一種脫氫酶電極及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種脫氫酶電極及其制備方法。該電極包括基底電極、涂敷于所述基底電極上的電子傳導層和涂敷于所述電子傳導層上的脫氫酶層，所述電子傳導層為仿生納米復合材料；所述脫氫酶層為仿生納米復合材料/脫氫酶復合物。其制備方法包括：a、將碳納米材料和生物大分子超聲分散的懸濁液滴涂于基底電極上形成電子傳導層；b、將脫氫酶加入上述懸濁液超聲處理得到固定化脫氫酶體系滴涂于上述電子傳導層上形成脫氫酶層。該脫氫酶電極能在低電位下實現(xiàn)輔酶的電化學再生，操作簡單、檢測靈敏度高、電極穩(wěn)定性重現(xiàn)性好、酶活損失小。
【專利說明】一種脫氫酶電極及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物傳感器領域，尤其涉及一種脫氫酶電極及其制備方法。
【背景技術】
[0002]酶電極自上世紀60年代問世以來，其技術研究和應用獲得了巨大的發(fā)展，但幾乎所有分析元件用酶是氧化酶。脫氫酶也是一類氧化還原酶，與氧化酶的不同之處在于酶催化功能需要依賴容易得失電子的輔酶。由于采用輔酶作為電子和氫的傳遞體，脫氫酶的催化反應不受體系中氧的影響，這一特點在傳感器的實際應用中特別突出。同時，與氧化酶相t匕，脫氫酶種類繁多，來源廣泛，且對底物一般具有更高的選擇性，因此，脫氫酶電極具有更廣闊的應用前景。
[0003]雖然，脫氫酶電極具有廣闊的應用前景和市場價值，但是此類電極的研究依然存在很多亟待解決的關鍵問題。比如，如何在低電位下實現(xiàn)輔酶在電極表面的直接氧化再生；如何將脫氫酶分子固定在載體表面，能持久且高效地保持其活性狀態(tài)等。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能夠在低電位下實現(xiàn)輔酶的電化學再生，且操作簡單、檢測靈敏度高、電極穩(wěn)定性重現(xiàn)性好、固定化酶活性高的脫氫酶電極及其制備方法。
[0005]為了達成上述目的之一，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0006]一種脫氫酶電極，包括基底電極、涂敷于所述基底電極上的電子傳導層和涂敷于所述電子傳導層上的脫氫酶層，其特征在于，所述電子傳導層為仿生納米復合材料，所述脫氫酶層為仿生納米復合材料/脫氫酶復合物。
[0007]所述仿生納米復合材料為生物大分子分散的碳納米材料；所述仿生納米復合材料/脫氫酶復合物為脫氫酶分散固定于所述仿生納米復合材料所得的復合物。
[0008]所述生物大分子為魚精蛋白、聚賴氨酸、組蛋白的一種，所述碳納米材料為碳納米管、碳納米纖維、石墨烯、碳納米片、碳納米球的一種，所述脫氫酶為乙醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、甲醇脫氫酶中的一種。
[0009]所述仿生納米復合材料為魚精蛋白和碳納米管復合物；所述仿生納米復合材料/脫氫酶復合物為碳納米管/魚精蛋白/脫氫酶復合物。
[0010]為了達成上述目的之二，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0011]一種脫氫酶電極的制備方法，其特征在于包括如下步驟:
[0012]a、取碳納米材料和生物大分子溶液混合，加入超純水，超聲分散得碳納米材料和生物大分子復合物的懸濁液，將該懸濁液采用滴涂法涂敷于所述基底電極上，干燥，形成電子傳導層；其中，碳納米材料:生物大分子=5:(0.1-10)(質(zhì)量比)；
