肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法，方法：色譜儀為島津LC-20AT高效液相色譜儀，固定相反相C18柱（SHIMADZU?VP-ODS?5um?150*4.6mm），流動(dòng)相A液為50mmol/L乙酸鈉溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流動(dòng)相B液為乙腈：水=2:1，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，洗脫時(shí)間24min，流速1ml/min，進(jìn)樣量5μl，結(jié)果：谷氨酰胺(Gln)的保留時(shí)間為10.144min，檢出限為0.19mg/L（S/N=2），定量限為0.95mg/L（S/N=10）線性范圍172.3～689.5mg/L，R2=0.9995，日間精密度RSD值均不大于2.34%。結(jié)論:通過對(duì)肉鴿不同組織及血液進(jìn)行合理處理，用高效液相色譜儀能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定肉鴿血液、肌肉及十二指腸的谷氨酰胺(Gln)含量，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究提供有效的技術(shù)和數(shù)據(jù)支持。
【專利說明】肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種測(cè)定肉鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的方法，屬于色譜分析技術(shù) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨骼肌中含有谷氨酰胺合成酶，該酶位于細(xì)胞質(zhì)中，它催化谷氨酸和氨合成谷氨 酰胺（Gin)，骨骼肌是谷氨酰胺（Gin)合成的主要組織，十二指腸是利用谷氨酰胺（Gin)主 要器官，谷氨酰胺（Gin)在血液循環(huán)和體內(nèi)游離氨基酸含量最高。谷氨酰胺（Gin)是5碳 氨基酸，含有兩個(gè)氨基氨基和酰胺基）。在生理pH條件下，谷氨酰胺（Gin)羧基帶負(fù) 電荷，氨基帶正電荷，分子凈電荷為零，屬于中性氨基酸。由于它含兩個(gè)氨基特性，決定了它 在器官之間氮的運(yùn)輸和作為氨載體的重要性，循環(huán)中30%?35%的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)依靠谷氨酰 胺（Gin)完成，故Gin被稱之為氮梭（nitrogen shuttle)。同時(shí)其碳源作為能量，每克分子 谷氨酰胺完全氧化可產(chǎn)生30mol/L分子的ATP。谷氨酰胺（Gin)是腸粘膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞的主要能源。肉鴿作為特禽，生產(chǎn)有其特性，成年種鴿產(chǎn)蛋后孵化和哺喂出生乳 鴿到22日齡，體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝水平很高，血液中的谷氨酰胺（Gin)可維持鴿體高水平的生長(zhǎng) 激素，保持種鴿持續(xù)的生產(chǎn)能力；十二指腸中谷氨酰胺（Gin)可維持粘膜的正常形態(tài)，提高 腸粘膜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；骨骼肌中谷氨酰胺（Gin)含量提高，可縮種鴿短產(chǎn)蛋間隔，提高 年產(chǎn)蛋量。
[0003] 至今尚未發(fā)現(xiàn)專門針對(duì)肉鴿組織及血液中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法，亟需建立一 套適用性強(qiáng)、效率高而且精確的測(cè)定方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種測(cè)定肉鴿組織及血液中谷氨酰胺含量的方 法，通過對(duì)肉鴿不同組織及血液進(jìn)行合理處理，用高效液相色譜儀能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定肉鴿 血液、肌肉及十二指腸的谷氨酰胺（Gin)含量，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究提供有效的技 術(shù)數(shù)據(jù)支持。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺 含量的測(cè)定方法，包括以下步驟： (1) 衍生化試劑的配制：分別配制100mM的異硫氰酸苯酯和1M的三乙胺備用； (2) 色譜柱的制備：色譜儀為島津LC-20AT高效液相色譜儀，固定相反相C18柱 (SHIMADZU VP-ODS 5um 150*4. 6mm)，流動(dòng)相 A液為 50mmol/L 乙酸鈉溶液（PH=6. 