采用步驟(1)中的免疫原，對實驗動物進行注射免疫，免疫后取實驗動物的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在融合劑存在的條件下進行細(xì)胞融合，測定效價，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0016](3)分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株選擇:
[0017]I)通過將參考菌株接種培養(yǎng)于LB或NB液體培養(yǎng)基中，在30°C或37°C下培養(yǎng)12h后，分別將參考菌株培養(yǎng)液離心收集菌體，用PBS緩沖液沖洗后加入甲醛進行滅活菌體，調(diào)整各菌體濃度至108CFU/mL，獲得阪崎腸桿菌及陰性參考菌株的細(xì)胞懸液；
[0018]2)分別將以上參考菌株的細(xì)胞懸液包被酶標(biāo)板，包被濃度為106CFU/mL，檢測方法為間接ELISA法，檢測和篩選得到雜交瘤細(xì)胞株C232C。
[0019]一種以上所述的阪崎腸桿菌單克隆抗體的制備方法，采用體內(nèi)誘生腹水法將權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞株注射到預(yù)先注射石蠟的實驗動物腹腔內(nèi)，回收腹水并從中獲得抗體，再用飽和硫酸銨或親和層析法純化腹水中的單克隆抗體。
[0020]以上所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，步驟(1)中表達(dá)載體可以為pET32a(+)，純化可以為鎳離子親和層析技術(shù)純化。
[0021]以上所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，步驟(2)和步驟(4)中實驗動物可以為Balb/c 小鼠。
[0022]以上所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，步驟(2)中骨髓瘤細(xì)胞可以為SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；融合劑可以為聚乙二醇，測定效價的方法可以為間接ELISA法。
[0023]以上所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，步驟(3)中的參考菌株可以為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens CICC 10187)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidisCICC 21482)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans CICC 20139)、金黃葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ASl.2465)、藤黃微球菌(Micrococcus aureus ASl.191)、臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus ASl.1846)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae ATCC 13047)、大腸桿菌(Escherichia coli BL21)、阪崎腸桿菌(Cronobacter sakazakii ATCC 29544)或阪崎腸桿菌(Cronobacter muytjensii ATCC 51329)中的一種或幾種。
[0024]一種免疫檢測試劑盒，含有以上所述的阪崎腸桿菌單克隆抗體。
[0025]以上所述的免疫檢測試劑盒在檢測阪崎腸桿菌中的用途。
[0026]有益效果
[0027]本發(fā)明通過基因工程的方法以及雜交瘤技術(shù)得到了雜交瘤細(xì)胞，并獲得了以阪崎腸桿菌OmpA為抗原的單克隆抗體，設(shè)計出了以識別阪崎腸桿菌OmpA抗原的單克隆抗體為基礎(chǔ)的診斷阪崎腸桿菌試劑盒，至今尚未有以該抗原制備單克隆抗體而研制的診斷試劑盒的相關(guān)報道。
[0028]本發(fā)明制備的阪崎腸桿菌OmpA抗原的單克隆抗體特異性強，純度高，可用于阪崎腸桿菌的免疫學(xué)檢測。本發(fā)明建立的阪崎腸桿菌ELISA檢測方法操作簡便、費用低廉、處理量大、縮短了檢測周期，提高檢測效率，適用于食品及環(huán)境檢測領(lǐng)域中阪崎腸桿菌的免疫檢測，特別適合大量樣本的篩查，具有廣闊的發(fā)展前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為實施例1腹水中單克隆抗體的純化和純度SDS-PAGE圖。

【具體實施方式】
[0030]實施例1:阪崎腸桿菌OmpA單克隆抗體的制備
[0031]1.阪崎腸桿菌OmpA蛋白的制備
[0032]采用PCR技術(shù)從阪崎腸桿菌基因組中擴增OmpA，克隆至表達(dá)載體pET32a(+)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白OmpA，經(jīng)鎳柱親和層析柱純化后即可作為免疫Balb/c小鼠的抗原。
[0033]2.動物免疫和細(xì)胞融合