[0013]b、取碳納米材料和生物大分子溶液混合，加入超純水，超聲分散得懸濁液，將脫氫酶加入上述懸濁液繼續(xù)超聲處理，使脫氫酶松散的包裹在碳納米材料/生物大分子復合物中得到固定化脫氫酶體系，將該酶體系采用滴涂法涂敷于所述電子傳導層上，干燥，形成脫氫酶層；其中，所述碳納米材料:生物大分子:脫氫酶=5: (0.1-10): (0.1-1)(質(zhì)量比)。
[0014]所述超聲分散時間為60_65min。
[0015]本發(fā)明脫氫酶電極能夠在低電位下實現(xiàn)輔酶的電化學再生，且操作簡單、檢測靈敏度高、電極穩(wěn)定性重現(xiàn)性好、酶活損失小。本發(fā)明脫氫酶電極響應速度快，檢測濃度范圍寬，電極加工簡便，基于不同的脫氫酶可以分別實現(xiàn)對發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇、乳酸、蘋果酸、甲醇等物質(zhì)的選擇性電化學傳感,為工業(yè)生物過程重要生化參數(shù)的快速或在線檢測提供新的分析技術，為實現(xiàn)過程優(yōu)化控制、提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量奠定基礎。
[0016]本發(fā)明所制備的碳納米材料/生物大分子復合材料不僅可以高效催化氧化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，而且能夠提高修飾電極表面親水性，降低電極檢出限。
[0017]本發(fā)明將脫氫酶分散包裹在碳納米材料/生物大分子復合材料中，不僅能夠有效降低固定化脫氫酶活性損失，而且能夠促進電子傳遞。
[0018]本發(fā)明的有益效果:
[0019]1.本發(fā)明利用生物大分子分散碳納米材料，尤其采用魚精蛋白分散碳納米材料，大大提高電極表面親水性，還原型輔酶分子(如，NADH)能夠更容易在電極表面富集，大大降低電極檢出限，提高電極靈敏度。
[0020]2.本發(fā)明采用生物大分子和碳納米材料的復合物固定脫氫酶，尤其魚精蛋白/碳納米管復合物能夠提供類似的生物膜環(huán)境，將酶分子所處環(huán)境調(diào)節(jié)至生理狀態(tài)，不僅大大降低酶活性的損失，而且脫氫酶直接吸附在碳納米材料表面，能夠極大提高電子的傳導速率。此外，生物大分子尤其是魚精蛋白的存在，使得電極表面的親水性增強，底物分子及輔酶(如，NAD+)能夠更容易達到電極表面，進而提高電極靈敏度。
[0021]3.本發(fā)明電極制作簡單，電極響應速度快，檢測濃度范圍寬，是一種通用型的酶電極的制備方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明電極檢測還原型輔酶I的原理圖；
[0023]圖2為本發(fā)明修飾電極、碳納米管修飾電極及裸玻碳電極在1-4M NADH中的電極響應曲線；
[0024]圖3為本發(fā)明修飾電極測定NADH的標準工作曲線；
[0025]圖4為本發(fā)明脫氫酶電極測定乙醇的原理圖；
[0026]圖5為本發(fā)明脫氫酶電極測定乙醇的電極響應曲線；
[0027]圖6為雙酶電極體系檢測發(fā)酵液中蘋果酸及乳酸的裝置圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0029]實施例1:
[0030]以本電極測試緩沖溶液中還原型輔酶I (NADH)為例(電極響應原理參見圖1)。其測定步驟如下:
[0031]a.以碳納米管/魚精蛋白復合材料滴涂于基底電極表面制備的修飾電極作為工作電極，Ag/AgCl(3M KCl)電極為參比電極，箔片電極為對電極，用上海辰華(CHI 760D)電化學工作站進行測定。所述修飾電極、Ag/AgCl(3M KCl)、箔片電極及CHI 760D電化學工作站相連。將工作電極直接插入盛有緩沖溶液的測量池中，記錄初始循環(huán)伏安曲線。
[0032]電極的制備過程:取20mg魚精蛋白，加入5mL超純水中，配置4mg/mL的魚精蛋白水溶液，放置待用。分別取5mg碳納米管，600 μ L魚精蛋白水溶液加入5mL超純水，超聲分散Ih,得到碳納米管/魚精蛋白納米復合材料，置于冰箱中。取玻碳電極在打磨紙上放少許三氧化二鋁粉末，加入水，盡量多一點，然后將電極以圓形畫圈方式打磨2到3min，之后用蒸餾水沖洗，再之后用燒杯裝入一定的水，將電極放入其中，在超聲波機器中超聲清洗5min，再換乙醇，超聲清洗2min，放置待用。取20 μ L碳納米管/魚精蛋白納米復合材料物滴涂于清洗干凈的玻碳電極表面，自然晾干或紅外燈下晾干，得到所述的修飾電極。
[0033]b.將修飾電極插入盛有緩沖溶液的測量池中得到初始循環(huán)伏安曲線，向測量池中加入已知濃度的NADH，循環(huán)伏安曲線上出現(xiàn)氧化峰(如圖2)，根據(jù)加入NADH后的氧化峰電流大小和NADH濃度繪制標準曲線(如圖3)。
[0034]檢測裝置:碳納米管/魚精蛋白復合材料修飾電極為工作電極，Ag/AgCl (3M KCl)電極為參比電極，箔片為對電極，通過導線與CHI 760D電化學工作站相連。
[0035]實施例2 ；
[0036]首先取緩沖溶液配置了兩個加標試樣，濃度分別為10_6和10_7，依照實施例1測定氧化峰電流，根據(jù)峰電流值，對照標準工作曲線(如圖3)計算出相應的濃度。
[0037]實施例3:
[0038]以脫氫酶電極測試緩沖溶液乙醇的含量(電極響應原理參見圖4)。其測定步驟如下:
[0039]a.以乙醇脫氫酶電極作為工作電極，Ag/AgCl(3M KCl)電極為參比電極，箔片電極為對電極，用上海辰華(CHI 760D)電化學工作站進行測定。所述酶電極、Ag/AgCl(3M KCl)、箔片電極及CHI 760D電化學工作站相連。將脫氫酶電極直接插入盛有緩沖溶液的測量池中，記錄初始循環(huán)伏安曲線，向測量池中加入已知濃度的乙醇，循環(huán)伏安曲線上出現(xiàn)氧化峰(如圖5)，根據(jù)加入乙醇后的氧化峰電流大小和乙醇濃度繪制標準曲線。所述脫氫酶酶電極為碳納米管/乙醇脫氫酶/魚精蛋白復合材料滴涂于碳納米管/魚精蛋白修飾的電極表面所制備的。
[0040]b.電極的制備過程為:取20mg魚精蛋白，加入5mL超純水中，配置4mg/mL的魚精蛋白溶液，放置待用。分別取5mg碳納米管，600 μ L魚精蛋白溶液加入5mL水中，超聲分散lh，得到碳納米管/魚精蛋白復合材料，置于冰箱中。取玻碳電極在打磨紙上放少許三氧化二鋁粉末，加入水，盡量多一點，然后將電極以圓形畫圈方式打磨2-3min，之后用蒸餾水沖洗，再之后用燒杯裝入一定的水，將電極放入其中，在超聲波機器中超聲清洗5min，再換乙醇，超聲清洗2min，放置待用。取15 μ L碳納米管/魚精蛋白復合材料物滴涂于清洗干凈的玻碳電極表面，自然晾干或紅外燈下晾干，得到所述的修飾電極。取60yL，2mg/mL的乙醇脫氫酶加入500 μ L碳納米管/魚精蛋白復合材料中，超聲分散5min，放置待用。取20 μ L所得的乙醇脫氫酶/碳納米管/魚精蛋白復合物滴涂于所述的修飾電極表面，冰箱中放置晾干，得到所述的脫氫酶電極。冰箱中放置待用。