50):乙 腈=97 :3,流動(dòng)相B液為乙腈：水=2:1 ; (3) 標(biāo)準(zhǔn)液的制備：取10ml谷氨酰胺（Gin)加入到25 ml容量瓶，用純水溶解定溶，放 入4°C冰箱保存，并逐級(jí)稀釋至3/4、1/2的濃度，2倍濃度現(xiàn)配現(xiàn)用； (4) 標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定結(jié)果處理：將步驟（3)中標(biāo)準(zhǔn)液300 μ 1加入1. 5 ml離 心管中，然后加入步驟（1)中的150 μ 1異硫氰酸苯酯和150 μ 1三乙胺，混合室溫反應(yīng)一 小時(shí)，加600 μ 1正己燒萃取雜質(zhì)，15000 pm/min離心5min取下層清液，用步驟（2)的色譜 柱進(jìn)行測(cè)定，柱溫40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，洗脫時(shí)間24min，流速1 ml/min，進(jìn)樣量5 μ 1 ;制 定標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖； (5) 取樣：分別從乳鴿血液、胸部肌肉和十二指腸中取樣，具體來講，血液中谷氨酰胺取 樣步驟：乳鴿靜脈采血2ml加入到含肝素的離心管，在轉(zhuǎn)速2800 pm/min溫度4°C下離心 10 min,取0.4ml血液注入到20 mgSSA (5-磺基水楊酸）樣品管中，潤(rùn)旋混合后，迅速在液 氮中冷卻，然后在_80°C保存； 胸部肌肉中谷氨酰胺取樣步驟：乳鴿16 d頸靜脈放血后，腹部毛清理干凈，剝離腹部 皮膚，采集胸部肌肉，用剪刀剪成0. 5 mm塊，放入EP管中，迅速在液氮中冷卻，然后在-80°C 保存待測(cè)； 十二指腸中谷氨酰胺（Gin)取樣步驟：打開乳鴿腹腔，取出十二指腸，放于平皿中，剖 開十二指腸，露出腸粘膜，除去上層腸內(nèi)容物，用手術(shù)刀片刮取腸粘膜層，放入EP管中，迅 速在液氮中冷卻，然后在_80°C保存待測(cè) (6) 試驗(yàn)樣品的處理：血液樣品的處理：將SSA血液樣品從-80°C取出并在室溫下解凍 后，在3000g (5790RPM) 4°C條件下離心15min，以去除蛋白沉淀，上清液轉(zhuǎn)入樣品管后置于 樣品架于4°C保存?zhèn)溆?；肌肉和十二指腸粘膜組織樣品的處理：肌肉、十二指腸粘膜組織樣 品在-80°C取出，稱取樣品0. 2 g，用0. 2 ml PBS (磷酸鹽緩沖液)作稀釋液，勻漿器中研磨， 用1. 0ml 0. 66M冰凍后的高氯酸進(jìn)行勻漿200s，勻漿后的樣品于4°C、RCF為3000g離心 5min，取0.8 ml上清液用0.4ml 0.66M磷酸鉀中和，形成的高氯酸鉀沉淀離心除去（4°CRCF 為3000g離心5min)離心后的上清液在-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0006] (7)試驗(yàn)樣品的衍生反應(yīng)和測(cè)定：分別取步驟（6)處理過的三類樣品各300 μ 1 放入三個(gè)對(duì)應(yīng)的1.5 ml離心管中，然后分別加入步驟（1)中的150 μ 1異硫氰酸苯酯和 150 μ 1三乙胺，混合室溫反應(yīng)一小時(shí)，加600 μ 1正己燒萃取雜質(zhì)，15000 pm/min離心5min 取下層清液，用步驟（2)的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，柱溫40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，洗脫時(shí)間24min，流 速1 ml/min,進(jìn)樣量5 μ 1 ; (8)試驗(yàn)結(jié)果的處理：分別對(duì)血液樣品、肌肉和十二指腸粘膜組織樣品制定谷氨酰胺曲 線色譜圖并得出結(jié)論。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟（1)中衍生化試劑的配制方法為：精 確吸取1220 μ 1異硫氰酸苯酯于100ml容量瓶中，用乙腈溶解進(jìn)行定容，得到所述100mM異 硫氰酸苯酯；精確吸取14. 00 ml三乙胺加入100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到所述 1M三乙胺。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟（2)中流動(dòng)相的配制方法為：將500毫 升超純水和3. 4g無水乙酸鈉用12%乙酸調(diào)節(jié)PH在6. 50,與15 ml乙腈混合，超聲脫氣后備 用得到流動(dòng)相A液；將40 ml乙腈加10 ml超純水混合脫氣備用得到流動(dòng)相B液。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟（4)和步驟（7)中均采用梯度洗脫，流 速為lml/min，流動(dòng)相A液起始柱壓為4. 1MPA，測(cè)完用流動(dòng)相B液小流速洗柱10 min以上。 [0010] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述梯度洗脫時(shí)間依次選取〇.〇lmin、14min、 14. 01min、18min、18. Olmin 和 24min，梯度濃度依次為 0、25、100、100、0。