[0034]以純化的阪崎腸桿菌外膜蛋白OmpA為免疫原,對5~6只鼠齡為8~12周的Balb/c健康雌性小鼠進行背部和四肢皮下注射免疫。免疫前取未經(jīng)免疫的Balb/c小鼠血清作為陰性對照(Neg)。每次免疫時取免疫原與等量的弗氏佐劑制成混合乳化劑，首次免疫后分別于第21、35和47天加強免疫一次，免疫劑量為300 μ L/只，免疫方案見表1。免疫過程中，定期從免疫小鼠的尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法檢測血清中抗體效價。小鼠血清測定效價較高后，再加強免疫一次，免疫劑量為300 μ L/只。3~5天后取小鼠的脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(10:1)混合，用50%聚乙二醇1450融合，以HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。
[0035] 表1.免疫方案
[0036]

【權(quán)利要求】
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏名稱為雜交瘤細(xì)胞株C232C，保藏號為CCTCC NO:C2014102。
2.一種阪崎腸桿菌單克隆抗體，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株制備得到。
3.—種權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行: (1)阪崎腸桿菌O mpk蛋白的制備:采用PCR技術(shù)從阪崎腸桿菌基因組中擴增Omph克隆至表達(dá)載體中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白經(jīng)純化后作為免疫原； (2)動物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的選擇:采用步驟(1)中的免疫原，對實驗動物進行注射免疫，免疫后取實驗動物的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在融合劑存在的條件下進行細(xì)胞融合，測定效價，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； (3)分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株選擇: 1)通過將參考菌株接種培養(yǎng)于LB或NB液體培養(yǎng)基中，在30°C或37°C下培養(yǎng)12h后，分別將參考菌株培養(yǎng)液離心收集菌體，用PBS緩沖液沖洗后加入甲醛進行滅活菌體，調(diào)整各菌體濃度至18 CFU/mL，獲得阪崎腸桿菌及陰性參考菌株的細(xì)胞懸液； 2)分別將以上參考菌株的細(xì)胞懸液包被酶標(biāo)板，包被濃度為16CFU/mL，檢測方法為間接ELISA法，檢測和篩選得到雜交瘤細(xì)胞株C232C。
4.一種權(quán)利要求2所述的阪崎腸桿菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于，采用體內(nèi)誘生腹水法將權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株注射到預(yù)先注射石蠟的實驗動物腹腔內(nèi)，回收腹水并從中獲得抗體，再用飽和硫酸銨或親和層析法純化腹水中的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，步驟(1)中表達(dá)載體為pET32a ( + )，純化為鎳離子親和層析技術(shù)純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(4)中實驗動物為Balb/c小鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，步驟(2)中骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；融合劑為聚乙二醇，測定效價的方法為間接ELISA法。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，步驟(3)中的參考菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌iSerratia marcescens CICC 10187)、腸炎沙門氏菌enteritidis CICC 21482)、凝結(jié)芽抱桿菌Cfeci77w5.coagulans CICC 20139)、金黃葡萄球菌(5?<3/成r/occociAs aureus AS 1.2465)、藤黃微球菌aureus ASl.191)、臘樣芽胞桿菌cereus ASl.1846)、陰溝腸桿菌 CfeieroAacier cloacae ATCC13047)、大腸桿菌{Escherichia coli BL21)、阪崎腸桿菌{Cronobacter sakazakii ATCC29544)或阪崎腸桿菌{Cronobacter腿ytjensii ATCC 51329)中的一種或幾種。
9.一種免疫檢測試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的阪崎腸桿菌單克隆抗體。
10.權(quán)利要求9所述的免疫檢測試劑盒在檢測阪崎腸桿菌中的用途。
【文檔編號】G01N33/577GK104130979SQ201410359232
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】陸兆新, 李遠(yuǎn)宏, 陳啟明, 呂鳳霞, 別小妹, 趙海珍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)