一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法，所述中藥組合物的原料藥組成為：黃芪30-60重量份、女貞子9-15重量份、益母草9-30重量份、烏梅3-10重量份、黃連2-9重量份、肉桂1-5重量份、密蒙花3-9重量份；所述質(zhì)量檢測方法包括中藥組合物中黃芪甲苷、小檗堿、蒙花苷的含量測定和七味原料藥的薄層鑒別。本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，專屬性強、操作簡便、準確、可靠、重現(xiàn)性好，可以更好地保證臨床用藥安全。
【專利說明】一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,簡稱DR),是糖尿病嚴重而常見的眼部并發(fā)癥之一。隨著糖尿病病程的延長，DR的發(fā)生率亦隨之增高。病程8年以上者中，糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生率約為50%。該病早期癥狀不明顯，易被忽視，晚期又沒有特效的控制方法，疾病纏綿，頑固難治。本病失治，后果嚴重，是導(dǎo)致成人失明的主要原因，致盲率高達8-12%，對患病人群的生活質(zhì)量造成了嚴重不良影響。因此，DR的防治已成為當今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急需解決的重大攻關(guān)課題，日益受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界和醫(yī)藥工作者的高度重視。
[0003]在 申請人:早前的一件名為“一種治療早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥制劑”專利中(專利號ZL200610087540.3，授權(quán)公告日2009年9月16日)，公開了一種治療早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥制劑，處方組成為:
[0004]黃苗30_60g、女貞子9_15g、益母草9_30g、烏梅3_10g、黃連2_9g、肉桂2_5g、密蒙花 3-9g。
[0005]本方組方特別，臨床效果顯著。但是，迄今未見有關(guān)其質(zhì)量檢測方法的報道。為了保證用藥質(zhì)量和安全，有必要建立上述原料藥制備成的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法。
[0006]由于該處方中藥味較多，且中藥成分復(fù)雜，單一的定性鑒別或含量測定，都難以全面反映所述中藥組合物的質(zhì)量。因此，通過多次試驗嘗試，本發(fā)明最終選擇了采用HPLC的方法，分別以黃芪甲苷、鹽酸小檗堿、蒙花苷為檢測指標，對方中的黃芪、黃連、密蒙花進行含量測定；同時采用TLC的方法，對方中的所有原料藥——黃芪、女貞子、益母草、烏梅、黃連、密蒙花、肉桂進行薄層鑒別，以含量測定和薄層鑒別相結(jié)合的方式同時對所述中藥組合物進行質(zhì)量控制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對上述問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法。該方法操作簡便、準確、可靠、重現(xiàn)性好，可有效地控制所述中藥組合物的內(nèi)在質(zhì)量，保證制劑的穩(wěn)定性和臨床療效。
[0008]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案:
[0009]一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法，所述中藥組合物的原料藥組成為:
[0010]黃芪30-60重量份、女貞子9-15重量份、益母草9_30重量份、烏梅3_10重量份、黃連2-9重量份、肉桂1-5重量份、密蒙花3-9重量份；
[0011 ] 所述質(zhì)量檢測方法包括含量測定和薄層鑒別。
[0012]優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述含量測定包括黃芪甲苷的含量測定，具體操作為:
[0013]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為35: 65的乙腈-水為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于 4000 ；
[0014]對照品溶液的制備:取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含
0.3mg的溶液，即得；
[0015]供試品溶液的制備:取所述中藥組合物粉末約4g，精密稱定，加入70%乙醇100ml，稱定重量，超聲20min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液50ml，蒸干，殘渣加水25ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次40ml，正丁醇液回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；
[0016]測定法:分別精密吸取對照品溶液10μ 1、20μ 1，供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程計算，即得；
[0017]本發(fā)明所述中藥組合物含黃芪甲苷不得少于0.5mg/g。
[0018]優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述含量測定還包括蒙花苷和小檗堿的含量測定，其中采用如下的前處理方法，得到供試品溶液分別用于蒙花苷和小檗堿的含量測定:
[0019]取所述中藥組合物粉末約0.6g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入50 %乙醇50ml，稱定重量，超聲處理20min，放冷，再稱定重量，用50 %乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。
[0020]優(yōu)選的,上述蒙花苷的含量測定,還包括:
[0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為45: 54.5: 0.5的甲醇-水-醋酸為流動相；檢測波長為326nm;理論板數(shù)按蒙花苷峰計算應(yīng)不低于1000 ；
[0022]對照品溶液的制備:取蒙花苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含蒙花苷
0.1mg的溶液，即得；
[0023]測定法:分別精密吸取對照品溶液10 μ I與上述供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；
[0024]本發(fā)明所述中藥組合物含蒙花苷不得少于0.7mg/g。
[0025]優(yōu)選的，上述小檗堿的含量測定，還包括:
[0026]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為50: 50的乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相，其中每100ml0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再用磷酸調(diào)節(jié)PH值為4.0,然后與乙腈按照所述體積比混合；檢測波長為345nm ;理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5000 ；
[0027]對照品溶液的制備:取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含20 μ g鹽酸小檗堿的溶液，即得；
[0028]測定法:分別精密吸取對照品溶液與上述供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；
[0029]本發(fā)明所述中藥組合物含小檗堿以鹽酸小檗堿計，不得少于1.8mg/g。
[0030]優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述薄層鑒別包括對黃連、密蒙花和肉桂薄層鑒別，具體步驟為:
[0031](I)黃連薄層鑒別
[0032]取所述中藥組合物0.2-0.3g，加甲醇50ml，超聲處理15min，過濾，作為供試品溶液；另取黃連對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液；另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0.25mg鹽酸小檗堿的溶液，作為對照品溶液；吸取上述三種溶液各I μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為8:2:2:1.5:1的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水-三乙胺為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；
[0033](2)密蒙花薄層鑒別
[0034]取所述中藥組合物2_3g，加無水乙醇20ml，超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30ml和0.6M鹽酸溶液2ml使溶解，用乙酸乙酯25ml，振搖提取I次，棄去水層，乙酸乙酯層蒸干，殘渣加Iml甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取密蒙花對照藥材0.5g，加無水乙醇5ml，浸泡10分鐘，超聲處理20分鐘，過濾，濾液作為對照藥材溶液；吸取上述兩種溶液各I μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為20: I: 0.1的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；
[0035](3)肉桂薄層鑒別
[0036]取所述中藥組合物4-5g,加水20ml,超聲處理1min,過濾,濾液用乙醚15ml,振搖提取I次，棄去水層，乙醚層蒸干，殘渣加Iml無水乙醇使溶解，作為供試品溶液；另取肉桂對照藥材約0.5g，加入無水乙醇10ml，不斷振搖下冷浸20分鐘，過濾，得對照藥材溶液?’另取桂皮醛對照品，加無水乙醇制成每Iml含0.6mg桂皮醛的溶液，作為對照品溶液；吸取上述三種溶液各3 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比17:3的沸程60?90°C的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4_二硝基苯肼乙醇試液；供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
[0037]優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述薄層鑒別還包括對黃芪的薄層鑒別，具體操作為:
[0038]取所述中藥組合物4_5g，加甲醇100ml，回流提取I小時，濾過，取濾液50ml，蒸干，殘渣加水25ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次25ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次40ml，棄去氨水層，正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各4 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為13: 7: 2的氯仿-甲醇-水的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點，365nm紫外光燈下顯相同的橙黃色突光斑點。