[0011] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述含20 mgSSA(5-磺基水楊酸)樣品管的制備 方法為：200 g/L SSA溶液(稱取一定數(shù)量SSA，用無水乙醇溶解后，配置成所要求的濃度)， 將上述SSA溶液取0. lml置于1. 0 ml離心管內(nèi)，在50°C下蒸干乙醇后蓋好于室溫下保存。
[0012] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：通過對(duì)肉鴿不同組織及血液進(jìn)行合理 處理，科學(xué)選用衍生化試劑和色譜條件，用高效液相色譜儀能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定肉鴿血液、 肌肉及十二指腸的谷氨酰胺（Gin)含量，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究提供有效的技術(shù)數(shù)據(jù) 支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0014] 圖1是本發(fā)明的梯度程序圖。
[0015] 圖2是本發(fā)明谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0016] 圖3是本發(fā)明谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)液的曲線色譜圖。
[0017] 圖4是本發(fā)明鴿血液樣品中谷氨酰胺的曲線色譜圖。
[0018] 圖5是本發(fā)明鴿肌肉樣品中谷氨酰胺的曲線色譜圖。
[0019] 圖6是本發(fā)明鴿十二指腸樣品中谷氨酰胺的曲線色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0021] 一種測(cè)定肉鴿組織及血液中谷氨酰胺含量的方法，包括以下步驟： (1) 衍生化試劑的配制：分別配制100mM的異硫氰酸苯酯和1M的三乙胺備用； (2) 色譜柱的制備：色譜儀為島津LC-20AT高效液相色譜儀，固定相反相C18柱 (SHIMADZU VP-ODS 5um 150*4. 6mm)，流動(dòng)相 A 液為 50mmol/L 乙酸鈉溶液（PH=6. 50):乙 腈=97 :3,流動(dòng)相B液為乙腈：水=2:1 ; (3) 標(biāo)準(zhǔn)液的制備：取10ml谷氨酰胺（Gin)加入到25 ml容量瓶，用純水溶解定溶，放 入4°C冰箱保存，并逐級(jí)稀釋至3/4、1/2的濃度，2倍濃度現(xiàn)配現(xiàn)用； (4) 標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定結(jié)果處理：將步驟（3)中標(biāo)準(zhǔn)液300 μ 1加入1. 5 ml離 心管中，然后加入步驟（1)中的150 μ 1異硫氰酸苯酯和150 μ 1三乙胺，混合室溫反應(yīng)一 小時(shí)，加600 μ 1正己燒萃取雜質(zhì)，15000 pm/min離心5min取下層清液，用步驟（2)的色譜 柱進(jìn)行測(cè)定，柱溫40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，洗脫時(shí)間24min，流速1 ml/min，進(jìn)樣量5 μ 1 ;制 定標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖； 相關(guān)數(shù)據(jù)如下：

【權(quán)利要求】
1. 肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 衍生化試劑的配制：分別配制lOOmM的異硫氰酸苯酯和1M的三乙胺備用； (2) 色譜柱的制備：色譜儀為島津LC-20AT高效液相色譜儀，固定相反相C18柱 (SHIMADZU VP-ODS 5um 150*4. 6mm)，流動(dòng)相 A 液為 50mmol/L 乙酸鈉溶液（PH=6. 50):乙 腈=97 :3,流動(dòng)相B液為乙腈：水=2:1 ; (3) 標(biāo)準(zhǔn)液的制備：取10ml谷氨酰胺（Gin)加入到25 ml容量瓶，用純水溶解定溶，放 入4°C冰箱保存，并逐級(jí)稀釋至3/4、1/2的濃度，2倍濃度現(xiàn)配現(xiàn)用； (4) 標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定結(jié)果處理：將步驟（3)中標(biāo)準(zhǔn)液300 μ 1加入1. 5 ml離 心管中，然后加入步驟（1)中的150 μ 1異硫氰酸苯酯和150 μ 1三乙胺，混合室溫反應(yīng)一 小時(shí)，加600 μ 1正己燒萃取雜質(zhì)，15000 pm/min離心5min取下層清液，用步驟（2)的色譜 柱進(jìn)行測(cè)定，柱溫40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，洗脫時(shí)間24min，流速1 ml/min，進(jìn)樣量5 μ 1 ;制 定標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖； (5) 取樣：分別從乳鴿血液、胸部肌肉和十二指腸中取樣，具體來講，血液中谷氨酰胺取 樣步驟：乳鴿靜脈采血2ml加入到含肝素的離心管，在轉(zhuǎn)速2800 pm/min溫度4°C下離心 10 min,取0.4ml血液注入到20 mgSSA (5-磺基水楊酸）樣品管中，潤(rùn)旋混合后，迅速在液 氮中冷卻，然后在_80°C保存； 胸部肌肉中谷氨酰胺取樣步驟：乳鴿16 d頸靜脈放血后，腹部毛清理干凈，剝離腹部 皮膚，采集胸部肌肉，用剪刀剪成0. 