[0041]c.檢測裝置:乙醇脫氫酶電極為工作電極，Ag/AgCl(3M KCl)電極為參比電極，箔片為對電極，通過導線與CHI 760D電化學工作站相連。
[0042]實施例4:
[0043]采用本發(fā)明方法制備蘋果酸脫氫酶電極和乳酸脫氫酶電極，集成雙酶電極體系，同時測定葡萄發(fā)酵液中蘋果酸及乳酸的含量(參見圖6)。
[0044]實施例5:
[0045]甲醇酵母發(fā)酵的誘導階段，甲醇濃度控制非常關鍵，采用本發(fā)明方法制備甲醇脫氫酶電極，用于監(jiān)測發(fā)酵液中甲醇濃度的變化。
[0046]實施例6
[0047]同實施例1，所不同的是:
[0048]電極的制備過程:取20mg魚精蛋白，加入5mL超純水中，配置4mg/mL的魚精蛋白水溶液，放置待用。分別取5mg碳納米管，25 μ L魚精蛋白水溶液加入5mL超純水，超聲分散Ih,得到碳納米管/魚精蛋白納米復合材料，置于冰箱中。取玻碳電極在打磨紙上放少許三氧化二鋁粉末，加入水，盡量多一點，然后將電極以圓形畫圈方式打磨2到3min，之后用蒸餾水沖洗，再之后用燒杯裝入一定的水，將電極放入其中，在超聲波機器中超聲清洗5min，再換乙醇，超聲清洗2min，放置待用。取20 μ L碳納米管/魚精蛋白納米復合材料物滴涂于清洗干凈的玻碳電極表面，自然晾干或紅外燈下晾干，得到所述的修飾電極。
[0049]實施例7
[0050]同實施例1，所不同的是:
[0051]電極的制備過程:取20mg魚精蛋白，加入5mL超純水中，配置4mg/mL的魚精蛋白水溶液，放置待用。分別取5mg碳納米管，2.5mL魚精蛋白水溶液加入5mL超純水，超聲分散Ih,得到碳納米管/魚精蛋白納米復合材料，置于冰箱中。取玻碳電極在打磨紙上放少許三氧化二鋁粉末，加入水，盡量多一點，然后將電極以圓形畫圈方式打磨2到3min，之后用蒸餾水沖洗，再之后用燒杯裝入一定的水，將電極放入其中，在超聲波機器中超聲清洗5min，再換乙醇，超聲清洗2min，放置待用。取20 μ L碳納米管/魚精蛋白納米復合材料物滴涂于清洗干凈的玻碳電極表面，自然晾干或紅外燈下晾干，得到所述的修飾電極。
[0052]實施例8
[0053]同實施例3，所不同的是:
[0054]電極的制備過程為:取20mg魚精蛋白，加入5mL超純水中，配置4mg/mL的魚精蛋白溶液，放置待用。分別取5mg碳納米管，25 μ L魚精蛋白溶液加入5mL水中，超聲分散lh，得到碳納米管/魚精蛋白復合材料，置于冰箱中。取玻碳電極在打磨紙上放少許三氧化二鋁粉末，加入水，盡量多一點，然后將電極以圓形畫圈方式打磨2-3min，之后用蒸餾水沖洗，再之后用燒杯裝入一定的水，將電極放入其中，在超聲波機器中超聲清洗5min，再換乙醇，超聲清洗2min，放置待用。取15 μ L碳納米管/魚精蛋白復合材料物滴涂于清洗干凈的玻碳電極表面，自然晾干或紅外燈下晾干，得到所述的修飾電極。取5yL，2mg/mL的乙醇脫氫酶加入500 μ L碳納米管/魚精蛋白復合材料中，超聲分散5min，放置待用。取20 μ L所得的乙醇脫氫酶/碳納米管/魚精蛋白復合物滴涂于所述的修飾電極表面，冰箱中放置晾干，得到所述的脫氫酶電極。冰箱中放置待用。
[0055]實施例9
[0056]同實施例3，所不同的是:
[0057]電極的制備過程為:取20mg魚精蛋白，加入5mL超純水中，配置4mg/mL的魚精蛋白溶液，放置待用。分別取5mg碳納米管，2.5mL魚精蛋白溶液加入5mL水中，超聲分散lh，得到碳納米管/魚精蛋白復合材料，置于冰箱中。取玻碳電極在打磨紙上放少許三氧化二鋁粉末，加入水，盡量多一點，然后將電極以圓形畫圈方式打磨2-3min，之后用蒸餾水沖洗，再之后用燒杯裝入一定的水，將電極放入其中，在超聲波機器中超聲清洗5min，再換乙醇，超聲清洗2min，放置待用。取15 μ L碳納米管/魚精蛋白復合材料物滴涂于清洗干凈的玻碳電極表面，自然晾干或紅外燈下晾干，得到所述的修飾電極。取0.5mL,2mg/mL的乙醇脫氫酶加入500 μ L碳納米管/魚精蛋白復合材料中，超聲分散5min，放置待用。取20 μ L所得的乙醇脫氫酶/碳納米管/魚精蛋白復合物滴涂于所述的修飾電極表面，冰箱中放置晾干，得到所述的脫氫酶電極。冰箱中放置待用。
[0058]實施例10
[0059]以碳納米纖維/聚賴氨酸復合材料代替碳納米管/魚精蛋白復合材料，其他同實施例1_9。
[0060]實施例7
[0061]以石墨烯/組蛋白復合材料代替碳納米管/魚精蛋白復合材料，其他同實施例1_9 ο
[0062]實施例8
[0063]以碳納米片/組蛋白復合材料代替碳納米管/魚精蛋白復合材料，其他同實施例1_9 ο
[0064]實施例9
[0065]以碳納米球/聚賴氨酸復合材料代替碳納米管/魚精蛋白復合材料，其他同實施例 1-9。
【權(quán)利要求】
1.一種脫氫酶電極，包括基底電極、涂敷于所述基底電極上的電子傳導層和涂敷于所述電子傳導層上的脫氫酶層，其特征在于，所述電子傳導層為仿生納米復合材料；所述脫氫酶層為仿生納米復合材料/脫氫酶復合物。
2.如權(quán)利要求1所述的脫氫酶電極，其特征在于，所述仿生納米復合材料為生物大分子分散的碳納米材料；所述仿生納米復合材料/脫氫酶復合物為脫氫酶分散固定于所述仿生納米復合材料所得的復合物。
3.如權(quán)利要求2所述的脫氫酶電極，其特征在于，所述生物大分子為魚精蛋白、聚賴氨酸、組蛋白的一種，所述碳納米材料為碳納米管、碳納米纖維、石墨烯、碳納米片、碳納米球的一種，所述脫氫酶為乙醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶或甲醇脫氫酶中的一種。
4.如權(quán)利要求2或3所述的脫氫酶電極，其特征在于，所述仿生納米復合材料為魚精蛋白和碳納米管復合物；所述仿生納米復合材料/脫氫酶復合物為碳納米管/魚精蛋白/脫氫酶復合物。
5.一種制備如權(quán)利要求1-4任一所述脫氫酶電極的方法，其特征在于包括如下步驟: a、取碳納米材料和生物大分子溶液混合，加入超純水，超聲分散得碳納米材料和生物大分子復合物的懸濁液，將該懸濁液采用滴涂法涂敷于所述基底電極上，干燥，形成電子傳導層；其中，碳納米材料:生物大分子=5:(0.1-10)(質(zhì)量比)； b、取碳納米材料和生物大分子溶液混合，加入超純水，超聲分散得懸濁液，將脫氫酶加入上述懸濁液繼續(xù)超聲分散處理，使脫氫酶松散的包裹在碳納米材料/生物大分子復合物中得到固定化脫氫酶體系，將該酶體系采用滴涂法涂敷于所述電子傳導層上，干燥，形成脫氫酶層；其中，所述碳納米材料:生物大分子:脫氫酶=5: (0.1-10): (0.1-1)(質(zhì)量比)。
6.如權(quán)利要求5所述脫氫酶電極的制備方法，其特征在于，所述超聲分散時間為60-65mino
【文檔編號】G01N27/327GK104132982SQ201410360529
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】陳燕 申請人:山東省科學院生物研究所