[0039]優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述薄層鑒別還包括對女貞子的薄層鑒別，具體操作為:
[0040]取所述中藥組合物5g，加甲醇20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5ml使溶解，通過大孔樹脂柱，先后以水20ml和20%乙醇20ml洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用40%乙醇20ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇Iml使溶解，作為供試品溶液；另取特女貞苷對照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；吸取上述兩種溶液各
5μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為6:3:1的氯仿-甲醇-水下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，254nm紫外光燈下觀察；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
[0041]優(yōu)選的，所述女貞子薄層鑒別中，所述大孔樹脂為DlOl型大孔樹脂。
[0042]還優(yōu)選的，所述女貞子薄層鑒別中，所述大孔樹脂柱內(nèi)徑1.5cm，長10cm。
[0043]優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述薄層鑒別還包括對益母草的薄層鑒別，具體操作為:
[0044]取所述中藥組合物15g,加甲醇40ml,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘洛加水25ml,鹽酸1ml,超聲處理30min,4000轉(zhuǎn)離心10分鐘,取上清液緩慢通過預(yù)處理好的內(nèi)徑1.5cm、長15cm的強酸型陽離子交換樹脂柱,依次用水50ml和氨水溶液50ml洗脫,棄去洗脫液，繼續(xù)用50ml相同濃度的氨水溶液洗脫，收集該部分洗脫液，蒸干，加lmll%鹽酸甲醇使溶解，作為供試品；另取鹽酸水蘇堿，加1%鹽酸甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；吸取上述兩種溶液各2 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為10:6:1的丙酮-無水乙醇-鹽酸為展開劑，展開，取出，晾干，在105°C加熱15分鐘，放冷，噴以稀碘化鉍鉀-三氯化鐵試液混合溶液至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
[0045]優(yōu)選的，所述益母草薄層鑒別中，所述強酸型陽離子交換樹脂為(732)001X7型陽離子交換樹脂。
[0046]還優(yōu)選的，所述益母草薄層鑒別中，所述強酸型陽離子交換樹脂柱內(nèi)徑1.5cm，長15cm0
[0047]還優(yōu)選的，所述益母草薄層鑒別中，所述氨水溶液的體積百分比濃度為10% -20% ;更優(yōu)選為 13% -15%。
[0048]還優(yōu)選的，本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，所述薄層鑒別還包括對烏梅的薄層鑒別，具體操作為:
[0049]取所述中藥組合物0.2-0.3g,加無水乙醇1ml和鹽酸0.1ml,超聲處理30min,過濾，作為供試品溶液；另取烏梅對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液；另取枸櫞酸對照品，加無水乙醇制成每Iml含Img枸櫞酸的溶液，作為對照品溶液；吸取上述三種溶液各
4μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為4:1:5的正丁醇-甲酸-水的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.1%溴甲酚綠至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
[0050]本發(fā)明所述中藥組合物，所述各味原料藥經(jīng)過或不經(jīng)過提取，加入或不加入藥學(xué)上可以接受的輔料，制成臨床上可以接受的制劑。
[0051]上述臨床上可以接受的制劑，包括但不限于:散劑、丸劑、濃縮丸劑、水煎劑、顆粒齊U、膠囊劑、片劑、軟膠囊劑、口服液等。
[0052]本發(fā)明所述氨試液的配制方法，見中國藥典第一部附錄XVB部分的記載。
[0053]本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
[0054](I)本發(fā)明所述中藥組合物的原料藥藥味較多，定性鑒別和定量測定存在著諸多的干擾因素，本發(fā)明通過多次試驗嘗試，建立了對本發(fā)明所述組合物進行質(zhì)量檢測的方法:采用HPLC的方法，分別以黃芪甲苷以及鹽酸小檗堿和蒙花苷為檢測指標，對方中的黃芪、黃連、密蒙花進行含量測定；再優(yōu)選采用薄層層析(TLC)的方法，對方中的黃芪、女貞子、益母草、烏梅、黃連、密蒙花、肉桂分別進行薄層鑒別。使組合物中所有藥味的存在都以某種形式得到了檢測和有效控制，從而保證制劑的穩(wěn)定性、臨床療效和患者用藥安全。
[0055](2)本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，專屬性強、操作簡便、準確、可靠、重現(xiàn)性好。