5 mm塊，放入EP管中，迅速在液氮中冷卻，然后在-80°C 保存待測(cè)； 十二指腸中谷氨酰胺（Gin)取樣步驟：打開乳鴿腹腔，取出十二指腸，放于平皿中，剖 開十二指腸，露出腸粘膜，除去上層腸內(nèi)容物，用手術(shù)刀片刮取腸粘膜層，放入EP管中，迅 速在液氣中冷卻，然后在_80 C保存待測(cè)； (6) 試驗(yàn)樣品的處理：血液樣品的處理：將SSA血液樣品從-80°C取出并在室溫下解凍 后，在3000g (5790RPM) 4°C條件下離心15min，以去除蛋白沉淀，上清液轉(zhuǎn)入樣品管后置于 樣品架于4°C保存?zhèn)溆?；肌肉和十二指腸粘膜組織樣品的處理：肌肉、十二指腸粘膜組織樣 品在-80°C取出，稱取樣品0.2 g，用0.2 ml PBS (磷酸鹽緩沖液)作稀釋液，勻漿器中研磨， 用1.0ml 0.66M冰凍后的高氯酸進(jìn)行勻漿200s，勻漿后的樣品于4°C、RCF為3000g離心 5min，取0.8 ml上清液用0.4ml 0.66M磷酸鉀中和，形成的高氯酸鉀沉淀離心除去（4°CRCF 為3000g離心5min)離心后的上清液在-20°C保存?zhèn)溆茫? (7) 試驗(yàn)樣品的衍生反應(yīng)和測(cè)定：分別取步驟（6)處理過的三類樣品各300 μ 1放入三 個(gè)對(duì)應(yīng)的1.5 ml離心管中，然后分別加入步驟（1)中的150 μ 1異硫氰酸苯酯和150μ1三 乙胺，混合室溫反應(yīng)一小時(shí)，加600 μ 1正己燒萃取雜質(zhì)，15000 pm/min離心5min取下層清 液，用步驟（2)的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，柱溫40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，洗脫時(shí)間24min，流速1 ml/ min,進(jìn)樣量5 μ 1 ; (8) 試驗(yàn)結(jié)果的處理：分別對(duì)血液樣品、肌肉和十二指腸粘膜組織樣品制定谷氨酰胺曲 線色譜圖并得出結(jié)論。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法，其特征在 于：所述步驟（1)中衍生化試劑的配制方法為：精確吸取1220 μ 1異硫氰酸苯酯于100ml容 量瓶中，用乙腈溶解進(jìn)行定容，得到所述lOOmM異硫氰酸苯酯；精確吸取14. 00 ml三乙胺加 入100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到所述1M三乙胺。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法其特征在 于：所述步驟（2)中流動(dòng)相的配制方法為：將500毫升超純水和3. 4g無水乙酸鈉用12%乙 酸調(diào)節(jié)PH在6. 50,與15 ml乙腈混合，超聲脫氣后備用得到流動(dòng)相A液；將40 ml乙腈加 10 ml超純水混合脫氣備用得到流動(dòng)相B液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法，其特征在 于：所述步驟（4)和步驟（7)中均采用梯度洗脫，流速為lml/min，流動(dòng)相A液起始柱壓為 4. 1MPA，測(cè)完用流動(dòng)相B液小流速洗柱10 min以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定肉鴿組織及血液中谷氨酰胺含量的方法，其特征在于： 所述梯度洗脫時(shí)間依次選取〇· Olmin、14min、14. Olmin、18min、18. Olmin和24min，梯度濃 度依次為 0、25、100、100、0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的肉種鴿組織及血清中谷氨酰胺含量的測(cè)定方法，其特征在 于：所述含20 mgSSA (5-磺基水楊酸）樣品管的制備方法為：200 g/L SSA溶液(稱取一定 數(shù)量SSA,用無水乙醇溶解后,配置成所要求的濃度),將上述SSA溶液取0. lml置于1. 0 ml 離心管內(nèi)，在50°C下蒸干乙醇后蓋好于室溫下保存。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104122344SQ201410368495
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】步衛(wèi)東, 黃建國(guó), 王雅蕾, 馬春建 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院