[0056](3)本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，黃芪甲苷的含量測定方法與2010版藥典中黃芪藥材的含量測定方法相比，具有操作簡便、節(jié)省時間和原料，同時不降低分離度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好等諸多優(yōu)勢。如:
[0057]①樣品的提取:本發(fā)明以70%乙醇超聲20min來提取所述中藥組合物，而2010版藥典中黃芪藥材的提取方法為甲醇冷浸過夜，再回流提取4h。兩種方法相較，本發(fā)明極大節(jié)約了時間成本；
[0058]②提取液的精制:本發(fā)明采用溶劑萃取法進行精制，相較2010版藥典，省去了上DlOl型大孔吸附樹脂精制的步驟，但是不降低分離度，節(jié)約了原料和時間，操作更加簡便。同時因為減少了操作步驟，降低了操作過程中出現(xiàn)失誤和差錯的風險，使含量測定方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均得到了提高。
[0059](4)本發(fā)明所述質(zhì)量檢測方法，鹽酸小檗堿和蒙花苷的含量測定方法采用同樣的樣品前處理方法，一種前處理方法得到的供試品溶液能夠滿足兩種成分的含量測定，操作簡便、快速，效率更高。
[0060]以下述顆粒劑為例，詳細說明本發(fā)明所述黃芪甲苷、鹽酸小檗堿、蒙花苷的含量測定方法的建立過程。
[0061]1.顆粒劑的制備:
[0062]原料藥處方:
[0063]黃芪6kg、女貞子3kg、益母草3kg、烏梅1.8kg、黃連1.2kg、肉桂0.2kg、密蒙花 1.2kg
[0064]所述顆粒劑通過如下方法制備:
[0065](I)按照處方準備各味藥材。
[0066](2)肉桂加藥材重量10倍的水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另器收集，藥渣備用；揮發(fā)油加2倍體積的無水乙醇溶解；取重量10倍于揮發(fā)油體積的β-環(huán)糊精，加環(huán)糊精重量25倍的水制成的β-環(huán)糊精水溶液；在轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘下，緩慢向所述β -環(huán)糊精水溶液加入揮發(fā)油乙醇液，加入完畢后，繼續(xù)攪拌1.5小時，冷藏12小時，過濾，將濾得物在45°C下低溫烘干，得白色疏松的揮發(fā)油包合物。
[0067](3)黃芪、女貞子、密蒙花加體積為藥材重量10倍的70%乙醇回流提取2次，每次
1.5小時，濾過，合并兩次乙醇提取液，濾液回收乙醇，減壓濃縮至80°C時測定相對密度為
1.20-1.30的浸膏，得提取浸膏I，藥渣備用。
[0068](4)步驟⑵得到的肉桂藥渣、步驟(3)得到的黃芪、女貞子和密蒙花藥渣與烏梅，加藥材總重量8倍的水回流提取2次，每次2小時，濾過，合并兩次濾液，加入步驟(2)得到的蒸餾后的水溶液，靜置，濾過，濾液減壓濃縮至80°C時測定相對密度為1.20-1.30的浸膏，得提取浸膏2。
[0069](5)益母草、黃連加體積為藥材總重量10倍的60%乙醇提取3次，每次1.5小時，濾過，合并三次乙醇提取液，濾液回收乙醇，減壓濃縮至80°C時測定相對密度為1.20-1.30
的浸膏，得提取浸膏3。
[0070](6)將提取浸膏1、2、3合并，與糊精1.58kg、阿斯巴甜30g，噴霧制粒，整粒，然后加入步驟(2)得到的揮發(fā)油包合物，混合均勻，共得顆粒6kg，裝袋，每袋5g，共制得1200袋。
[0071]2.黃芪甲苷含量測定方法學(xué)考察
[0072]2.1供試品溶液的制備
[0073]取同一批號的顆粒劑2份，1份按照本發(fā)明所述的“黃芪甲苷含量測定”項下“供試品制備方法”制備，得供試品溶液I ;另1份按照2010版中國藥典284頁“黃芪甲苷含量測定”項下“供試品制備方法”制備，得供試品溶液II。
[0074]分別取供試品溶液I和II，按照本發(fā)明所述色譜條件進行測定。結(jié)果見附圖1和2，結(jié)果顯示本發(fā)明所述供試品溶液的制備方法與2010版藥典方法相比，雖然省去了上DlOl型大孔吸附樹脂精制的步驟，仍具有良好分離度，操作更加簡便，節(jié)約了原料和時間。
[0075]2.2系統(tǒng)適應(yīng)性試驗
[0076]從黃芪甲苷對照品溶液和樣品溶液的色譜圖可以看出，在本發(fā)明所述色譜條件下黃芪甲苷與組合物中其它組分色譜峰的分離度均大于1.5，能夠達到基線分離，且陰性對照無干擾。參見附圖3、4和5。
[0077]2.3線性關(guān)系考察
[0078]精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0.308mg的溶液，搖勻。分別精密吸取1、3、5、10、20、25 4 1，按照上述的色譜條件進樣，測定峰面積。以對照品進樣量X對照品濃度的自然對數(shù)(X)為橫坐標，以峰面積的自然對數(shù)(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果如表1所示，回歸方程為Y= 1.4705x-1.7904(r = 0.9995)。
[0079]表1黃芪甲苷線性關(guān)系的考察
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥組合物的質(zhì)量檢測方法，所述中藥組合物的原料藥組成為: 黃芪30-60重量份、女貞子9-15重量份、益母草9-30重量份、烏梅3_10重量份、黃連2-9重量份、肉桂1-5重量份、密蒙花3-9重量份； 其特征在于，所述質(zhì)量檢測方法包括含量測定和薄層鑒別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述含量測定包括黃芪甲苷的含量測定，具體操作為: 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為35: 65的乙腈-水為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000 ； 對照品溶液的制備:取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含0.3mg的溶液，即得； 供試品溶液的制備:取所述中藥組合物粉末約4g，精密稱定，加入70%乙醇100ml，稱定重量，超聲20min,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液50ml，蒸干，殘渣加水25ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次40ml，正丁醇液回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得； 測定法:分別精密吸取對照品溶液10μ 1、20μ 1，供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程計算，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述含量測定還包括蒙花苷和小檗堿的含量測定，其中采用如下的前處理方法，得到供試品溶液分別用于蒙花苷和小檗堿的含量測定: 取所述中藥組合物粉末約0.6g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入50%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理20min，放冷，再稱定重量，用50 %乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得; 優(yōu)選的，所述蒙花苷的含量測定，還包括如下步驟: 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為45: 54.5: 0.5的甲醇-水-醋酸為流動相；檢測波長為326nm;理論板數(shù)按蒙花苷峰計算應(yīng)不低于1000 ； 對照品溶液的制備:取蒙花苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含蒙花苷0.1mg的溶液，即得； 測定法:分別精密吸取對照品溶液10μ I與所述供試品溶液20μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得； 優(yōu)選的，所述小檗堿的含量測定，還包括如下步驟: 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為50: 50的乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相，其中每10ml0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再用磷酸調(diào)節(jié)PH值為4.0，然后與乙腈按照所述體積比混合；檢測波長為345nm ;理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5000 ； 對照品溶液的制備:取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含20μ g鹽酸小檗堿的溶液，即得； 測定法:分別精密吸取對照品溶液與所述供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述薄層鑒別包括對黃連、密蒙花和肉桂薄層鑒別，具體步驟為: (1)黃連薄層鑒別 取所述中藥組合物0.2-0.3g，加甲醇50ml，超聲處理15min，過濾，作為供試品溶液；另取黃連對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液；另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每Iml含0.25mg鹽酸小檗堿的溶液，作為對照品溶液；吸取上述三種溶液各I μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為8:2:2:1.5:1的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水-三乙胺為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點； (2)密蒙花薄層鑒別 取所述中藥組合物2-3g，加無水乙醇20ml，超聲處理30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30ml和0.6M鹽酸溶液2ml使溶解，用乙酸乙酯25ml，振搖提取I次，棄去水層，乙酸乙酯層蒸干，殘渣加Iml甲醇使溶解，作為供試品溶液；另取密蒙花對照藥材0.5g，加無水乙醇5ml，浸泡10分鐘，超聲處理20分鐘，過濾，濾液作為對照藥材溶液；吸取上述兩種溶液各I μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為20: I: 0.1的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點； (3)肉桂薄層鑒別 取所述中藥組合物4-5g,加水20ml,超聲處理1min,過濾,濾液用乙醚15ml,振搖提取I次，棄去水層，乙醚層蒸干，殘渣加Iml無水乙醇使溶解，作為供試品溶液；另取肉桂對照藥材約0.5g，加入無水乙醇10ml，不斷振搖下冷浸20分鐘，過濾，得對照藥材溶液；另取桂皮醛對照品，加無水乙醇制成每Iml含0.6mg桂皮醛的溶液，作為對照品溶液；吸取上述三種溶液各3 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比17:3的沸程60?90°C的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液；供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述薄層鑒別還包括對黃芪的薄層鑒別，具體操作為: 取所述中藥組合物4-5g，加甲醇100ml，回流提取I小時，濾過，取濾液50ml，蒸干，殘渣加水25ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次25ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次40ml，棄去氨水層，正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液?’另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每Iml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液；吸取上述兩種溶液各4 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為13: 7: 2的氯仿-甲醇-水的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點，365nm紫外光燈下顯相同的橙黃色突光斑點。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述薄層鑒別還包括對女貞子的薄層鑒別，具體操作為: 取所述中藥組合物5g,加甲醇20ml,超聲處理20min,濾過,濾液蒸干,殘洛加水5ml使溶解，通過大孔樹脂柱，先后以水20ml和20%乙醇20ml洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用40%乙醇20ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇Iml使溶解，作為供試品溶液；另取特女貞苷對照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；吸取上述兩種溶液各5 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為6:3:1的氯仿-甲醇-水下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，254nm紫外光燈下觀察；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點； 優(yōu)選的，所述大孔樹脂為DlOl型大孔樹脂； 還優(yōu)選的，所述大孔樹脂柱內(nèi)徑1.5cm，長10cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述薄層鑒別還包括對益母草的薄層鑒別，具體操作為: 取所述中藥組合物15g,加甲醇40ml,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干，殘洛加水25ml,鹽酸1ml,超聲處理30min,4000轉(zhuǎn)離心10分鐘,取上清液緩慢通過預(yù)處理好的內(nèi)徑1.5cm、長15cm的強酸型陽離子交換樹脂柱，依次用水50ml和氨水溶液50ml洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用50ml相同濃度的氨水溶液洗脫，收集該部分洗脫液，蒸干，加lmll%鹽酸甲醇使溶解，作為供試品；另取鹽酸水蘇堿，加1%鹽酸甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；吸取上述兩種溶液各2 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為10:6:1的丙酮-無水乙醇-鹽酸為展開劑，展開，取出，晾干，在105°C加熱15分鐘，放冷，噴以稀碘化鉍鉀-三氯化鐵試液混合溶液至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點； 優(yōu)選的，所述強酸型陽離子交換樹脂為(732)001X7型陽離子交換樹脂； 還優(yōu)選的，所述強酸型陽離子交換樹脂柱內(nèi)徑1.5cm，長15cm ； 還優(yōu)選的，所述氨水溶液的體積百分比濃度為10% -20% ;更優(yōu)選為13% -15%。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述薄層鑒別還包括對烏梅的薄層鑒別，具體操作為: 取所述中藥組合物0.2-0.3g,加無水乙醇1ml和鹽酸0.1ml,超聲處理30min,過濾，作為供試品溶液；另取烏梅對照藥材0.2g，同法制成對照藥材溶液；另取枸櫞酸對照品，力口無水乙醇制成每Iml含Img枸櫞酸的溶液，作為對照品溶液；吸取上述三種溶液各4 μ 1，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以體積比為4:1:5的正丁醇-甲酸-水的上層溶液為展開齊IJ，展開，取出，晾干，噴以0.1 %溴甲酚綠至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述中藥組合物，所述各味原料藥經(jīng)過或不經(jīng)過提取，加入或不加入藥學(xué)上可以接受的輔料，制成臨床上可以接受的制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述臨床上可以接受的制劑，選自散劑、丸劑、濃縮丸劑、水煎劑、顆粒劑、膠囊劑、片劑、軟膠囊劑或口服液。
【文檔編號】G01N30/36GK104161847SQ201410359428
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】林德良 申請人:北京漢典制藥有限公司